專利名稱：分子量可控聚l-谷氨酸制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于ニ環(huán)己胺引發(fā)N-羧酸酐(N-carboxyanhydride,簡(jiǎn)稱NCA)開環(huán)聚合，采用新型——三甲基碘硅烷脫保護(hù)劑等，去芐基，獲得分子量可控的聚L-谷氨酸的制備方法，該制備方法屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新一類可降解材料——聚氨基酸材料應(yīng)運(yùn)而生，成為研究熱點(diǎn)。聚氨基酸的氨基酸単體單元是用酰胺鍵(氨基和羧基脫去小分子水)連接的。聚氨基酸作為醫(yī)用材料具有明顯優(yōu)點(diǎn)其在體內(nèi)可降解生成簡(jiǎn)單的a-氨基酸，降解產(chǎn)物無毒性。聚氨基酸是ー種重要的生物材料，它們被廣泛地應(yīng)用于載藥、生物組織工程和傳感器等領(lǐng)域。聚L-谷氨酸是ー種良好的聚氨基酸材料。其分子鏈上分布著大量的游離羧基，易于用藥物來修飾，從而用于特殊藥物的載體。由于其具有ー些特殊的性質(zhì)，如手性、多肽鏈獨(dú)特的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示出與細(xì)胞良好的生物相容性，且其在體內(nèi)能夠自行降解成氨基酸單體，降解產(chǎn)物能被機(jī)體吸收和排泄，不會(huì)在體內(nèi)積蓄并產(chǎn)生毒副作用，不用再經(jīng)手術(shù)除去，已被廣泛應(yīng)用于藥物緩釋和生物組織工程領(lǐng)域。目前聚谷氨酸的制備主要有化學(xué)合成法(也稱NCA法)[Chem. Ber. , 1906, 39:857 861]、提取法[專利ー種Y —聚谷氨酸的高效提取方法.申請(qǐng)?zhí)?01010608782]和微生物聚合法[Troy FA. Chemistry and biosynthesis of the poly ( Y -D-glutamyl)capsule in bacillus lichenoformis [J]. J Biol Chem, 1973, 248:305 315],提取法的エ藝十分復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高；微生物聚合法中培養(yǎng)基的配制受到各種因素的制約，因而生產(chǎn)エ藝也比較繁瑣，并且所得到的聚Y -谷氨酸分子量在100萬以上，不適合于在生物醫(yī)藥和組織工程領(lǐng)域應(yīng)用；而NCA法是肽類合成的重要方法，它可以控制調(diào)節(jié)聚合物的分子星[E. Katchalskl. “Advance in Protein Chemistry, ” [M」Vol. VI. Academic Press,Inc, New York, N. Y. 1951: 123 185]。對(duì)于聚L-谷氨酸(PLGA)的化學(xué)合成，目前文獻(xiàn)中使用的引發(fā)劑主要是三こ胺，脫保護(hù)時(shí)所采用的方法主要是酸法[E. R. BL0U. High Molecular WeightPoIy-a，L—glutamic Acid: Preparation and Optical Rotation Changes.Vol. 80，4630-4634]、堿法[Willy Agut et al. Langmuir 2007，23，11526-11533]或 Pd/C催化法[Peter Dubruel et al. Biomacromolecules. 2003，4，1168-1176]。目前化學(xué)法合成的聚L-谷氨酸最突出的問題是合成條件苛刻(需在手套箱中操作)，而且用酸法和堿法脫保護(hù)時(shí)，聚合物分子鏈容易斷裂，而Pd/C催化法脫保護(hù)則耗時(shí)耗能，且成本較高，產(chǎn)率低，聚合物分子量不易控制[Adv. Polym. Sci. 2006, 202, 1-18]。本發(fā)明g在開發(fā)出一種新的合成聚L-谷氨酸的引發(fā)劑和脫保護(hù)劑，不僅使聚L-谷氨酸分子量容易控制，而且脫保護(hù)時(shí)不易斷鏈，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)批量合成，產(chǎn)率高，一次試驗(yàn)可合成聚L-谷氨酸量較多，可達(dá)幾十克，從而使聚L-谷氨酸在生物醫(yī)藥和組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種易于控制聚L-谷氨酸(Poly(L-glutamic acid),簡(jiǎn)稱PLGA)分子量的引發(fā)劑，在常壓下采用新型脫保護(hù)劑——三甲基碘硅烷脫去聚L-谷氨酸-Y -節(jié)酯(Poly ( y -benzyl-L-glutamate),簡(jiǎn)稱PBLG)上的節(jié)基,避免聚合物分子鏈斷鏈，能夠獲得不同分子量的聚L-谷氨酸，以滿足其在生物醫(yī)藥及組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。根據(jù)的反應(yīng)機(jī)理可結(jié)合附圖(1)，其中1) Y-芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(y -benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride,簡(jiǎn)稱BLG-NCA)合成的反應(yīng)機(jī)理或過程；2)以ニ環(huán)己胺為引發(fā)劑聚合得到聚L-谷氨酸-Y-芐酯制備過程。然后采用三甲基碘硅烷脫去聚L-谷氨酸-Y-芐酯上的芐基制備聚L-谷氨酸。 據(jù)反應(yīng)機(jī)理，可采用如下技術(shù)實(shí)施方案，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)實(shí)現(xiàn)ニ環(huán)己胺引發(fā)N-羧酸酐(N-carboxyanhydride,簡(jiǎn)稱NCA)開環(huán)聚合,可得到分子量可控的聚L-谷氨酸產(chǎn)物，其中包括ニ環(huán)己胺引發(fā)Y -芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐聚合，繼而制備聚L-谷氨酸-Y -芐酯，后采用三甲基碘硅烷，脫去聚L-谷氨酸-Y-芐酯上的芐基。獲取了分子量可控的聚L-谷氨酸。其中有兩個(gè)過程
A. ニ環(huán)己胺引發(fā)Y-芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐制備聚L-谷氨酸-Y-芐酷
(I)在金屬鈉存在的條件下，減壓蒸餾ニ環(huán)己胺，以除去ニ環(huán)己胺中殘留的水分，并將其在無水、無氧條件下儲(chǔ)存。(2)在干燥的反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入BLG-NCA，抽真空，充氮?dú)?，反?fù)三次，再注入溶劑ニ氧六環(huán)；待其充分溶解后注入引發(fā)劑ニ環(huán)己胺，単體BLG-NCA與引發(fā)劑的摩爾比，即M/I為M/I在50:1到200:1之間，攪拌均勻后，置于低溫恒溫槽中，溫度控制在15-20°C，至反應(yīng)液變?yōu)檎吵硪?，將反?yīng)液緩慢倒入無水こ醇中沉淀，此時(shí)有白色纖維狀物質(zhì)析出，經(jīng)過濾，真空干燥，得白色纖維狀聚合物，即為PBLG。B.采用三甲基碘硅烷脫去PBLG上的芐基制備聚L-谷氨酸(PLGA):將PBLG溶于新蒸的ニ氯甲烷中，再按I克PBLG加入0. 3-0. 4毫升的三甲基碘硅烷的比例，將三甲基碘硅烷倒入反應(yīng)器，并攪拌，在40-50°C溫度下反應(yīng)8-12小吋，將反應(yīng)液倒入水飽和的正己烷中沉淀，抽濾，并用無水こ醚和大量去離子水沖洗數(shù)遍后，干燥可得白色塊狀產(chǎn)物，即為PLGA0上述步驟B中，所用的単體BLG-NCA與引發(fā)劑ニ環(huán)己胺的摩爾比，即M/I (M-単體BLG-NCA, I-引發(fā)劑ニ環(huán)己胺)分別為 50:1，100:1，150:1 和 200:1
上述方法中，控制單體BLG-NCA與引發(fā)劑ニ環(huán)己胺的摩爾比，所合成的聚L-谷氨酸的分子量在I. 2-5. OX IO4之間。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下突出優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法中使用ニ環(huán)己胺作引發(fā)齊IJ，ニ氧六環(huán)作溶劑，可通過調(diào)節(jié)M/I比值，以制備不同分子量的PBLG ;使用三甲基碘硅烷作為PBLG上芐基的脫保護(hù)劑，不會(huì)導(dǎo)致聚合物分子斷鏈，可利于進(jìn)一歩制得不同分子量的PLGA。如上所述，本發(fā)明以L-谷氨酸為原料，合成了 BLG-NCA，并以其為單體，優(yōu)化選擇溶齊U、引發(fā)劑和脫保護(hù)劑，合成了不同分子量的PBLG。又在常壓下，采用脫保護(hù)劑三甲基碘硅烷脫去芐基，得到幾乎無分子斷鏈的不同分子量的PLGA。
所得聚合物用凝膠滲透色譜(GPC)、傅里葉紅外光譜(FT-IR)、核磁共振氫譜(1H-NMR).粘度法等手段進(jìn)行了表征，產(chǎn)品的相關(guān)結(jié)構(gòu)和分子量都得到了證實(shí)。


圖I制備聚L-谷氨酸-Y-芐酯或聚L-谷氨酸前驅(qū)工作的反應(yīng)機(jī)理1) Y-芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(Y -benzyl-L-glutamate N-carboxyanhydride,簡(jiǎn)稱 BLG-NCA)合成的反應(yīng)機(jī)理或過程；2)以ニ環(huán)己胺為引發(fā)劑聚合得到聚L-谷氨酸-Y-芐酯制備過程。
圖2以ニ環(huán)己胺為引發(fā)劑聚合得到的PBLG的GPC譜圖與GPC測(cè)試結(jié)果包括數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和分子量分布(Mw/Mn)等若干參數(shù)。圖3在實(shí)施例一、ニ、三和四中，PLGA分子量對(duì)M/I所作的圖。圖4 PBLG與PLGA的傅里葉紅外光譜(FT-IR)圖比較。圖5 PBLG的1H-NMR譜圖，其中a, b , c, f, g, h, i, j是上圖示分子式的1H
位譜線。圖6 PLGA 的1H-NMR 譜圖，其中a，b , c, d, e, f, g, h, i, j 是上圖示分子
式的1H位譜線。圖7 三種脫保護(hù)方法，脫去芐基后PLGA分子量比較含采用三甲基硅碘烷(Me3SiI)脫保護(hù)后的PLGA分子量，明顯高于酸法(HBr)和堿法(NaOH)脫保護(hù)后脫去芐基后的PLGA分子量，第一峰位值即為三甲基硅碘烷(Me3SiI)脫保護(hù)PLGA分子量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
I.Y -芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG-NCA)的合成
A.L-谷氨酸-Y-芐基酯(BLG)的合成在三ロ燒瓶中加入IOOg L-谷氨酸和83ml苯甲醇，將三ロ燒瓶置于60-80°C油浴中攪拌，當(dāng)溫度恒定吋，緩慢滴加60%濃硫酸80ml，待反應(yīng)液澄清后，停止攪拌和加熱。待其冷卻至室溫后，將反應(yīng)液緩慢倒入800ml溶有108g碳酸氫鈉的過飽和冰水溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓湃氡鋬?nèi)冷凍3-4小時(shí)。抽濾后得到的濾餅用1200ml 80°C的蒸餾水溶解，然后自然冷卻至室溫，再冷凍3小時(shí)左右，抽濾，濾餅用蒸餾水和こ醇分別清洗三次，室溫真空干燥24小時(shí)，得到白色鱗片狀物質(zhì)即為BLG。B.在干燥的250ml兩ロ燒瓶?jī)?nèi)加入IOg新制備的BLG和IOOml新蒸的四氫呋喃，將燒瓶置于50°C的集熱式攪拌器中，反復(fù)進(jìn)行三次抽真空-通氮?dú)?，?dāng)溫度恒定吋，加入
5.5g用氯仿重結(jié)晶過的雙(三氯甲基)碳酸酯(俗稱“三光氣”)，至反應(yīng)液變澄清，停止攪拌和加熱。自然冷卻至室溫后，在強(qiáng)烈攪拌下，將反應(yīng)液倒入500ml冰凍的石油醚中沉淀，過濾，得白色晶體為BLG-NCA初產(chǎn)品。將所得初產(chǎn)品溶于IOOmlこ酸こ酯中，然后加入等體積的新蒸石油醚進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，濾餅用50mlこ酸こ酯溶解后加入50ml左右石油醚進(jìn)行重結(jié)晶，如此反復(fù)重結(jié)晶三次后得到聚合級(jí)単體，室溫下真空干燥12h，得到白色針狀晶體即為BLG-NCA，產(chǎn)率約為70%。2. ニ環(huán)己胺引發(fā)BLG-NCA制備聚L-谷氨酸-Y _芐酯(PBLG)
在烘干的反應(yīng)瓶?jī)?nèi)放入Ig Y -芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐単體，抽真空通氮?dú)?，反?fù)進(jìn)行三遍，注入15ml新蒸的ニ氧六環(huán)，單體溶解后注入計(jì)量(與單體的摩爾比為50:1)的處理過的ニ環(huán)己胺，混合均勻后室溫靜置3天，反應(yīng)液變得十分粘稠。在強(qiáng)烈攪拌下，將此反應(yīng)液倒入過量的無水こ醇中，此時(shí)有大量白色纖維狀物質(zhì)析出。經(jīng)過濾后，真空干燥24h，所得聚合物即為PBLG。3.采用三甲基碘硅烷脫去PBLG上的芐基制備聚L-谷氨酸(PLGA)
室溫下，取新制備的PBLG溶于新蒸的ニ氯甲烷中，再按IgPBLG加入0. 3-0. 4ml三甲基碘硅烷溶液的比例加入三甲基碘硅烷(或與之具有類似結(jié)構(gòu)的三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)，置于35-45°C集熱式攪拌器中恒溫10-12h，待其自然冷卻后，將反應(yīng)液緩慢倒入無正己烷中沉淀，過濾并反復(fù)用石油 醚和蒸餾水分別洗滌三遍，真空干燥24h，得到白色塊狀物質(zhì)，即為PLGA，分子量約為I. 2 X 104，轉(zhuǎn)化率約為65%。實(shí)施例ニ 本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，所不同的是單體與ニ環(huán)己胺的摩爾比為100:1，在步驟3中，所用的三甲基碘硅烷(或與之同類結(jié)構(gòu)三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)，加入量不變。最終可得到分子量為2. 5 X IO4左右的PLGA，轉(zhuǎn)化率約為70%。實(shí)施例三本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，所不同的是單體與ニ環(huán)己胺的摩爾比為150:1。在步驟3中，所用的三甲基碘硅烷(或與之同類結(jié)構(gòu)三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)加入量不變。最終可得到分子量為3. 5 X IO4左右的PLGA，轉(zhuǎn)化率約為78%。實(shí)施例四本實(shí)施例與實(shí)施例一基本相同，所不同的是單體與ニ環(huán)己胺的摩爾比為200:1。在步驟3中，所用的三甲基碘硅烷(或與之同類結(jié)構(gòu)三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷)加入量不變。最終可得到分子量為5. OX IO4左右的PLGA，轉(zhuǎn)化率約為70%。圖3——反映在上面所述實(shí)施例一、ニ、三和四中，PLGA分子量對(duì)M/I所作的圖。
權(quán)利要求
1.一種基于引發(fā)劑使N-羧酸酐(N-carboxyanhydride,簡(jiǎn)稱NCA)開環(huán)聚合,及脫保護(hù)劑應(yīng)用，合成得到分子量可控的聚L-谷氨酸的制備方法，其特征在于該方法包括如下エ藝過程和步驟 A.ニ環(huán)己胺引發(fā)Y-芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐(BLG-NCA)制備聚L-谷氨酸-Y-芐酯(PBLG) (1)在金屬鈉存在的條件下減壓蒸餾ニ環(huán)己胺，以除去ニ環(huán)己胺中殘留的水分，并將其在無水無氧條件下儲(chǔ)存； (2)在干燥的反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入BLG-NCA，抽真空充氮?dú)猓磸?fù)三次，再注入溶劑ニ氧六環(huán)；待其充分溶解后注入引發(fā)劑ニ環(huán)己胺，單體BLG-NCA與引發(fā)劑的摩爾比，即M/I在50:1到200:1之間，攪拌均勻后置于低溫恒溫槽中，溫度控制在15-20°C，至反應(yīng)液變?yōu)檎吵硪?，將反?yīng)液緩慢倒入無水こ醇中沉淀，此時(shí)有白色纖維狀物質(zhì)析出，經(jīng)過濾，真空干燥，得白色纖維狀聚合物，即為PBLG ； B.采用三甲基碘硅烷或類似結(jié)構(gòu)硅烷等作脫保護(hù)劑，脫去PBLG上的芐基制備聚L-谷氨酸(PLGA)Jf PBLG溶于新蒸的ニ氯甲烷中，再按0. 8-1. 0克PBLG加入0. 3-0. 4毫升的三甲基碘硅烷的比例加入三甲基碘硅烷，在40-50°C溫度攪拌，反應(yīng)8-12小吋，將反應(yīng)液倒入水飽和的正己烷中沉淀，抽濾，并用無水こ醚和大量去離子水沖洗數(shù)遍后，干燥可得白色塊狀產(chǎn)物，即為PLGA。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的，基于引發(fā)劑及脫保護(hù)劑從NCA開環(huán)聚合，及脫保和劑應(yīng)用，得到分子量易控的聚L-谷氨酸的制備方法，其特征在于步驟A中所用的単體BLG-NCA與引發(fā)劑ニ環(huán)己胺的摩爾比應(yīng)為M/I=50:1-200:1 ;并通過三甲基碘硅烷、或與之具有類似結(jié)構(gòu)的三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷等，脫去聚合物鏈上的芐基后，聚合物分子不會(huì)斷鏈，所得聚レ谷氨酸的分子量范圍在I. 2X104-5. OXlO4之間，產(chǎn)率65%—78%，產(chǎn)量數(shù)十克。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由引發(fā)劑引發(fā)N-羧酸酐(N-carboxyanhydride，簡(jiǎn)稱NCA)的開環(huán)聚合，并通過脫保護(hù)后，從而獲得分子量容易控制的，聚L-谷氨酸的制備方法，此發(fā)明屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。其目的和要點(diǎn)在于與原有技術(shù)相比，引發(fā)劑為二環(huán)己胺，可有效控制聚L-谷氨酸分子量；三甲基硅碘烷為脫保護(hù)劑，可避免了聚合物分子斷鏈。從而使制備的聚L-谷氨酸分子量分布較窄。此法制備條件溫和，分子量容易控制，適合于聚L-谷氨酸規(guī)模合成，以滿足此材料在生物醫(yī)用和組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用需求。
文檔編號(hào)A61K47/34GK102617851SQ201210091218
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者劉志文, 尹靜波, 張?chǎng)? 王志春, 陳學(xué)思, 顏世峰 申請(qǐng)人:上海大學(xué)