專利名稱：慢病毒載體向腦的遞送的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于遞送至腦用于治療神經(jīng)病的慢病毒載體。所述慢病毒載體通過(guò)利用小口徑遞送裝置(narrow bore delivery device)的連續(xù)輸注直接遞送至腦,與先前的方法相比，其沉積點(diǎn)(deposit point)減少。
背景技術(shù)：
基于病毒的方法已知用于治療多種神經(jīng)病，其經(jīng)過(guò)引入治療基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(tranduce)神經(jīng)元和/或支持細(xì)胞。例如，已經(jīng)研發(fā)了一種多順?lè)醋勇《据d體產(chǎn)品PmSavin ，用于治療帕金森氏病。ProSavin 通過(guò)將芳香L-氨基酸脫羧酶、酪氨酸羥化酶和GTP環(huán)式水解酶I的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至非-多巴胺細(xì)胞中介導(dǎo)紋狀體內(nèi)的多巴胺生成(Azzouz等人，(2002)JNeurosci. 22:10302-10312)。·
之前的慢病毒載體遞送方法已經(jīng)將所述載體引入至腦內(nèi)的特定區(qū)域，其以不連續(xù)的流速經(jīng)過(guò)多次小量沉積，以確保在大區(qū)域充分轉(zhuǎn)導(dǎo)祀細(xì)胞(Azzouz等人，(2002) JNeurosci 22:10302-10312)。例如，ProSav_in'R·使用多個(gè)管道(高達(dá)5個(gè)/半球)使用逐步遞送方法給藥，其包括沿各個(gè)管道多次沉積所述載體(Jarraya等人，(2009)Sci TranslMed 14:1(2)2-4)。該方法要求復(fù)雜的手術(shù)前計(jì)劃以確定插管管道的位置，以及耗時(shí)的手術(shù)，并且出血和其它手術(shù)并發(fā)癥(與使用多插管管道引入所述載體有關(guān))的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，存在對(duì)該慢病毒載體的遞送方法改進(jìn)的需求。已經(jīng)報(bào)道了使用增強(qiáng)對(duì)流輸送(CED)作為遞送治療劑至腦內(nèi)的有效方法，包括磁赤鐵礦納米顆粒、脂質(zhì)體和小的病毒載體，例如腺_相關(guān)的病毒載體(AAV) (Lieberman等人，(1985) J. Neurosurg. 82:1021-1029 ；Bankiewicz 等人，(2000)Exp. Neurol. 164:2-14 ；Cunningham 等人，(2000)Cell Transplant9:585-594 ;Nguyen 等人，(2001)Neuroreport12:1961-1964 ；Mamot 等人，(2004) J Neurooncol. 68:1-9 ；Hadaczek 等人，(2006) Hum. GeneTher 17:291-302 以及 Perlstein 等人，(2008)Neuro-Oncol 10:153-161)。已經(jīng)報(bào)道，使用加壓注入(pressurised infusate),顆粒和大分子經(jīng)過(guò)血管周間隙的分布得以提高,超過(guò)擴(kuò)散自身所能達(dá)到的分布(Chen等人，(2004) J. Neurosurg. 101:314-322以及Hadaczek等人，(2009) Hum. Gene Ther 20:229-237)。CED利用在輸注導(dǎo)管的尖端建立的壓力梯度，其最初產(chǎn)生〃推動(dòng)〃治療劑經(jīng)過(guò)腦細(xì)胞之間的間隙的湍流。盡管已經(jīng)報(bào)道了成功使用CED遞送小的AAV (Bankiewicz等人，(2000) Exp.Neurol. 164:2-14 ;Cunningham 等人，(2000)Cell Transplant 9:585-594 ;以及 Hadaczek等人，(2009) Hum. Gene Ther 20:229-237)，但是這些結(jié)果對(duì)慢病毒載體的遞送影響較小，因?yàn)槟X內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)空間已經(jīng)計(jì)算為介于38和64nm之間(Thorne and Nicholson (2006)PNAS 104 ；5567-5572)，而慢病毒的典型直徑約為lOOnm，典型地比AAV載體大大約4倍(Fields Virology FifthEdition(2007)Eds. Knipe and Howle y. Lippincott Williamsand Wilkins)。AAV載體為無(wú)包膜病毒，其直徑約為18_26nm，并且比計(jì)算的細(xì)胞內(nèi)間隙小得多?？紤]細(xì)胞嗜性(Davidson等人，(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97,PP. 3428-3432 ;Azzouz 等人，(2002) J Neurosci 22:10302-10312 以及 Eschemacher 等人，(2004)Exp Med 90:61-69)是改變載體遞送時(shí)的重要因素，因?yàn)楫?dāng)載體以加速的方式遞送時(shí)，神經(jīng)元或其它細(xì)胞祀點(diǎn)可以明顯缺乏抵抗力(compromised)。此外，當(dāng)改進(jìn)手術(shù)給藥至特異的腦區(qū)域的方法時(shí)，對(duì)中樞載體給藥的相對(duì)免疫應(yīng)答也可被改變。


圖I :給藥50μ L的EIAV-LacZ載體懸浮液后，在非-人靈長(zhǎng)類的豆?fàn)詈藲ぶ械目?β -半乳糖苷酶染色，利用以下方法給藥㈧5針頭管道，用23-號(hào)Hamilton不銹鋼針頭在3點(diǎn)各遞送10 μ L ;⑶單次輸注，以3 μ L/分鐘經(jīng)28-號(hào)石英插管；或(C)輸注50 μ L的TSSM制劑緩沖液，僅經(jīng)過(guò)28-號(hào)石英插管，以I μ L/分鐘。該圖表明了，與已經(jīng)確立的5針頭管道方法(A)(其中載體更大程度被限制在注射管道的附近)相比，在使用單次輸注(B)給藥后，EIAV載體在豆?fàn)詈藲ぶ袃?yōu)異的中外側(cè)和背腹側(cè)擴(kuò)散。高倍圖像顯示出EIAV轉(zhuǎn) 導(dǎo)細(xì)胞的神經(jīng)元形態(tài)學(xué)，其在兩種遞送方法中類似。TSSM緩沖液注射提供了組織學(xué)染色的陰性對(duì)照。圖2 :使用不同的遞送方法給藥50 μ L的EIAV-LacZ載體懸浮液后，使用立體學(xué)方法評(píng)估分布非-人靈長(zhǎng)類的豆?fàn)詈藲ぶ械妮d體的量。該數(shù)據(jù)表明了，與使用23-號(hào)針頭和注射器的5管道遞送方法相比，使用單次輸注經(jīng)28-號(hào)石英插管以I或3 μ L/分鐘之間的恒定流速給藥載體，改善了載體在豆?fàn)詈藲ぶ械姆植肌?μ L/分鐘的較高流速證明了與低流速相比，使用單次輸注產(chǎn)生更大量的載體分布。使用23-號(hào)針頭和注射器的單次輸注的載體遞送產(chǎn)生了比兩種上述方法更低量的載體分布，表明針頭的規(guī)格對(duì)在腦中達(dá)成改善的載體分布是至關(guān)重要的。圖3 :顯示在接受50 μ L的EIAV-LacZ載體懸浮液的切片中的活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的⑶68-陽(yáng)性染色的低倍顯微照片，其使用(A) 5針頭管道，其使用23-號(hào)Hamilton不銹鋼針頭，或⑶經(jīng)28-號(hào)石英插管的單次輸注。該圖表明了對(duì)于兩種遞送方法，炎癥應(yīng)答是局部的并限制在針頭管道的區(qū)域。發(fā)明概述本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，盡管慢病毒載體相對(duì)于細(xì)胞間隙的尺寸，仍可能改進(jìn)多-管道不連續(xù)遞送的方法(ProSavinR'i，增加每管道遞送慢病毒載體的量和輸注的流速，從而反過(guò)來(lái)導(dǎo)致更大量的載體分散在腦內(nèi)。使用基于馬傳染性貧血病毒(EIAV)(其表達(dá)報(bào)道基因β_半乳糖苷酶(EIAV-LacZ))的慢病毒載體，它們顯示單次連續(xù)輸注的該基因改良的慢病毒載體有效地分布在食蟹猴的豆?fàn)詈藲ぶ?。盡管與使用之前公開(kāi)的多重5針頭管道方法手動(dòng)擴(kuò)展載體分布相比，載體分布在豆?fàn)詈藲さ氖孜草S中較少，使用連續(xù)單次輸注方式使得載體分布在中外側(cè)和背腹側(cè)軸優(yōu)于5-管道多次沉積方法。此外，與5-管道多次沉積方法相比，使用單次連續(xù)輸注的載體分布在腦中的總量幾乎大2倍。盡管給藥量增加和給藥流速增加，但是所述連續(xù)輸注系統(tǒng)沒(méi)有在載體擴(kuò)散的區(qū)域產(chǎn)生明顯的神經(jīng)元損傷，而且沒(méi)有損傷血腦屏障的證據(jù)。動(dòng)物未顯示任何明顯毒性或明顯炎癥應(yīng)答的體征，而且未觀察到異常的臨床體征或運(yùn)動(dòng)障礙。這對(duì)相對(duì)大尺寸的慢病毒載體是令人驚訝的。此外，也幾乎沒(méi)有沿著輸注插管的外表面回流的證據(jù)，這先前在使用5-管道方法使用23-號(hào)針頭時(shí)觀察到。上述表明，與它們的大尺寸的預(yù)期不同，不但不需要緩慢、不連續(xù)的(多次沉積)輸注少量，反而大量的慢病毒載體可以利用流體對(duì)流經(jīng)細(xì)胞間的神經(jīng)元基質(zhì)"推入〃，而不導(dǎo)致明顯的組織損傷跡象，并且導(dǎo)致在靶向區(qū)域內(nèi)的優(yōu)異的載體分布。這使得需要用于遞送給定量的注入物的管道數(shù)降低。因此，可被遞送的流速增加和量增加同時(shí)減少手術(shù)時(shí)間和與放置許多插管位點(diǎn)有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，以及允許遞送更大劑量的慢病毒載體。還發(fā)現(xiàn)小號(hào)插管比寬口插管產(chǎn)生更好量的載體分布。認(rèn)為這是由于使用小號(hào)插管減少了回流，以及來(lái)自增強(qiáng)載體分布的更小插管的壓力增加。在壓力下遞送治療劑時(shí)，回流是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，因?yàn)槿绻l(fā)生回流，則大量的載體會(huì)沿插管管道向上損失，而且不會(huì)遞送至靶向區(qū)域?！?br> 因此，在第一方面中，本發(fā)明提供用于遞送至腦用于治療神經(jīng)病的慢病毒載體，其中包含所述慢病毒載體的組合物通過(guò)使用插管的連續(xù)輸注直接遞送至腦，而且其中每管以至少2 μ L/分鐘的流速遞送10-600 μ L之間的所述載體組合物。所述插管可以為足以防止所述載體組合物的實(shí)質(zhì)性回流的小口徑。所述流速可為恒定的或在輸注所述慢病毒載體期間內(nèi)逐漸遞增。所述載體可為馬傳染性貧血病毒(EIAV)載體，例如EIAV載體，其包括編碼酪氨酸羥化酶、GTP-環(huán)式水解酶I和芳香氨基酸多巴脫羧酶的核苷酸序列。所述慢病毒載體可以通過(guò)每半球單個(gè)插管管道遞送。所述輸注可具有大約50 μ L的量。所述載體遞送的流速可以介于2-6 μ L/分鐘，例如大約3 μ L/分鐘。所述慢病毒載體可以使用口徑等于或小于28號(hào)的插管遞送。所述慢病毒載體可以用于治療帕金森氏病。在第二方面，本發(fā)明提供一種在受試者中治療神經(jīng)障礙的方法，該方法包括向受試者給藥上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)定義的慢病毒載體步驟，在該方法中，將包含所述慢病毒載體的組合物通過(guò)使用插管的連續(xù)輸注直接遞送至腦，其中每管以至少2 μ L/分鐘的流速遞送10-600 μ L之間的所述載體組合物。在第三方面，提供了一種當(dāng)直接給予至受試者的腦時(shí)改善慢病毒載體在豆?fàn)詈藲ぶ械姆植剂康姆椒?，其通過(guò)使用插管的連續(xù)輸注，其中每管以至少2 μ L/分鐘的流速遞送10-600 μ L之間的所述載體組合物。在第四方面，提供了用于直接遞送本發(fā)明的第一方面的慢病毒載體至所述受試者的腦的試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)插管。所述插管可以以10-600 μ L之間的量預(yù)先裝滿慢病毒載體組合物。所述試劑盒可以包括一個(gè)或多個(gè)插管用于遞送所述載體，其中所述插管為28號(hào)或更小。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于遞送至腦的慢病毒載體。
慢病毒載體根據(jù)本發(fā)明的慢病毒載體可以來(lái)自或可以衍生自任何合適的慢病毒。重組慢病毒顆粒能夠用感興趣的核苷酸(NOI)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，來(lái)自所述載體顆粒的RNA基因組逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)DNA，并整合至靶細(xì)胞的基因組中。慢病毒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體大組的一部分。慢病毒的詳細(xì)列表可見(jiàn)于Coffin等，(1997) “Retroviruses”Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds:JMCoffin, SMHughes,HE Varmus pp 758-763)。簡(jiǎn)言之，慢病毒可以分為靈長(zhǎng)類和非-靈長(zhǎng)類組。靈長(zhǎng)類慢病毒的實(shí)例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)，人自動(dòng)免疫缺陷綜合征(AIDS)的病原體，以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。所述非-靈長(zhǎng)類慢病毒組包括原型“慢病毒”Visna/Maedi病毒(VMV)，以及有關(guān)的山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)和最近公開(kāi)的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。慢病毒與逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的群體成員之間的區(qū)別在于慢病毒能夠同時(shí)感染分裂 中的和非-分裂中的細(xì)胞(Lewis 等人，(1992)EMBO J 11 (8) :3053-3058)和 Lewis andEmerman (1994) J Virol 68 (I) : 510-516)。不同的是，其它逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如MLV)不能感染非-分裂中的或緩慢分裂的細(xì)胞，例如組成肌肉、大腦、肺和肝臟組織的細(xì)胞。本文所用的慢病毒載體是一種載體，其包括至少一個(gè)來(lái)自慢病毒的組成部分。優(yōu)選地，所述組成部分參與生物機(jī)理，通過(guò)該機(jī)理所述載體感染細(xì)胞，表達(dá)基因或被復(fù)制。逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒基因組的基本結(jié)構(gòu)共享許多共同特征，例如5’LTR和3’LTR，在其之間或之內(nèi)坐落有包裝信號(hào)，使得基因組的包裝、引物結(jié)合位點(diǎn)、整合位點(diǎn)，使得整合至宿主細(xì)胞基因組，以及編碼所述包裝組件(它們?yōu)榻M裝病毒顆粒所需的多肽)的gag、pol和env基因。慢病毒具有其它性質(zhì)，例如在HIV中的rev和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA轉(zhuǎn)錄物從細(xì)胞核有效地輸出至感染的靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。在原病毒中，病毒基因通過(guò)稱為長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的區(qū)域位于兩端的側(cè)面。所述LTR負(fù)責(zé)原病毒整合和轉(zhuǎn)錄。LTR還作為增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列，并且可以控制病毒基因的表達(dá)。LTR自身為相同序列，其可分為三個(gè)元件，稱為U3、R和U5。U3來(lái)自在RNA的3’末端獨(dú)特的序列。R來(lái)自在RNA的兩端重復(fù)的序列，且U5來(lái)自在RNA的5’末端獨(dú)特的序列。三個(gè)元件的大小在不同的病毒之間非常地不同。在缺陷的慢病毒載體中，基因組gag、pol和env可以不存在或不具功能化。在RNA兩端的R區(qū)域?yàn)橹貜?fù)序列。U5和U3代表分別在RNA基因組的5’和3’末端的獨(dú)特的序列。在本發(fā)明典型的慢病毒載體中，至少部分的一個(gè)或多個(gè)對(duì)復(fù)制必須的蛋白編碼區(qū)域可從病毒中除去。這使得病毒載體復(fù)制缺陷。病毒基因組的部分也可被NOI代替，以便產(chǎn)生包括NOI的載體，其能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靶點(diǎn)非-分裂中的宿主細(xì)胞和/或整合其基因組至宿主基因組。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述慢病毒載體為非-整合的載體，如W02007/071994所述。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體能夠遞送沒(méi)有或缺乏病毒RNA的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，異源性結(jié)合區(qū)域(異源的gag)位于待遞送的RNA上，并且gag或pol上的同源結(jié)合區(qū)域可以用于確保待遞送的RNA的包裝。兩種載體均公開(kāi)于WO 2007/072056中。所述慢病毒載體可為“非-靈長(zhǎng)類”載體，即，來(lái)自主要不感染靈長(zhǎng)類，尤其人的病毒。非-靈長(zhǎng)類慢病毒的實(shí)例可為慢病毒家族的任何成員，其天然不感染靈長(zhǎng)類，且可以包括貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、梅-維病毒(MVV)或馬傳染性貧血病毒(EIAV)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病毒載體來(lái)自EIAV。EIAV具有最簡(jiǎn)單的慢病毒幾何結(jié)構(gòu)，并且尤其優(yōu)選用于本發(fā)明。除了 gag、pol和env基因 ，EIAV還編碼三種其它基因tat、rev和 SZ15Tat 作為病毒LTR 的轉(zhuǎn)錄激活劑起作用(Derse and Newbold (1993) Virology194 (2) : 530-536 和 Maury 等人，(1994) Virology 200 (2) : 632-642)，且 Rev 經(jīng)過(guò) rev 反應(yīng)元件(RRE)調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)病毒基因的表達(dá)(Martarano等人(1994) J Virol 68(5) :3102-3111)。認(rèn)為這兩種蛋白的作用機(jī)理大致與靈長(zhǎng)類病毒的相似機(jī)理類似(Martarano等人(1994)JVirol 68(5) :3102-3111)。S2的功能是未知的。另外，EIAV蛋白Ttm已經(jīng)鑒定被tat的第一個(gè)外顯子編碼，剪接為在跨膜蛋白的起點(diǎn)處的env編碼序列。本發(fā)明優(yōu)選的載體為重組慢病毒載體。術(shù)語(yǔ)“重組慢病毒載體”是指具有充分的慢病毒遺傳信息的載體，以允許在包裝組件的存在下，包裝RNA基因組至能夠感染靶細(xì)胞的病毒顆粒中。所述靶細(xì)胞的感染可以包括逆轉(zhuǎn)錄和整合至靶細(xì)胞基因組。所述重組慢病毒載體攜帶非-病毒編碼序列，其待通過(guò)所述載體遞送至靶細(xì)胞。重組慢病毒載體不能在最終靶細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制產(chǎn)生感染性慢病毒顆粒。通常，所述重組慢病毒載體缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或其它復(fù)制必須的基因。本發(fā)明的載體可以裝配為剪接-內(nèi)含子載體。剪接內(nèi)含子載體公開(kāi)在PCT專利申請(qǐng) WO 99/15683 中。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組慢病毒載體具有最小的病毒基因組。本文所用的術(shù)語(yǔ)“最小的病毒基因組”是指所述病毒載體已經(jīng)被處理，以便除去非-必須元件，并保留必須元件以提供感染所需的功能，轉(zhuǎn)導(dǎo)和遞送感興趣的核苷酸序列至靶宿主細(xì)胞。該策略的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在我們的專利WO 98/17815中找到。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體為自身失活的載體。通過(guò)例示的方式，自身失活的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)通過(guò)在3' LTR的U3區(qū)域刪除轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或增強(qiáng)子和啟動(dòng)子構(gòu)建。一輪載體逆轉(zhuǎn)錄和整合后，這些變化復(fù)制到5'和3' LTR 中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄失活的原病毒(Yu 等人，(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:3194-3198 ；Dougherty and Temin 等人，(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1197-1201 ;Hawley (1987)Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2406-2410 和 Yee 等人，(1987) Proc. Natl. Acad.Sci. 91:9564-9568)。然而，在該載體中任何在LTR內(nèi)部的啟動(dòng)子將仍然對(duì)轉(zhuǎn)錄具有活性。該策略已經(jīng)用于消除病毒LTR中的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子對(duì)從內(nèi)部放置的基因的轉(zhuǎn)錄的影響。該影響包括增加轉(zhuǎn)錄(Jolly等人，(1983)Nucleic Acids Res. 11:1855-1872)或抑制轉(zhuǎn)錄(Emerman and Temin(1984)Cell 39:449-467)。該策略也可用于消除從 3' LTR 下游轉(zhuǎn)錄至基因組 DNA (Herman and Coff in (1987) Science 236:845-848)。這在人基因治療中尤其得到關(guān)注，其中防止內(nèi)源性癌基因的偶然激活非常重要。然而，用于在宿主細(xì)胞/包裝細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)病毒基因組的質(zhì)粒載體也可包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制序列，其可操作地連接至所述慢病毒基因組以直接轉(zhuǎn)錄宿主細(xì)胞/包裝細(xì)胞中的基因組。這些調(diào)節(jié)序列可為與轉(zhuǎn)錄的慢病毒序列有關(guān)的天然序列，即所述5’ U3區(qū)域，或它們可為異源性啟動(dòng)子，例如另一病毒啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子。一些慢病毒基因組需要其它序列用于有效的病毒生產(chǎn)。例如，在HIV的情況下，優(yōu)選包括rev和RRE序列。然而對(duì)rev和RRE的需求可以通過(guò)密碼子優(yōu)化而減少或消除。該策略的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在WO 01/79518中找到。也已知執(zhí)行與rev/RRE系統(tǒng)相同功能的備選序列。例如，rev/RRE系統(tǒng)的功能性同源體發(fā)現(xiàn)于Mason Pfizer猴病毒中。其已知為組成性運(yùn)轉(zhuǎn)元件(constitutive transportelement, CTE)并在基因組中包括RRE-型序列，認(rèn)為其與受感染細(xì)胞中的因子相互作用。所述細(xì)胞因子可視為rev同源體。因此，CTE可以用作rev/RRE系統(tǒng)的備選。任何已知的或可以獲得的其他功能性等價(jià)物可以與本發(fā)明有關(guān)。例如，還已知HTLV-I的Rex蛋白可以在功能上代替HIV-I的Rev蛋白。還已知Rev和Rex對(duì)IRE-BP具有相似的作用。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的慢病毒載體由自身失活最小的慢病毒載體組成，其來(lái)自馬傳染性貧血病毒(EIAV)，優(yōu)選地編碼三種包括在多巴胺合成途徑中的酶。該載體編碼的蛋白可包括人酪氨酸羥化酶( Τ)基因(其缺乏TH的反饋性調(diào)節(jié)中包括的N-末端160個(gè)氨基酸)、人芳香L-氨基-酸脫羧酶(AADC)，以及人GTP-環(huán)式水解酶
I(GTP-CHl)基因的截短形式。所述載體可以用三種質(zhì)粒暫時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(例如ΗΕΚ293Τ細(xì)·胞)制備，所述質(zhì)粒編碼(I)重組 EIAV ProSavinji (Oxford BioMedica pic, Oxford UK)載體基因組(pONYKI-0RT,W0 02/29065 和 Farley 等人，(2007) J. Gen. Med. 9:345-356) ； (2)合成的 EIAV gag/pol 表達(dá)載體(pESGPK, WO 01/79518 和 WO 05/29065)以及(3)VSV_G 外殼表達(dá)載體(PHGK)。包裝序列如在本發(fā)明上下文中所用，術(shù)語(yǔ)“包裝信號(hào)”與“包裝序列”或“psi”互換使用，用于表示非-編碼的，順式作用序列，在病毒顆粒形成中，需要其用于包裝慢病毒RNA鏈至殼內(nèi)。在HIV-I中，已經(jīng)定位該序列至從主要剪接供體位點(diǎn)(SD)的上游延伸至至少gag起始密碼子的基因座。本文所用的術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)展的包裝信號(hào)”或“擴(kuò)展的包裝序列”是指使用圍繞psi序列的序列進(jìn)一步擴(kuò)展至gag基因。包含這些其它包裝序列可以增加插入載體RNA至病毒顆粒的效率。假型化(pseudotyping)優(yōu)選地，本發(fā)明的慢病毒載體已經(jīng)被假型化。因此，假型化可以提供一種或多種優(yōu)勢(shì)。例如，使用慢病毒載體，基于HIV的載體的env基因產(chǎn)物將限制這些載體僅感染表達(dá)稱為CD4的蛋白的細(xì)胞。但是，如果這些載體中的env基因已經(jīng)用來(lái)自其它RNA病毒的env序列替換，則它們具有更廣的感染譜(Verma and Somia (1997) Nature 389 (6648) : 239-242)。通過(guò)實(shí)施例的方式，Miller等將MoMLV載體用來(lái)自雙向性逆轉(zhuǎn)錄病毒4070A的外殼假型化(Mol. Cell. Biol. 5:431-437)，其它研究人員已經(jīng)將基于HIV的慢病毒載體用來(lái)自VSV的糖蛋白假型化(Verma and Somia(1997)Nature 389 (6648) : 239-242)。在另一替代方案中，所述Env蛋白可為修飾的Env蛋白，例如突變的或設(shè)計(jì)的Env蛋白?？梢灾圃旎蜻x擇修飾，以引入靶向能力或降低毒性或用于另一目的(Marin等人，(1996) J Virol 70 (5) : 2957-2962 ;Nilson 等人，(1996)Gene Ther 3 (4) : 280-286 ;以及Fielding等人，(1998)Blood 91 (5) : 1802-1809以及其中引用的參考文獻(xiàn))。所述載體可以被假型化，例如用編碼至少部分狂犬病G蛋白或VSV-G蛋白的基因進(jìn)行。VSV-G 水皰性口炎病毒(VSV，一種棒狀病毒)的外殼糖蛋白(G)為已經(jīng)顯示能夠假型化一些逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)的外殼蛋白。其在缺乏任何逆轉(zhuǎn)錄病毒外殼蛋白時(shí)假型化基于MoMLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的能力首次被Emi等人，(1991)J. Virol. 65:1202-1207)公開(kāi)。W094/294440教導(dǎo)了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以成功地用VSV-G假型化。這些假型化的VSV-G載體可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)大范圍的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。最近，Abe等人，(1998) J. Virol 72 (8) : 6356-6361教導(dǎo)了非-感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？梢酝ㄟ^(guò)加入VSV-G引入感染性。Burns 等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037)成功地用 VSV-G將逆轉(zhuǎn)錄病毒MLV假型化，并產(chǎn)生了與MLV的天然形式相比，具有改變的宿主范圍的載體。VSV-G假型化的載體已經(jīng)顯示不僅感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而且感染來(lái)自魚(yú)、爬行動(dòng)物和 昆蟲(chóng)的細(xì)胞系(Burns 等人，(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037)。它們還顯示對(duì)多種細(xì)胞系比常規(guī)的雙向性外殼更有效(Yee等人，(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:9564-9568 和 Emi 等人(1991) J. Virol. 65:1202-1207)。VSV-G 蛋白還可用于假型化一些慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，因?yàn)槠浒|(zhì)尾區(qū)能夠與逆轉(zhuǎn)錄病毒核心相互作用。提供非-慢病毒假型化外殼(例如VSV-G蛋白)得到如下優(yōu)勢(shì)載體顆?？梢詽饪s至高效價(jià)而不喪失感染性(Akkina等人，(1996)J. Virol. 70:2581-2585) ο慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒外殼蛋白明顯不能經(jīng)受住超速離心中的剪切應(yīng)力，可能因?yàn)樗鼈兪怯蓛蓚€(gè)非-共價(jià)鍵連接的亞基組成。亞基之間的相互作用可被離心破壞。與之相比，VSV糖蛋白則由單個(gè)亞基組成。因此，VSV-G蛋白假型化可以提供可能的優(yōu)勢(shì)。WO 00/52188公開(kāi)了由穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系(其具有水泡性口炎病毒-G蛋白(VSV-G)作為與膜相關(guān)的病毒外殼蛋白)生產(chǎn)假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體，并提供了 VSV-G蛋白的基因序列。羅斯可病毒(RossRiver Virus)羅斯河病毒外殼已經(jīng)用于假型化非靈長(zhǎng)類慢病毒載體(FIV)，并在全身給藥后主要轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟(Kang等人，(2002) J Virol 76(18) :9378-9388.)。報(bào)道的效率比使用VSV-G假型化的載體高20倍，并導(dǎo)致較低的毒性，如通過(guò)表明肝毒性的肝臟酶的血清水平所測(cè)量。羅斯河病毒(RRV)是一種通過(guò)蚊子擴(kuò)散的α病毒，其在澳大利亞的熱帶和溫帶地區(qū)具有地方性和流行性。在溫帶海岸地區(qū)的正常人群中的抗體率較低(6%至15%)，雖然在默里山谷河系(Murray Valley River system)的平原中血清流行病學(xué)達(dá)到27至37%。在1979至1980，羅斯河病毒在太平洋群島流行。所述疾病在人之間不具傳染性且并不致命，最初癥狀為在大約半數(shù)患者中的關(guān)節(jié)疼痛伴隨疲勞和嗜睡(Fields Virology FifthEdition(2007)Eds. Knipeand Howley. Lippincott Williams and Wilkins)。桿狀病毒GP64 (Baculovirus GP64)桿狀病毒GP64蛋白已經(jīng)顯示為具有吸引力的VSV-G的替代性蛋白，用于在大規(guī)模生產(chǎn)臨床和商品化應(yīng)用所需的高效價(jià)病毒中所用的病毒載體(Kumar M, Bradow BP,Zimmerberg J (2003) Hum. Gene The r. 14 (I) : 67-77)。與 VSV-G-假型化的載體相比,GP64-假型化的載體具有相似的廣的細(xì)胞向性和相似的天然效價(jià)。因?yàn)?，GP64表達(dá)不會(huì)殺死細(xì)胞，可以產(chǎn)生組成性表達(dá)GP64的基于293T的細(xì)胞系。狂犬病G(Rab is G)在本發(fā)明中，所述載體可以用至少部分狂犬病G蛋白或其突變株、變異株、同源體或片段假型化。對(duì)狂犬病G蛋白以及其突變株的教導(dǎo)可以在WO 99/61639以及Rose等人，(1982) J. Virol. 43:361-364，Hanham 等人，(1993) J. Virol. 67:530-542 ；Tuffereau 等人，(1998)J. Virol. 72:1085-1091, Kucera 等人，(1985)J. Virol. 55:158-162 ；Dietzschold等人，(1983)PNAS 80:70-74 ;Seif 等人，(1985) J. Virol. 53:926-934 ;Coulon 等人，(1998) J. Virol. 72:273-278 ;Tuffereau 等人，(1998) J. Virol. 72:1085-10910 ；Burger等人，(1991) J. Gen. Virol. 72:359-367 ;Gaudin 等人，(1995) J. Virol. 69:5528-5534 ；Benmansour 等人，(1991) J. Virol. 65 :4198-4203 ;Luo 等人，(1998) Microbiol.Immunol. 42:187-193, Coll(1997)Arch. Virol. 142:2089-2097 ；Luo 等人，(1997)VirusRes.51:35-41 ；Luo 等人，(1998)Microbiol. Immunol. 42:187-193 ;Coll (1995)Arch.Virol. 140:827-851 ;Tuchiya 等人，(1992) Virus Res. 25:1-13 ;Morimoto 等人，(1992)Virology 189:203-216 ;Gaudin 等人，(1992)Virology 187:627-632 ;Whitt 等人，(1991)Virology 185:681-688 ;Dietzschold 等人，(1978) J. Gen. Virol. 40:131-139 ；Dietzschold 等人，(1978)Dev. Biol. Stand. 40:45-55 ；Dietzschold 等人，(1977)J. Virol. 23:286-293 以及 Otvos 等人，(1994) Biochim. Biophys. Acta 1224:68-76 中找到。狂犬病G蛋白也公開(kāi)在EP 0445625中。其他被膜可用于假型化慢病毒載體的其它被膜包括Mokola、Ebola、4070A和LCMV(淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)。逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已經(jīng)提出作為在體內(nèi)轉(zhuǎn)移感興趣的核苷酸(NOI)至一個(gè)或多個(gè)感興趣的位點(diǎn)的遞送系統(tǒng)。NOI編碼的表達(dá)產(chǎn)物可為蛋白，其由細(xì)胞分泌?；蛘?，NOI表達(dá)產(chǎn)物并不分泌而且在細(xì)胞內(nèi)具有活性。各種NOI可能預(yù)防性、治療性和/或診斷性地與神經(jīng)障礙有關(guān)。合適的NOI包括，但不限于編碼酶、細(xì)胞因子、炎癥趨化因子、激素、抗體、抗-氧化劑分子、設(shè)計(jì)的免疫球蛋白-樣分子、單鏈抗體、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫調(diào)節(jié)分子、反義RNA、小RNA、shRNA,siRNA、核糖酶、靶蛋白的跨域負(fù)變株、毒素、條件毒素(conditional toxin)、抗原、腫瘤抑制蛋白和生長(zhǎng)因子、膜蛋白、作用于血管的蛋白和肽、抗-病毒蛋白和核糖酶，及其衍生物(例如相關(guān)報(bào)道基)的序列。NOI還可編碼前藥活化酶。在本發(fā)明中，所述NOI可為，例如，合成的RNA/DNA序列、重組RNA/DNA序列(即通過(guò)使用重組DNA技術(shù)制備)、cDNA序列或部分基因組DNA序列。所述NOI可用于治療神經(jīng)變性障礙，例如帕金森氏病。所述NOI可以編碼多巴胺合成或儲(chǔ)存中涉及的酶。例如，所述酶可為以下一種或多種酪氨酸羥化酶(TH)、GTP-環(huán)式水解酶I (GTP-CHl)和/或芳香氨基酸多巴脫羧酶(AADC)。所有三種基因的序列均可獲得登記號(hào)分別為X05290、U19523和M76180。或者，所述NOI可以編碼小泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(VMAT2，登記號(hào)為L(zhǎng)23205. I)。所述病毒基因組可以包括編碼AADC的NOI和編碼VMAT 2的Ν0Ι。該基因組可用于治療帕金森氏病，尤其與外周給藥L-多巴相結(jié)合?；蛘撸鯪OI可以編碼能夠阻斷或抑制黑質(zhì)紋狀體系變性的生長(zhǎng)因子，或其防止TH-陽(yáng)性的神經(jīng)元死亡，或其刺激再生和功能恢復(fù)。例如，所述NOI可以編碼膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、pers印hin生長(zhǎng)因子、artemin生長(zhǎng)因子或neurturin生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4(NT-4)、泛嗜性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、白介素-1β (IL-1 β )、腫瘤壞死因子a (TNF- α)，胰島素生長(zhǎng)因子-2、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C/VEGF-2、VEGF-D、VEGF-E、PDGF-A、H)GF-B、PDFG-A和TOFG-B的雜二聚體和同二聚體，以及其它相關(guān)的或不相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。所述慢病毒載體可以包含編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的這些NOI中的一個(gè)或多個(gè)。所述NOI還可編碼抗-血管生成蛋白，其選自血管生成抑制因子、內(nèi)皮他丁、血小板因子4、色素上皮細(xì)胞源因子(PEDF)、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)刺激素、干擾素- α、干擾素-誘導(dǎo)性蛋白、gro-β和tubedown-Ι、白介素(IL)-I、IL-12、維甲酸、抗-VEGF抗體、適體、反義·oligos、siRNA、凝血酶敏感蛋白、VEGF受體蛋白，例如US 5,952, 199和US 6，100,071中公開(kāi)那些，以及抗-VEGF受體抗體。所述NOI可以編碼所有或部分感興趣的蛋白(“Ρ0Ι”)，或其突變株、同源體或變異株。例如，所述NOI可以編碼POI的片段，其能夠以與野生型蛋白相似的方式在體內(nèi)起作用。其中一種NOI可以包括TH基因的截短的形式，其缺乏調(diào)節(jié)區(qū)。該NOI避免了多巴胺的反饋抑制，其可能限制全長(zhǎng)酶的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“突變株”包括其中包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸由野生型序列變異的Ρ0Ι。例如，突變株可能包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。突變株可以天然出現(xiàn)，或可以人工創(chuàng)造(例如通過(guò)定點(diǎn)誘變)。本文中，術(shù)語(yǔ)“同源體”是指與NOI具有一定同源性的實(shí)體，或其編碼與POI具有一定程度的同源性的蛋白。本文中，術(shù)語(yǔ)“同源性”可以等同于“同一性”。在上下文中，同源序列可以為在氨基酸或核苷酸水平至少75、85或90%等同，或至少95或98%等同于對(duì)象序列。典型地，所述同源體將包括或編碼與對(duì)象序列相同的活性位點(diǎn)等。許多NOI可組合使用。若所述慢病毒載體包括兩種或多種NOI，以使兩種NOI得以表達(dá)，則可能在載體基因組內(nèi)存在兩種或多種轉(zhuǎn)錄單位，每個(gè)NOI —種轉(zhuǎn)錄單位。然而，文獻(xiàn)清楚地表明，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在遺傳學(xué)上保持簡(jiǎn)單時(shí)，它們能達(dá)到最高的效價(jià)和最有效的基因表達(dá)性質(zhì)，因此優(yōu)選使用一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)啟動(dòng)在多順?lè)醋有畔⒅械牡诙?和隨后的)編碼序列的翻譯(Adam等人，1991J. Virol. 65:4985)。該載體的實(shí)例公開(kāi)在WO 02/29605中。藥物組合物本發(fā)明的慢病毒載體可以以藥物組合物的形式提供。所述藥物組合物可以通過(guò)基因治療用于治療個(gè)體，其中所述組合物包含治療有效量的所述慢病毒載體。所述病毒制品可以通過(guò)超速離心濃縮。WO 2009/153563公開(kāi)了下游處理慢病毒載體的方法。所得藥物組合物可以具有至少I(mǎi)O7T. U. /mL，例如IO7至IO9T. U. /mL，或至少I(mǎi)O9T.U. /mL。(效價(jià)表示為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/mL(T. U. /mL)，在HEK293T細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)D17上滴定)。所述藥物組合物可以用于治療人或動(dòng)物,例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物受試者或伴侶動(dòng)物受試者。所述組合物可以任選包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑。藥用載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可以根據(jù)既定給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)制藥實(shí)踐進(jìn)行。除了載體、賦形劑或稀釋劑，所述藥物組合物可以包含任何合適的粘合劑、潤(rùn)滑劑、助懸劑、包衣劑、增溶劑和其它可以幫助或增加所述病毒進(jìn)入靶點(diǎn)(例如脂質(zhì)遞送)的載劑。疾病本發(fā)明中使用的慢病毒載體用于治療神經(jīng)病。例如，所述載體可用于治療和/或·預(yù)防神經(jīng)變性疾病?？梢灾委煹募膊“?，但不限于帕金森氏病；肌萎縮側(cè)索硬化(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病)；亨廷頓舞蹈癥，以及運(yùn)動(dòng)障礙，例如弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)、小腦性共濟(jì)失調(diào)、distonias、重復(fù)性運(yùn)動(dòng)障礙、不寧腿綜合征、顫抖和肌陣攣；阿爾茨海默氏病和皮克??；中風(fēng)；病灶性和全身性或特發(fā)性癲癇；慢性疼痛，包括感覺(jué)異常、背痛和糖尿病神經(jīng)?。荒X腫瘤；慢性疲勞綜合征Areutzfeldt-Jakob病(CJD)和變異的CJD ;腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，包括Tay-Sachs病和威爾遜??；顱內(nèi)壓改變；集束性頭痛和偏頭痛；多發(fā)性硬化；慢性進(jìn)食障礙，包括Prader-Willi障礙；精神分裂癥；情感障礙；躁狂和睡眠障礙，包括睡眠呼吸暫停。尤其是，本發(fā)明有用于治療和/或預(yù)防帕金森氏病。通過(guò)具有能夠遞送例如TH、GTP-CHl和任選的AADC或AADC和VMAT2的載體的基因治療進(jìn)行治療，可能特別有用于ro患者的晚期，其對(duì)L-多巴治療不起顯著響應(yīng)。使用AADC或AADC和VMAT2組合外周給藥L-多巴的治療也可有用于晚期H)患者。給藥用于本發(fā)明的慢病毒載體(例如通過(guò)注射至尾狀殼核)給藥至腦。所述載體可以通過(guò)每半球1、2、3、4、5、6或更多管道給藥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“插管(cannula) ”應(yīng)當(dāng)包括插管、導(dǎo)管(cathethers)、針頭或任何其它用于直接遞送治療劑至腦中的合適的裝置。WO 2008/100930.W0 2008/144585和WO2009/101397公開(kāi)了所述插管，其可被使用。在之前所述的慢病毒載體的給藥系統(tǒng)中(Jarraya等人，(2009) Sci TranslMed14:1 (2)2-4)，所述載體組合物以不連續(xù)或“點(diǎn)式”方式給藥，通過(guò)在管道底部給藥等量部分(4 μ L)，抽出針頭少許，然后給藥第二等量部分(3μ 并進(jìn)一步抽出針頭少許(第二次)；然后給藥第三等量部分(3μ ;因此等量部分已經(jīng)沿著各針頭管道在3點(diǎn)處沉積，遞送共計(jì) 10 μ L0與該系統(tǒng)有關(guān)的缺點(diǎn)包括其非常緩慢和耗費(fèi)勞力，以及由于有5個(gè)針頭管道/半球且每個(gè)管道有3個(gè)給藥位置，因此在各個(gè)半球中存在15個(gè)可能的位置導(dǎo)致組織損傷和炎癥。因此，不可能使用該載體遞送方法增加給予各個(gè)半球的載體劑量，因?yàn)檫@樣顯著增加了手術(shù)時(shí)間。在本發(fā)明的方法中，所述載體可以對(duì)各個(gè)管道在一個(gè)沉積點(diǎn)遞送，且可以經(jīng)各個(gè)管道遞送較大量。在本發(fā)明的方法中，所述載體組合物連續(xù)地輸注。在單點(diǎn)連續(xù)給藥克服了之前系統(tǒng)有關(guān)的上述缺點(diǎn)。使用該方法，可以在實(shí)際的手術(shù)時(shí)間內(nèi)向各個(gè)半球給藥更高劑量的載體。術(shù)語(yǔ)“連續(xù)輸注”是指所述載體組合物的輸注不停止且針頭在遞送期間不移動(dòng)。對(duì)于給定的插管，待遞送的載體組合物 的全部量在單個(gè)沉積點(diǎn)且以一次“推入”的方式給予。在連續(xù)輸注過(guò)程中，所述載體組合物的流速可以實(shí)質(zhì)上恒定，逐漸增加或以逐步方式增加。遞送“直接至腦”是指使用侵入式手術(shù)(例如注射)將所述慢病毒載體直接給予至腦組織。所述慢病毒載體可以遞送至豆?fàn)詈藲?putamen),例如運(yùn)動(dòng)豆?fàn)詈藲?motorputamen)。在遞送過(guò)程中，經(jīng)各個(gè)插管管道遞送的慢病毒載體的量可為10-600 μ L，或每管道可以遞送大約40-200 μ L0對(duì)各個(gè)半球可以使用I至6個(gè)管道。所述載體可以使用足夠小口徑的插管遞送，以防止載體組合物的實(shí)質(zhì)性回流。例如，所述插管可為以下口徑，使得在遞送中或遞送后，少于20%、15%、10%或5%的所述載體組合物沿針頭向上回流。所述載體可以使用具有直徑等于或小于23-號(hào)針頭的出口的插管遞送。所述出口可為大約28-號(hào)。所述裝置可以具有小于23-號(hào)且大于33-號(hào)的出口。所述插管的內(nèi)徑可以小于O. 35,0. 3,0. 35,0. 2或O. 15mm。本發(fā)明還提供一種當(dāng)直接給予至受試者的腦中時(shí)改善慢病毒載體在豆?fàn)詈藲さ闹型鈧?cè)和背腹側(cè)軸分布的方法，所述方法通過(guò)使用對(duì)各個(gè)插管管道連續(xù)輸注遞送所述慢病毒載體。改編現(xiàn)有方法以改善慢病毒載體在豆?fàn)詈藲さ闹型鈧?cè)和背腹側(cè)軸的分布并允許劑量增加，所述改編可以包括以下任一或全部(i)減少每管道的沉積點(diǎn)數(shù)；(ii)使用慢病毒載體組合物的連續(xù)輸注；(iii)在間隙輸注過(guò)程中，創(chuàng)造和/或維持壓力梯度；(iv)使用更高流速；和/或(V)遞送更大量。典型地，慢病毒載體使用插管或其它插入所選受試者的腦組織的注射裝置遞送。當(dāng)遞送ProSavinl于治療帕金森氏病時(shí)，紋狀體為所靶向的合適的腦區(qū)域。其它區(qū)域?qū)⑦m于其它神經(jīng)障礙的治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地確定CNS的哪個(gè)一般區(qū)域?qū)⑦m合靶向?？捎昧Ⅲw定位圖和定位裝置。定位還可通過(guò)使用患者腦部的CT和/或MR成像獲得的解剖學(xué)圖進(jìn)行，以幫助引導(dǎo)所述注射裝置至所選的靶向區(qū)域。流體對(duì)流在之前公開(kāi)的慢病毒載體的給藥系統(tǒng)中(Jarraya等人，(2009)，如上所述)，所述載體組合物通過(guò)擴(kuò)散滲入腦實(shí)質(zhì)。擴(kuò)散取決于所述藥劑的擴(kuò)散率的游離濃度梯度。通過(guò)擴(kuò)散的分散可能導(dǎo)致滲透較差，尤其對(duì)于高分子量藥劑，例如慢病毒載體。治療劑在細(xì)胞外隙內(nèi)的擴(kuò)散對(duì)于確保所述治療劑進(jìn)入靶組織(例如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)是必要的。Thorne 和 Nicholson (Thorne and Nicholson (2006)PNAS 104 ；5567-5572)已經(jīng)確定正常細(xì)胞外隙為38至64nm。他們指出大于IOOnm的納米顆粒遞送系統(tǒng)對(duì)于穿越正常細(xì)胞外隙來(lái)說(shuō)過(guò)大。如上所述，慢病毒載體為基于病毒的納米顆粒遞送系統(tǒng)，其直徑約為lOOnm。在本發(fā)明的方法中，所述慢病毒載體溶液通過(guò)流體對(duì)流分散。間質(zhì)的輸注使用高流速進(jìn)行，本發(fā)明人已經(jīng)證明其極大增強(qiáng)了所述慢病毒載體的分布。在載體的連續(xù)輸注期間，所述流速可以維持在穩(wěn)定狀態(tài)，或者流速可以增加以維持對(duì)流壓力(見(jiàn)下文)。在連續(xù)輸注期間，增加的壓力梯度可，例如，穩(wěn)定地增加或可以遵循變化的過(guò)程，所述過(guò)程特征在于幾個(gè)小的逐步增加的流速。在使用本領(lǐng)域已知的系統(tǒng)(例如程序性滲透、輸注或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它泵)遞送期間，液體壓力可以維持、逐漸增加或變化。在整個(gè)輸注過(guò)程中維持高流速，遞送完整量的載體(例如10至600 μ L)。輸注壓力為流速、慢病毒載體制品的粘度以及插管尺寸的函數(shù)。應(yīng)該選擇輸注壓力，以便提供充分的壓力梯度以增強(qiáng)慢病毒載體的分布，但是不足以a)對(duì)給藥部位周圍的組織造成顯著損傷；和/或b)導(dǎo)致“回流”和溶液滲漏至插管管道外。在本發(fā)明的方法中，所述慢病毒載體可以以至少I(mǎi). O μ L/分鐘、I. 5 μ L/分鐘或
2μ L/ 分鐘，或 1-2 μ L/ 分鐘、1-3 μ L/ 分鐘、2-6 μ L/ 分鐘、2-4 μ L/ 分鐘或 2. 5-3. 5 μ L/ 分鐘的流速輸注至腦內(nèi)。所述慢病毒載體可以以大約3 μ L/分鐘的流速輸注至腦內(nèi)。在輸注期間，所述對(duì)流壓力(其為輸注壓力與顱內(nèi)壓力之差)可以隨遞送的總量增加而降低。為了維持對(duì)流壓力，所述流速可以在給藥期間穩(wěn)定地增加。如果應(yīng)用所述系 統(tǒng)，上一段中提到的流速可以代表開(kāi)始流速。試劑盒本發(fā)明還提供直接遞送慢病毒載體至受試者的腦內(nèi)的試劑盒，其包括I至12個(gè)插管。插管可以重復(fù)用于各個(gè)患者的多個(gè)管道，或者新的插管可以用于各個(gè)管道。所述載體可以例如使用插管或?qū)Ч芑蜥橆^(例如Hamilton針頭)遞送。本文所用的術(shù)語(yǔ)插管應(yīng)當(dāng)包括插管、導(dǎo)管、針頭或用于直接遞送治療劑至腦內(nèi)的任何其它合適的裝置。WO 2008/100930、WO 2008/144585 和 W02009/101397 公開(kāi)了可以使用的所述插管。所述插管可以預(yù)先裝滿所述慢病毒載體組合物。在腦中定位之前可以預(yù)處理所述插管。所述遞送裝置可以例如為不銹鋼的28-號(hào)Hamilton注射器或石英的28-號(hào)輸注插管。如果所述試劑盒用于每半球應(yīng)用I個(gè)遞送管道的方法，則所述插管可以，例如，能夠遞送大約 40μ L、100y L、150y L、200y L、300y L、400y L、500y L 或 600μ L 之間的所述
慢病毒載體。如果所述試劑盒用于每半球應(yīng)用2個(gè)遞送管道的方法，則所述試劑盒可以包括4個(gè)插管?；蛘撸瑔蝹€(gè)插管可以重復(fù)用于各個(gè)管道，或者I個(gè)插管可以用于遞送載體至各個(gè)半球，在該情況下，其將被裝滿所述慢病毒載體組合物，并在每次插入靶向區(qū)域之前經(jīng)預(yù)處理。所述插管還可以預(yù)連接或適于連接至輸注裝置，例如上述泵?；蛘撸霾骞芸梢越雍现烈阎南到y(tǒng)(例如注射器)用于載體給藥，其通過(guò)微泵控制，例如World PrecisionInstruments銷售的微泵,或微量注射器系統(tǒng)(Kopf, USA)。該遞送系統(tǒng)可以適于與立體定位框一起使用。
在本發(fā)明的另一方面，與本發(fā)明的方法結(jié)合使用的小口徑遞送裝置可以植入受試者內(nèi)，以維持從至少幾小時(shí)至數(shù)天或更久的實(shí)際時(shí)期，因此允許載體的輸注發(fā)生在手術(shù)室之外。可能需要該裝置具有足夠彈性，使其能夠使用固定裝置固定從而防止脫離靶位的運(yùn)動(dòng)，而不損壞所述插管輸注系統(tǒng)。還需要可以成像該裝置，以確定在腦內(nèi)的位置和確保所述導(dǎo)管在任意點(diǎn)不脫離所述靶位。適于用于本發(fā)明的小口徑遞送裝置可以在末端(輸注端)具有足夠小的直徑，以最小化局部組織外傷，并具有非常小的無(wú)效腔但具有較大導(dǎo)管的強(qiáng)度以防止斷裂并允許固定，并且具有通過(guò)成像顯影所述導(dǎo)管的能力。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，存在許多小口徑遞送裝置適合用于本發(fā)明(例如，參見(jiàn)WO 2007/044023中所述的遞送裝置)。本發(fā)明的小口徑輸注裝置任選地接合至受試者的頭部?？赡艿墓潭ǚ椒ò?，但不限于，用金屬板(例如鈦板)固定至鉆孔附近的頭骨，用鉆孔內(nèi)放置的塑料封蓋系統(tǒng)固定，或經(jīng)頭皮外在化(externalization)并縫合引導(dǎo)導(dǎo)管至頭皮。 所述試劑盒還可包含用于保存和/或使用的說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明現(xiàn)將通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步公開(kāi)，其旨在協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，并非打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例I :a)常規(guī)遞送和b)使用單點(diǎn)和高流速遞送后，慢病毒載體在豆?fàn)詈藲ぶ械姆植急容^使用之前公開(kāi)的技術(shù)(使用Hamilton注射器和23-號(hào)針頭經(jīng)5針頭管道給藥50 μ L總量的載體至豆?fàn)詈藲ぃ鞴艿肋f送10 μ L管道(經(jīng)三次沉積))給藥EIAV-LacZ載體懸浮液，提供了在豆?fàn)詈藲さ谋掣箓?cè)軸中適度的載體擴(kuò)散，其到達(dá)腦結(jié)構(gòu)的40至50%深度(圖I)。載體在中外側(cè)軸中的擴(kuò)散極其少于在背腹側(cè)軸中的擴(kuò)散，且所述載體僅在最大點(diǎn)擴(kuò)散約1-2_。然而，由于5個(gè)針頭管道沿著豆?fàn)詈藲さ妮S定位，因此載體沿著首尾軸同時(shí)在兩個(gè)通過(guò)該方式遞送載體的半球中擴(kuò)散約7. 8mm。不同的是，與5管道用藥法相比，使用本發(fā)明的方法(經(jīng)23-號(hào)針頭和Hami I ton注射器或使用28-號(hào)石英插管以I或3 μ L/分鐘在I個(gè)點(diǎn)輸注總計(jì)50 μ L載體懸浮液至豆?fàn)詈藲?產(chǎn)生了載體在中外側(cè)和背腹側(cè)軸中改善的擴(kuò)散，且使用28-號(hào)插管以I或3μ L/分鐘流速觀察到最大程度的擴(kuò)散。載體遞送50 μ L載體(使用單管道28-號(hào)插管裝置遞送)產(chǎn)生與兩個(gè)流速的5管道方式相似的首尾擴(kuò)散(28-號(hào)插管為6. 2-8. 6mm擴(kuò)散，且5管道和不連續(xù)流速為7. 8mm擴(kuò)散)。使用23-號(hào)針頭和Hamilton注射器的單次輸注觀察到較少的首尾擴(kuò)散(5. 0-6. 2mm擴(kuò)散)。當(dāng)比較載體分布的總量時(shí)，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)使用23-號(hào)遞送裝置單次給藥50 μ L載體少于5-管道遞送方法。更令人驚訝地，所述28-號(hào)遞送裝置達(dá)到比5-管道方法更大量的載體分布超過(guò)較高流速的量的兩倍。認(rèn)為量的增加至少部分歸因于使用該小口徑遞送裝置時(shí)，載體沿著針頭管道的回流減少。
總之，當(dāng)使用28-號(hào)插管進(jìn)行單次輸注時(shí)，這些觀察符合載體從所述裝置的頂部均勻擴(kuò)散。相反，使用23-號(hào)針頭和注射器的5管道遞送方法和較小程度的單次輸注，載體的分布更多地限制在針頭管道附近的區(qū)域。在所有組的輸注中，并無(wú)跡象表明損傷周圍神經(jīng)元組織或破壞血腦屏障。也評(píng)估了 33-號(hào)塑料插管，但認(rèn)為其太柔軟不宜用于可能促使外科醫(yī)生無(wú)法在豆?fàn)詈藲さ恼_位置放置插管的常規(guī)手術(shù)。使用兩種流速(I或3 μ L/分鐘)，所述28-號(hào)石英插管產(chǎn)生了相似的載體擴(kuò)散。較小號(hào)的28-號(hào)插管產(chǎn)生了比23-號(hào)Hamilton針頭少的疤痕。不 論哪種遞送方式均有相似數(shù)量的細(xì)胞(>90%)同時(shí)染色了 β-半乳糖苷酶和NeuN，證明了在所有情況下載體對(duì)神經(jīng)元的靶向。在該研究中通過(guò)組織學(xué)評(píng)估炎癥標(biāo)記⑶4和⑶8 (T-細(xì)胞)核⑶68 (活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)，評(píng)價(jià)了對(duì)輸注EIAV-LacZ載體的局部炎癥應(yīng)答。對(duì)于所有的遞送方法和注射裝置，在針頭管道的附近觀察到各種標(biāo)記的正染色，然而，僅觀察到非常少的與載體有關(guān)的炎癥應(yīng)答，而且在給藥方法之間沒(méi)有區(qū)別。該結(jié)果表明不存在與使用單次輸注以較高流速遞送載體有關(guān)的炎癥應(yīng)答增加。在任一研究動(dòng)物中均未觀察到載體給藥的明顯毒性或異常臨床體征。動(dòng)物未顯示任何異常運(yùn)動(dòng)活動(dòng)或行為，并且觀察到動(dòng)物進(jìn)食正常。表I.使用不同載體遞送參數(shù)的載體分布的概況

權(quán)利要求
1.用于遞送至腦治療神經(jīng)病的慢病毒載體，其中通過(guò)利用插管的連續(xù)輸注將包含該慢病毒載體的組合物直接遞送至腦，并且其中每管以至少2 μ L/分鐘的流速遞送10-600 μ L之間的所述載體組合物。
2.權(quán)利要求I的慢病毒載體，其中所述插管具有足以防止所述載體組合物的實(shí)質(zhì)性回流的小口徑。
3.權(quán)利要求I或2的慢病毒載體，其中在輸注所述慢病毒載體期間保持恒定流速。
4.權(quán)利要求I或2的慢病毒載體，其中在輸注所述慢病毒載體期間增加流速。
5.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的慢病毒載體,其為馬傳染性貧血病毒(EIAV)載體。
6.權(quán)利要求5的EIAV載體，其包括編碼酪氨酸羥化酶、GTP-環(huán)式水解酶I和芳香氨基酸多巴脫羧酶的核苷酸序列。
7.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的慢病毒載體，其中所述慢病毒載體通過(guò)每個(gè)半球一個(gè)管道遞送。
8.權(quán)利要求7的慢病毒載體，其中所述輸注量為大約50μ L0
9.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的慢病毒載體，其中所述載體遞送的流速介于2-4μ L/分鐘。
10.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的慢病毒載體，其中所述載體遞送的流速為大約3μ L/分鐘。
11.上述權(quán)要求中任一項(xiàng)的慢病毒載體，其中使用口徑等于或小于28號(hào)的插管遞送所述慢病毒載體。
12.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的慢病毒載體，用于治療帕金森氏病。
13.一種在受試者中治療神經(jīng)障礙的方法，所述方法包括向所述受試者給藥上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)定義的慢病毒載體的步驟，在該方法中通過(guò)使用插管的連續(xù)輸注將包含該慢病毒載體的組合物直接遞送至腦，并且其中每管以至少2 μ L/分鐘的流速遞送10-600 μ L之間的所述載體組合物。
14.一種當(dāng)直接給藥受試者的腦時(shí)改善慢病毒載體在豆?fàn)詈藲ぶ械姆植剂康姆椒ǎ渲兴龇椒òㄊ褂貌骞苓B續(xù)輸注包含載體的組合物，其中每管道以至少2 μ L/分鐘的流速遞送10-600 μ L之間的所述載體組合物。
15.試劑盒，其用于直接遞送權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)定義的慢病毒載體至受試者的腦，其包括一個(gè)或多個(gè)插管。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述插管預(yù)先裝滿量為10至600μ L之間的所述慢病毒載體。
17.權(quán)利要求15或16的試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)用于遞送所述載體的插管，其中所述插管為28號(hào)或更小。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于遞送至腦用于治療神經(jīng)病的慢病毒載體，其中所述慢病毒載體通過(guò)將所述慢病毒載體經(jīng)由每半球六管道或更少、以每管道一個(gè)沉淀點(diǎn)的方式直接遞送至腦。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102946907SQ201180026401
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者P.威多森, S.拉爾夫, K.米特羅法諾斯 申請(qǐng)人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國(guó))有限公司