本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用極耐熱糖苷酶制備的抗腫瘤組合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

三七為五加科人參屬植物，是我國名貴中藥材，根莖入藥，有散瘀止血，消腫止痛的功能。皂苷是三七的主要有效成分，迄今為止，已從三七的不同部位分離得到70余種單體皂苷，包括人參皂苷rb1、rd、re、rg1和三七皂苷r1等。其中，人參皂苷rb1、rg1和三七皂苷r1為三七總皂苷的主要成分。這三種成分在抗疲勞、維持血液循環(huán)、改善心肌缺血、抗心律失常、鎮(zhèn)靜、抗衰老及抗腫瘤等方面均顯示出一定的藥理作用。

三七總皂苷的抗腫瘤作用具有高效、低毒、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)。其中，人參皂苷rb1具有抗疲勞、舒張血管、提高免疫力等活性；人參皂苷rg1具有抗衰老、防止動脈粥樣硬化、提高免疫力等活性；三七皂苷r1具有心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、改善微循環(huán)等活性；人參皂苷rg3對肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、白血病等具有顯著的抑制作用，并且大量研究表明，rg3是最具開發(fā)潛力的人參皂苷類抗腫瘤化合物；人參皂苷rh1對肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、白血病等具有抑制作用；人參皂苷ck對肺癌、膀胱癌、慢性粒細(xì)胞白血病、胃癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、大腸癌、脊髓瘤、結(jié)腸癌等具有抑制作用。經(jīng)不同的糖苷酶水解，人參皂苷和三七皂苷可以轉(zhuǎn)化為其相同母核的不同糖苷形式。因此，可以以功能為導(dǎo)向，定向水解三七皂苷主要成分母核的糖苷，制備抗腫瘤活性更強(qiáng)的三七皂苷提取物精深加工產(chǎn)品。

對于皂苷類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，有化學(xué)轉(zhuǎn)化法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法因其反應(yīng)劇烈、選擇性差、副產(chǎn)物多等缺點(diǎn)而不被采用。生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和，特異性好、分離純化容易等特點(diǎn)，而受到青睞。由于三七總皂苷成分中主要包含葡萄糖苷(rb1，rg1和r1等)，因此，通過篩選葡萄糖苷酶有望實(shí)現(xiàn)三七總皂苷的去糖基轉(zhuǎn)化。目前皂苷類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化主要有微生物轉(zhuǎn)化法和酶轉(zhuǎn)化法，但還存在以下缺點(diǎn)：(1)通常是針對某一種皂苷進(jìn)行微生物或酶的轉(zhuǎn)化，還沒有通過一種生物酶同時(shí)定向水解三七皂苷中富含的數(shù)種皂苷；(2)還沒有以抗腫瘤的功能為導(dǎo)向，制備抗腫瘤活性更強(qiáng)的三七皂苷提取物的精深加工產(chǎn)品。(3)采用的生物酶活力、專一性、酶學(xué)特性還不能適應(yīng)規(guī)?；⒌统杀镜膶?shí)際應(yīng)用。因此，以功能為導(dǎo)向，利用酶學(xué)特性優(yōu)異的生物酶對三七皂苷提取物進(jìn)行精深加工意義重大，將顯著提升三七及其提取物的附加值，拓寬和增強(qiáng)三七及其提取物在抗腫瘤方面的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：針對上述現(xiàn)有技術(shù)缺陷和空白，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤組合物及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)方案：一種抗腫瘤組合物，由β-葡萄糖苷酶降解三七總皂苷提取物而得。

上述β-葡萄糖苷酶來源于黑曲霉、里氏木霉、嗜熱菌來源的微生物及其基因重組菌。

β-葡萄糖苷酶降解三七總皂苷提取物的轉(zhuǎn)化條件為：底物濃度0.05-50mg/ml，β-葡萄糖苷酶用量為1～50u/mg，反應(yīng)溫度為30～95℃，反應(yīng)2～4h。

上述抗腫瘤組合物在制備治療乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或肝癌藥物中的應(yīng)用。

一種抗癌藥物，有效成分為上述的抗腫瘤組合物。

有益效果：本發(fā)明提供了一種反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、工藝操作簡單的三七總皂苷精深加工的生物制備方法，產(chǎn)品成分明確、質(zhì)量可控。創(chuàng)制了一種抗腫瘤功效顯著的三七總皂苷精深加工產(chǎn)品。本發(fā)明的三七總皂苷轉(zhuǎn)化物對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤增殖的抑制作用明顯優(yōu)于三七總皂苷提取物。

附圖說明

圖1：三七皂苷r1結(jié)構(gòu)式圖；

圖2：人參皂苷rb1、rg1、20-rg3、rh1結(jié)構(gòu)式圖；

圖3：三七總皂苷提取物hplc圖譜；

圖4：三七總皂苷提取物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的hplc圖譜；

圖5：三七總皂苷轉(zhuǎn)化前后抗腫瘤活性比較圖；

圖6：三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡圖；

圖7：三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抑制akt的磷酸化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明的目的在于提供一種提高三七總皂苷抗腫瘤活性的生物酶轉(zhuǎn)化法，該方法將β-葡萄糖苷酶用于三七總皂苷中數(shù)種主要皂苷的去糖基轉(zhuǎn)化，提高三七總皂苷對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌和肺癌的增殖抑制作用。

本發(fā)明分為三步：篩選、利用特異性強(qiáng)、酶學(xué)特性優(yōu)異的葡萄糖苷酶同時(shí)定向水解三七總皂苷提取物；優(yōu)化、建立適宜的以功能為導(dǎo)向的產(chǎn)品制備工藝；將轉(zhuǎn)化產(chǎn)品應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的抑制。

本發(fā)明選用的β-葡萄糖苷酶能將人參皂苷rb1、rg1和三七總皂苷r1完全轉(zhuǎn)化(利用的三七總皂苷材料中，人參皂苷rb1的含量為30～45％，rg1的含量為35～47％，三七皂苷r1含量為10％左右。)在本發(fā)明的實(shí)施例中，三七總皂苷純度為98wt.％以上，其中人參皂苷rb1含量為38.7wt.％，rg1含量為40.5wt.％，三七皂苷r1含量為10.7wt.％。

本發(fā)明的三七總皂苷的轉(zhuǎn)化條件為：底物濃度0.05-50mg/ml，β-葡萄糖苷酶用量為1～50u/mg，反應(yīng)溫度為30～95℃，反應(yīng)2～4h的情況下，rb1、rg1和r1的轉(zhuǎn)化率分別為90～100％、60～100％、70～100％。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，三七總皂苷的劑量設(shè)置如下：50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml。

在本發(fā)明實(shí)施例中，經(jīng)葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化后，三七總皂苷的抗腫瘤活性得到顯著提高；三七總皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致caspase3的剪切；另外，三七總皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠抑制akt的磷酸化，進(jìn)而阻斷akt相關(guān)增殖信號通路的活化。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1：

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

比較不同來源β-葡萄糖苷酶對三七總皂苷的轉(zhuǎn)化情況，篩選出特異性強(qiáng)、酶學(xué)特性優(yōu)異、同時(shí)定向水解三七總皂苷提取物中三種主要皂苷，并能顯著提升轉(zhuǎn)化產(chǎn)品抗腫瘤活性的β-葡萄糖苷酶。

2.實(shí)驗(yàn)材料

2.1受試藥品

三七總皂苷：純度≥98％，購于成都曼思特生物科技有限公司.

2.2重組葡萄糖苷酶(均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的三種不同來源的β-葡萄糖苷酶)

gh3thermotogapetrophilarku-1(下面簡稱tpebgl3)；

gh3thermotogathermarumdsm5069；

gh3aspergillusnigernl-1。

2.3細(xì)胞

小鼠乳腺癌細(xì)胞4t1，人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ct26，人肝癌細(xì)胞hepg2，人肺癌細(xì)胞a549均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。選用dmem(含10％胎牛血清)培養(yǎng)基，于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)。

3.實(shí)驗(yàn)方案

3.1糖苷酶的制備

3.1.1原核表達(dá)體系構(gòu)建

將重組基因工程菌劃線于lb平板(kan或amp抗性)上進(jìn)行活化，37℃培養(yǎng)1d，至長出單菌落后接種于4mllb液體培養(yǎng)基中，于37℃，180r/min搖床培養(yǎng)8h，接種至150mllb液體培養(yǎng)基中于30℃，180r/min搖床培養(yǎng)，10h后離心收集菌體。

3.1.3重組酶的純化

a.樣品收集

(1)收集菌體，在5000×g，4℃離心20min，收集細(xì)胞；

(2)用30ml，ph7.5，tebuffer重懸細(xì)胞，在按上步驟離心；

(3)用4ml1×bindingbuffer重懸細(xì)胞，再用超聲波破碎；

(4)再加8ml的1×bindingbuffer，在12000×g離心10min，取上清。

嗜熱菌來源的糖苷酶預(yù)處理：將菌體離心回收，加入50ml1×bindingbuffer重懸，超聲波破碎，隨后80℃熱處理30min，對蛋白進(jìn)行初步純化。

b.裝柱

(1)用適量無菌水洗鎳柱；

(2)用適量的1×chargingbuffer洗柱子；

(3)用適量1×bindingbuffer洗柱子。.

c.上樣

(1)將含有目的蛋白的樣品液過膜后上樣；

(2)用10mm咪唑緩沖液平衡柱子；

(3)用不同濃度咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液，留下目的蛋白較純的部分。

d.清洗

(1)用適量1×stripbuffer洗柱子；

(2)用適量無菌水洗柱子；

(3)加入適量無菌水，蓋上上下帽蓋。

對于嗜熱菌來源的通過熱處理和鎳柱兩步純化，獲得電泳純重組蛋白，比酶活提高了6.1倍，得率為50％。

3.2三七總皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物制備

取500mg三七總皂苷，溶于3ml蒸餾水中，加入5mltpebgl3酶(100u/ml)于85℃水浴中反應(yīng)2h。

稱取預(yù)處理好的hpd400樹脂20g，濕法裝填于直徑10mm，高300mm的吸附柱。將三七總皂苷溶液稀釋到10mg/ml，過濾去掉沉淀物，得到上柱液。然后以每1ml/min的速度上柱，再分別用蒸餾水洗滌和50ml80％乙醇洗脫。洗脫液經(jīng)濃縮后，干燥得到產(chǎn)品。

3.3體外抗腫瘤活性檢測

在96孔板中每孔接種3000個(gè)細(xì)胞，放入37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁6h后，每孔加入不同濃度的三七總皂苷培養(yǎng)72h，于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前4h向每孔加入20μlmtt(4mg/ml)，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)取出96孔板，于1000×g離心，然后吸去上清，加入200μldmso，570nm處測吸光值。根據(jù)以下公式計(jì)算待測樣品對腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制率：

抑制率＝[100－(od570(實(shí)驗(yàn)孔)－od570(空白對照))/(od(不加藥對照空)－od570(空白對照)×100]％

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1三七總皂苷主要有效成分的含量

參照2015版《中國藥典》中三七總皂苷的含量測定方法，分別檢測并計(jì)算三七總皂苷中各主要成分含量，人參皂苷rb1、rg1和三七皂苷r1的含量分別為38.7％，40.5％和10.7％三七總皂苷提取物原料hplc圖譜如圖3所示。

4.2三七總皂苷經(jīng)葡萄糖苷酶tpebgl3轉(zhuǎn)化后成分的變化

選取本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的三種性能優(yōu)良的3種葡萄糖苷酶分別對三七總皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示葡萄糖苷酶tpebgl3(基因來源于gh3thermotogapetrophilarku-1的大腸桿菌重組菌)的轉(zhuǎn)化效果最好，rb1、rg1和r1能被完全轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前樣品、經(jīng)tpebgl3轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物hplc圖譜分別見圖3、圖4.

4.3三七總皂苷經(jīng)葡萄糖苷酶tpebgl3轉(zhuǎn)化后抗腫瘤活性的變化

按照上述方法，對500mg三七總皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。分別比較三七總皂苷經(jīng)酶轉(zhuǎn)化前后的體外抗腫瘤活性，結(jié)果如圖5所示。三七總皂苷對小鼠乳腺癌細(xì)胞4t1、人乳腺癌細(xì)胞mcf-7、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ct26、肝癌hepg2和肺癌細(xì)胞a549的ic50分別為204μg/ml、681μg/ml、258μg/ml、334μg/ml和>1600μg/ml。三七總皂苷經(jīng)tpebgl3轉(zhuǎn)化后，對4t1、mcf-7、ct26、hepg2和a549細(xì)胞的ic50分別為132μg/ml、243μg/ml、166μg/ml、251μg/ml和681μg/ml，均顯著低于未經(jīng)酶轉(zhuǎn)化的結(jié)果。其中，三七總皂苷本身并未顯示出對a549細(xì)胞的抑制作用，而經(jīng)酶轉(zhuǎn)化后，在800μg/ml的劑量下對a549細(xì)胞的體外增殖抑制率可達(dá)94.5％。

實(shí)施例2

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物作用腫瘤細(xì)胞的凋亡檢測及免疫印跡分析

2.實(shí)驗(yàn)材料

2.1受試藥品

實(shí)施例1中提到的三七總皂苷經(jīng)葡萄糖苷酶tpebgl3處理后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

2.2細(xì)胞

小鼠乳腺癌細(xì)胞4t1，培養(yǎng)方法見實(shí)施例1中2.3。

3.實(shí)驗(yàn)方案

3.1凋亡檢測

細(xì)胞(約1×10⁶個(gè))懸液轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞儀管，4℃，1000rpm離心5min，收集細(xì)胞。棄上清后，加入200μlbindingbuffer(10mmhepes，ph7.4，140mmnacl，2.5mmcacl2)，混勻后分別加入1.25μlannexinv溶液(1μg/ml)和2μlpi溶液(碘化丙啶，100μg/mlpi，20mmhepes，ph7.4)，室溫避光共孵20min后再加入300μlbindingbuffer，用流式細(xì)胞儀測定fl-1和fl-3通道的熒光，數(shù)據(jù)收集使用cellquest軟件(bdimmunocytometrysystems)，數(shù)據(jù)分析使用flowjo軟件。

3.2免疫印跡分析(westernblotting)

取細(xì)胞(約1×10⁶個(gè))用150μl的裂解液(10mmhepes，2mmedta，0.1％chaps，5mmdtt和1mmpmsf)裂解。冰浴0.5h，離心12000g，2min，4℃，取上清。用bca^tm蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)制備10％的sds-page膠，以50μg的蛋白量上樣，4℃低溫下電泳，恒定電流20ma，時(shí)間為1h。電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至pvdf膜。轉(zhuǎn)移完后，將膜放在blockingbuffer(2％freefatmilk，10mmtris-cl，50mmnacl，0.1％tween20，ph7.4)中室溫孵育2h封閉pvdf膜上沒有蛋白的區(qū)域，根據(jù)蛋白預(yù)染ladder的指示位置將膜剪成所需大小，與所需的一抗在4℃轉(zhuǎn)爐上孵育過夜。次日將膜放在washingbuffer(10mmtris-cl，50mmnacl，0.1％tween20，ph7.4)中輕輕振蕩洗滌三次，第一、二次5min，第三次10min，去除非特異性結(jié)合的一抗。然后與適當(dāng)稀釋的二抗共孵，室溫1.5h。最后，用washingbuffer洗滌膜去除非特異性結(jié)合的二抗，與底物共孵適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，通過化學(xué)成像儀曝光并拍照。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

凋亡是清除腫瘤細(xì)胞的一個(gè)主要機(jī)制，它不會給正常的細(xì)胞或周邊組織帶來損傷。為了探究三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗腫瘤作用機(jī)制，我們通過annexinv和pi雙染的方法，考察三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對乳腺癌細(xì)胞4t1的促凋亡作用。結(jié)果如圖6所示，三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠時(shí)間和劑量依賴性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，在200μg/ml的濃度下與4t1細(xì)胞共孵48h導(dǎo)致47％的細(xì)胞凋亡。同時(shí)，我們考察了三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與4t1共孵24h后與凋亡啟動相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠?qū)е耤aspase3的剪切。

4.2三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠抑制akt的磷酸化

pi3k/akt信號通路是人類腫瘤，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等中，最常見的被活化的通路，可以造成凋亡抵抗。激酶akt的473位絲氨酸(ser)的磷酸化對于akt最大程度的活化是必須的。akt不僅可以抑制凋亡，也是促進(jìn)增殖信號的關(guān)鍵分子。如圖7所示，通過考察，我們發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠抑制akt的磷酸化，因此，其抗腫瘤活性可能是通過對akt通路的阻斷作用實(shí)現(xiàn)的。

結(jié)論

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種葡萄糖苷酶在提高三七總皂苷抗腫瘤活性的生物催化轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。該酶在水相體系，底物濃度為10mg/ml，葡萄糖苷酶用量為1～10u/ml，溫度為85℃，反應(yīng)2～4h后，可讓三七總皂苷中的rb1、rg1和r1等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。三七總皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在rb1、rg1和r1的轉(zhuǎn)化率為100％的情況下，對小鼠乳腺癌細(xì)胞4t1、人乳腺癌細(xì)胞mcf-7、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ct26、肝癌hepg2和肺癌細(xì)胞a549的ic50分別為132μg/ml、243μg/ml、166μg/ml、251μg/ml和681μg/ml，均顯著低于未經(jīng)酶轉(zhuǎn)化的三七總皂苷。三七總皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致caspase3的剪切，可以抑制akt的磷酸化，進(jìn)而抑制akt相關(guān)增殖信號通路的活化，最終實(shí)現(xiàn)對腫瘤的抑制作用。本發(fā)明提供的三七總皂苷酶轉(zhuǎn)化技術(shù)操作簡單，有利于三七總皂苷在抗腫瘤防治上的推廣與應(yīng)用，同時(shí)為三七總皂苷在抗疲勞、防治心腦血管等疾病中的應(yīng)用提供了一種方法。

以上僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。