專(zhuān)利名稱(chēng)：以三七二醇組皂苷為有效成分的抗腫瘤藥物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及以三七二醇組皂苷為有效成分的抗腫瘤
藥物，三七二醇組皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三七，又名田七、人參三七，是五加科人參屬植物Panax notoginseng(Burk) F. H. Chen的根莖，是我國(guó)特產(chǎn)的珍貴藥材，主要產(chǎn)于云南、廣西等地。三七總皂苷是三七 的主要活性成分，藥理作用廣泛，如具有抗疲勞、提高耐缺氧能力、降血糖、活血化瘀、提高 機(jī)體免疫功能、清除自由基、抗炎、抗氧化等藥理作用。近年來(lái)對(duì)三七的進(jìn)一步研究表明 三七總皂苷中可分為三七二醇組皂苷(PanaxadialS即onins， PDS))和三七三醇組皂苷 (Panaxtriol saponins, PTS)。到目前為止，有關(guān)三七二醇組皂苷(以三七二醇型皂苷Rbl 為主的從三七中分離提取出的有效部分)具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以三七二醇組皂苷作為有效成分，并提供三七二醇組 皂苷在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的 三七二醇組皂苷作為有效成分抗腫瘤藥物，其特征是含有三七二醇組皂苷作為有 效成分，并含有常規(guī)藥用載體。 三七二醇組皂苷有效成分在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
三七二醇組皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物 組合物含有0. 1-99% ，優(yōu)選為0. 5-90%的本發(fā)明化合物，其余為藥物學(xué)上可接受的，對(duì)人 和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。 所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥 物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物可經(jīng)注 射(靜注、肌注)和口服兩種形式給藥。


圖1是苔盼藍(lán)拒染法檢測(cè)PDS對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響； 圖2是四噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定PDS對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響； 圖3是Western Blot檢測(cè)PDS降低Hela細(xì)胞中Trx蛋白表達(dá)水平； 圖4是Western Blot檢測(cè)PDS降低Hela細(xì)胞中CyclinDl蛋白表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式
下面描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是本發(fā)明的內(nèi)容不局限于此。本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施方式證明了三七二醇組皂苷能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但不僅限于這些實(shí)施例子。
實(shí)施例1 : 三七二醇組皂苷，用少量的匿S0溶解后，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成 注射液。 實(shí)施例2: 三七二醇組皂苷，用少量的匿SO溶解后，將其溶于無(wú)菌注射用水中，攪拌使溶解， 用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌熔封得粉針劑。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用本發(fā)明的試驗(yàn)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明三七二醇
組皂苷的藥理作用結(jié)果，但不以此試驗(yàn)例來(lái)限定本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1 :
1、細(xì)胞 Hela細(xì)胞人宮頸癌細(xì)胞。
2、藥品及主要試劑 三七二醇組皂苷從昆明制藥集團(tuán)股份有限公司獲得，一抗Anti-human Trx由日 本京都大學(xué)淀井溶司教授提供；一抗Anti-human CyclinDl購(gòu)自Santa cruz ;Protein Marker,購(gòu)自Fermentas公司；RPMI Medium 1640，購(gòu)自Invitrogencorporation ;蛋白 質(zhì)定量試劑盒(BCA法)，購(gòu)自Beyotime公司;Chemiluminesentsubstrate，購(gòu)自生物晶 美公司；PVDF膜，購(gòu)自Millipore公司；TRIS Base,購(gòu)自N0V0N公司；Acrylamide，購(gòu)自 Solarbio公司；十二焼基硫酸納，購(gòu)自xiamen sanlandchemicals company limited ;瓊月旨 糖、考馬斯亮藍(lán)R-250、 Aprotimin、 PMSF和NP_40，均購(gòu)自Sanland-chem International InC ;TEMED，購(gòu)自HUALVYUAN BIOTECHNOLOGY ;X射線膠片，購(gòu)自中國(guó)樂(lè)凱膠片集團(tuán)公司； 二抗affinity purified antibodyperoxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L)HSA liquid conjugate禾口affinitypurified antibody peroxidase labled goat anti-rabbit lgG(H+L)HSA liquidconjugate，購(gòu)自美國(guó)Kirkegaard & laboratories ;苔盼藍(lán)(Trypan Blue)，購(gòu)自MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司；四噻唑藍(lán)(MTT)，購(gòu)自美國(guó)Promega公司。
1、主要實(shí)驗(yàn)儀器 BHC-1300II A/B3生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；TS100生物倒置 相差顯微鏡，日本NIKON公司生產(chǎn)；C02培養(yǎng)箱，美國(guó)NBS公司生產(chǎn)；TS-1脫色搖床，金紜市 杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)；電子分析天枰，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；旋渦混 合器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；BYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀，北京六一儀器有 限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司生產(chǎn)；J-25離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)；XJX-IIX射線 攝影暗匣，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠生產(chǎn)；血球計(jì)數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公 司；96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，BiousingBiotechnology有限公司生產(chǎn)。
實(shí)驗(yàn)例2 : 苔盼藍(lán)拒染法測(cè)定Hela細(xì)胞的存活率
( — )Hela細(xì)胞株的培養(yǎng) Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培 養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)基一次，細(xì)胞達(dá)約 70 % 80%融合時(shí)，傳代或用于實(shí)驗(yàn)。
(二)Hela細(xì)胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的Hela細(xì)胞消化起來(lái)，1500rpm離心5min，除去胰酶。將 細(xì)胞均勻的排在直徑6cm的培養(yǎng)皿里，排板密度為IX 105cell/皿，排4板，在含有10%胎 牛血清、100U/mL青霉素和100ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95% 濕度下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。(三)梯度濃度三七二醇組皂苷剌激 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，將四板Hela細(xì)胞做好相應(yīng)的標(biāo)記，對(duì)照 組不加三七二醇組皂苷，實(shí)驗(yàn)組分別用200、400、800iig/ml的濃度三七二醇組皂苷剌激， 24h后收細(xì)胞。(四)苔盼藍(lán)拒染法的活細(xì)胞計(jì)數(shù) 取5 iil的細(xì)胞懸液與5 ill 0. 4%的苔盼藍(lán)均勻混合，小心加到血球計(jì)數(shù)板的小 室里，在倒置顯微鏡下數(shù)活細(xì)胞的數(shù)目。
(五)細(xì)胞的存活率計(jì)算 存活率％ =加藥組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)X 100%
試驗(yàn)例2 : 四噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定Hela細(xì)胞的存活率
( — )Hela細(xì)胞株的培養(yǎng) Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培 養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)基一次，細(xì)胞達(dá)約 70 % 80%融合時(shí)，傳代或用于實(shí)驗(yàn)。
(二)Hela細(xì)胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的Hela細(xì)胞消化起來(lái)，1500rpm離心5min，除去胰酶。將 細(xì)胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1X10、ell/孔，在含有10X胎牛血清、100U/mL青 霉素和100ii g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。(三)梯度濃度三七二醇組皂苷剌激 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，換新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，對(duì)照組不加三七二醇組皂苷，實(shí)驗(yàn)組分 別用200、400、800 ii g/ml的濃度三七二醇組皂苷剌激。各組設(shè)5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
(四)四噻唑藍(lán)(MTT)試驗(yàn) 取出待測(cè)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10ul，繼續(xù)孵育4小時(shí)后， 3000rpm室溫下離心15min，小心去掉上清，每孔加入150ul 二甲基亞砜，小心混勻，用酶標(biāo) 儀在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度值。
(五)細(xì)胞的存活率計(jì)算 存活率％ =加藥組A值/對(duì)照組A值X 100%
實(shí)驗(yàn)例3: 三七二醇組皂苷降低Hela細(xì)胞中Trx和CyclinDl蛋白表達(dá)水平 [OO53]( — )細(xì)胞株培養(yǎng)和三七二醇組皂苷剌激處理 Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 ii g/mL鏈霉素的1640培養(yǎng) 基，于37°C、5% C02和95%濕度下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。每2_3天更換培養(yǎng)基一次，細(xì)胞達(dá)約
570 % 80%融合時(shí)，傳代或用于實(shí)驗(yàn)。 將細(xì)胞接種于平板中，培養(yǎng)過(guò)夜后，三七二醇組組皂苷處理細(xì)胞。分組處理如下 對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組分別加200ug/ml，400ug/ml，800ug/ml的三七二醇組皂苷。上述處 理后，置于37t:和5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，然后收集細(xì)胞，以提取蛋白1500rpm離 心5min收獲細(xì)胞，分別加入100ul細(xì)胞裂解液(150mM NaCl，O. 5% NP_40， 10mM Tris-HCl， pH 7.2，0.1mM PMSF，2ug/ml即rotinin， 200ug/ml NaN3)，充分混懸后于冰浴下放置裂解 50min(中間振蕩5 6次)，4。C下15000rpm離心15min，轉(zhuǎn)上清至新離心管中，-8(TC保存。
( 二 )免疫印跡
1.蛋白含量的測(cè)定 用BCA試劑盒測(cè)定將10ul標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本與200ulWR工作溶液混合，37。C孵 育30min，將反應(yīng)管溫度冷卻至室溫。測(cè)定562nm光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算蛋白濃度。 2.蛋白免疫印跡(Western Blot) 總蛋白加樣量為6ug，與2X SDS凝膠加樣緩沖液混合后，95t:熱變性5min，用15% 的SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白條帶用電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶fC封閉過(guò) 夜；取出PVDF膜，用含0. 1 % Tween-20的TPBS沖洗后，加入1000倍稀釋的一抗室溫孵育 75min ;用含0. 1 % Tween-20的TPBS沖洗，加入5000倍稀釋的二抗室溫孵育75min ;用含 0. 1% Tween-20的TPBS沖洗，將PVDF膜浸入發(fā)光底物溶液中反應(yīng)lmin， X射線膠片曝光。
結(jié)果表明三七二醇組皂苷能抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖l，圖2)，同時(shí)可以降低 Hela細(xì)胞中Trx和CyclinDl的蛋白表達(dá)水平(圖3，圖4)，這說(shuō)明三七二醇組皂苷可用于 腫瘤的防治及治療。 硫氧還蛋白(thioredoxin， Trx)是一種普遍存在于原核生物和真核生物中的小 分子蛋白質(zhì)，它與NAPDH和硫氧還蛋白還原酶組成細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原系統(tǒng)。根據(jù)表達(dá) 部位的不同，硫氧還蛋白分為3類(lèi)Trx-l、 Trx-2和spTrx。到目前為止，人類(lèi)疾病中有關(guān) Trx的研究大都集中在Trx-l。 TRX-1是生物體所必須的基因，如果選擇性地敲除小鼠的 Trx-l基因，小鼠則早期胚胎致死，不能存活(Matsui M. ， Oshima M. ， Oshima H. ， Takaku K. ， Maruyama T. ， Yodoi J. ， and Taketo M.M.Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mousethioredoxin gene. Dev. Biol. 1996，178 :179-185)。 Trx-l是細(xì)胞內(nèi)一種有效的抗氧化劑，能保護(hù)細(xì)胞、減輕氧化應(yīng)激所致的損傷。Trx-l能 抑制p38MAPK和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1相關(guān)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力 (Saito M. ， Nishitoh， H. ， Fujii， M. ， Takeda， K. ， Tobiume， K. ， Sawada， Y. ， Kawabata， M. ， Miyazono， K. ， and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitorof apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1. EMBO，1998，17 :2596-2606 ;Hashimoto S.， Matsumoto K. ， Gon Y. ， Furuichi S. ， Maruoka S. ， Takeshita I. ， Hirota K. ， Yodoi J.， and Horie T. Thioredoxin negatively regulates p38 MAPkinase activation and IL_6 production by tumor necrosis factor—alpha. Biochem. Biophys. Res. Comm皿.1999,258: 443-447.)。與對(duì)照組相比，三七二醇組皂苷能隨劑量的增加降低Hela細(xì)胞中Trx蛋白表達(dá) 水平，由于Trx具有抗凋亡，保護(hù)細(xì)胞的作用，因此三七二醇組皂苷有可能是通過(guò)降低Trx 的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
Cyclin是20世紀(jì)80年代由Hunt等從研究卵母細(xì)胞首先發(fā)現(xiàn)的，之后在其它一些 物種中也發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了 cyclin的存在，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物cyclin有14大類(lèi)，它們可 分為Gl期cyclin和M期cyclin。 Cyclin的表達(dá)具有典型的周期性和時(shí)相特異性，CyclinDl 在細(xì)胞的增殖過(guò)程中起著重要作用，是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)(Tashiro E，Tsuchiya A， Imoto M. Functions of cyclin Dlas an oncogene and regulationof cyclin Dl expression. Cancer Sci， 2007， 98 :629-635.)。很多腫瘤的發(fā)生與cyclinDl的過(guò)表達(dá)有關(guān)Chen CH， Shen J， Lee WJ， Chow SN. overexpression ofcyclin Dl and c—Myc gene products in human primary epithelial ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer, 2005，15 :878—883 ; Lantsov D， Meirmanov S， NakashimaM， Kondo H， Saenko V， Naruke Y， Namba H， Ito M， Abrosimov A， Lushnikov E， Sekine I， Yamashita Sh. Cyclin Dl over—expression in thyroid p即illarymicrocarcinoma :its association with tumour size and aberrant beta—cateninexpression. Histo—pathology，2005，47 :248—256 ;Mega S， Miyamoto M， EbiharaY， Takahashi R， Hase R， Li L， Shichinohe T， Kawarada Y， Uehara H， KanekoH， Hashimoto H， Murakami Y， Itoh T， Morikawa T， Kondo S.Cyclin Dl， E2Flexpression levels are associated with characteristics and prognosis ofesophageal squamous cell carcinoma. Dis Esophagus, 2005， 18 :109-113.)，它還調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb) 的磷酸化狀態(tài)(Diehl JA，Zindy F，Sherr CJ. Inhibition of cyclin Dl phosphorylation on threonine_286 prevents its r即iddegradation via the ubiquitin—proteasome pathway. Genes Dev， 1997， 11 :957-972.)。與對(duì)照組相比，三七二醇組皂苷能隨劑量的增加 降低Hela細(xì)胞中CyclinDl蛋白表達(dá)水平，由于CyclinDl是細(xì)胞周期Gl的調(diào)節(jié)蛋白，因此 三七二醇組皂苷有可能是通過(guò)降低CyclinDl的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
三七二醇組皂苷作為有效成分抗腫瘤藥物，其特征是含有三七二醇組皂苷作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。
2. 三七二醇組皂苷有效成分在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供一種以三七二醇組皂苷為有效成分的抗腫瘤藥物，三七二醇組皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了三七二醇組皂苷具有抗腫瘤活性，苔盼藍(lán)拒染法和四噻唑藍(lán)(MTT)法均表明，三七二醇組皂苷能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；蛋白質(zhì)免疫印跡法表明，三七二醇組皂苷可以降低腫瘤細(xì)胞中硫氧還蛋白和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)水平。
文檔編號(hào)A61K36/258GK101744853SQ20091009509
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者劉曉慧, 白潔 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)