發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了用于某些肌肉、神經(jīng)和不育疾病或狀況的治療的穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)。此外，穩(wěn)定的acc可以在不同的輔助生殖技術(shù)中使用，例如用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物胚胎生長(zhǎng)或用于精子質(zhì)量的改進(jìn)。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、在臨床前和臨床生物利用度模型中已經(jīng)示出了，acc的施用導(dǎo)致了鈣生物利用度的促進(jìn)(meiron等人，j?bone?miner?res.2011,26(2):364-72，shaltiel等人，health?5,2013,18-29，和vaisman等人，journal?of?bone?and?mineral?research,2014,29(10),pp2203-2209)，這是一種在緩解鈣吸收不良相關(guān)狀況和紊亂方面特別重要的作用。acc的口服施用導(dǎo)致了對(duì)骨參數(shù)的積極影響，這由在骨質(zhì)疏松預(yù)防模型中的抗再吸收行為、合成代謝作用和骨機(jī)械強(qiáng)度的維持所展示(shaltiel等人)。wo?2013/088440公開(kāi)了無(wú)定形碳酸鈣組合物，用于在治療鈣吸收不良和吸收不良相關(guān)的紊亂、疾病和狀況中使用，以及用于在鈣吸收不良和骨代謝相關(guān)紊亂中增加骨礦物質(zhì)密度中使用。

2、wo?2005/115414描述了包含穩(wěn)定acc的口服可施用的組合物以及用于治療骨質(zhì)疏松、骨軟化和相關(guān)疾病的方法。wo?2008/041236描述了含有無(wú)定形或微晶碳酸鈣的制劑，其在治療各種病理狀況，包括增殖性疾病、神經(jīng)紊亂和肌肉骨骼紊亂中是有效的。wo?2009/053967描述了含有無(wú)定形碳酸鈣(acc)以及至少一種磷酸化的氨基酸或磷酸化的肽的組合物。所述組合物可以被用于其中列出的各種疾病的治療。

3、神經(jīng)損傷在臨床實(shí)踐中是常見(jiàn)的。存在許多實(shí)例，其中由事故或類(lèi)似情況引起的外周神經(jīng)損害不能完全恢復(fù)。還存在許多臨床實(shí)例，其中作為外科手術(shù)的結(jié)果，外周神經(jīng)一般必須被摘除。盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)具有神經(jīng)纖維的長(zhǎng)且弱的自我修復(fù)，外周神經(jīng)系統(tǒng)(pns)具有通過(guò)快速神經(jīng)纖維再生修復(fù)神經(jīng)的能力。關(guān)于損傷后pns功能性恢復(fù)的研究已經(jīng)成為一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，致力于尋找用于幫助和引導(dǎo)軸突再生的合適方法。

4、已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種手段來(lái)嘗試再生損傷的外周神經(jīng)。一種這樣的技術(shù)涉及切斷的神經(jīng)(severed?nerve)的近端和遠(yuǎn)端的實(shí)際縫合。已經(jīng)積極地追求了用于引導(dǎo)切斷的再生的軸突、縫合在近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端之間的各種導(dǎo)管的使用。

5、目前缺少充分治療的另外的疾病涉及肌營(yíng)養(yǎng)不良癥。肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是一組削弱肌肉骨骼系統(tǒng)并妨礙運(yùn)動(dòng)(locomotion)的肌肉疾病。肌營(yíng)養(yǎng)不良癥以進(jìn)行性骨骼肌無(wú)力、肌肉蛋白缺陷以及肌肉細(xì)胞和組織的死亡為特征。這樣的疾病的一種是杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(dmd)，一種致命的肌肉萎縮疾病(muscle?wasting?disease)，影響大約3500個(gè)男孩中的一個(gè)。杜氏男孩具有約20年的有限預(yù)期壽命。該紊亂由在肌萎縮蛋白基因中的突變?cè)斐桑辉S多不同的突變已經(jīng)被鑒定為導(dǎo)致蛋白肌萎縮蛋白的功能失調(diào)(dysfunction)。它以進(jìn)行性骨骼肌萎縮及退行為特征(shin等人int?j?biochem?cell?biol.2013，45(10):2266-79)，其也涉及非正常的鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)。肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的醫(yī)學(xué)管理已經(jīng)包括了皮質(zhì)類(lèi)固醇的使用；然而，盡管皮質(zhì)類(lèi)固醇具有相當(dāng)?shù)挠幸嫘ЧL(zhǎng)期使用皮質(zhì)類(lèi)固醇的治療可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。即使沒(méi)有皮質(zhì)類(lèi)固醇，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥也會(huì)導(dǎo)致降低的行動(dòng)能力，這本身與增加的骨折幾率和降低的骨礦物質(zhì)密度相關(guān)(nanette等人，phys?med?rehabil?clin?n?am.2012,23(4):773-99)。

6、目前，對(duì)于dmd或神經(jīng)損傷還不存在令人滿(mǎn)意的治療，并且減輕癥狀的嚴(yán)重程度以及改進(jìn)患有這些狀況的患者的生活質(zhì)量可以被認(rèn)為是一種成就。

7、輔助生殖技術(shù)(art)領(lǐng)域旨在解決雄性和雌性?xún)烧叩牟挥龁?wèn)題。主要技術(shù)中的一種是體外受精(ivf)。細(xì)胞培養(yǎng)基的內(nèi)含物可顯著地影響受精和胚胎發(fā)育，并且因此從而影響該程序的結(jié)果。ivf的成功率主要與轉(zhuǎn)移的胚胎數(shù)和因素例如胚胎質(zhì)量相關(guān)。更換培養(yǎng)基可顯著地影響體外胚胎發(fā)育。由于提高胚胎質(zhì)量和達(dá)到高級(jí)(advanced)發(fā)育階段的胚胎數(shù)量可增加成功受孕的幾率，尋找用于體外胚胎發(fā)育的最佳條件可以提高整個(gè)ivf過(guò)程的效率。

8、“雄性因素”不育被視為是在兩個(gè)相隔1周和4周收集的精子分析物中的至少一個(gè)樣品中精子濃度和/或運(yùn)動(dòng)性和/或形態(tài)的改變。在人中，它占不育的40-50％，并且影響所有男性的大約7％。雄性不育通常是由于由低精子計(jì)數(shù)、運(yùn)動(dòng)性和精子的非正常形態(tài)所反映的在精液或精液質(zhì)量方面的不足(kumar和singh，2015，j.hum.reprod.sci.，8(4):191-196)。

9、大多數(shù)art技術(shù)，例如宮腔內(nèi)人工授精或常規(guī)ivf要求精子至少正常的運(yùn)動(dòng)性。目前存在多種用于精子選擇的方法，例如，典型的洗滌上游(swim-up)技術(shù)被用以基于自然精子運(yùn)動(dòng)性來(lái)選擇最活躍的細(xì)胞。被選擇的精子可以從而被使用在ivf程序中。無(wú)數(shù)用于體外精子改善的技術(shù)被建議。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，維生素e可以保護(hù)精蟲(chóng)(spermatozoa)免受氧化損傷和運(yùn)動(dòng)性的喪失，并在倉(cāng)鼠卵細(xì)胞穿透測(cè)定中促進(jìn)精子的表現(xiàn)(agarwal&sekhon，human?fertility，december?2010，13(4):217-225)。bhoumik等人(cellbiochem.biophys.，2014,70:1177-1183)展示了，ca2+離子向無(wú)鈣培養(yǎng)基的添加增加精子向前運(yùn)動(dòng)性高達(dá)20％。

10、世界范圍內(nèi)雄性不育的現(xiàn)象正在增加(kumar和singh)，越來(lái)越多的夫婦轉(zhuǎn)向輔助生殖技術(shù)。因此，需要用于改進(jìn)精子體外運(yùn)動(dòng)性的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，無(wú)定形碳酸鈣(acc)可以積極地促進(jìn)細(xì)胞的再生、發(fā)育、成熟和分化。本發(fā)明部分地基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即acc加速神經(jīng)纖維再生、推動(dòng)肌管形成、改善精子質(zhì)量并促進(jìn)胚胎發(fā)育，包括但不限于增加達(dá)到高級(jí)發(fā)育階段的胚胎數(shù)量。

2、在一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)，用于在治療與神經(jīng)肌肉缺陷相關(guān)的疾病或狀況中使用。根據(jù)特定的實(shí)施方案，疾病或狀況選自肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和軸突缺陷。根據(jù)一些實(shí)施方案，藥物組合物用于在治療軸突缺陷，例如軸突損害中使用。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，藥物組合物用于在治療肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，例如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中使用。根據(jù)另外的方面，本發(fā)明提供了用于在有相應(yīng)需要的受試者中治療選自肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和軸突缺陷的疾病或狀況的方法，包括向所述受試者施用包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)的藥學(xué)上可接受的組合物。

3、根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了用于體外受精的方法，包括(a)使哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外受精；以及(b)體外培養(yǎng)胚胎，其中步驟(a)、步驟(b)或步驟(a)和(b)兩者在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該方法可以進(jìn)一步包括在步驟(a)之前，在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細(xì)胞培養(yǎng)基中卵母細(xì)胞的體外成熟的步驟。根據(jù)一些實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物選自人和非人哺乳動(dòng)物。

4、根據(jù)某些方面，本發(fā)明提供了用于改進(jìn)或改善精子質(zhì)量的方法，包括將精子暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)。根據(jù)一些實(shí)施方案，該方法包括將精子暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc或使精子與由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc接觸。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，精子是人精子。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，改進(jìn)精子質(zhì)量包括促進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)性、促進(jìn)精子前向運(yùn)動(dòng)性、增加精子計(jì)數(shù)，因此，本發(fā)明的方法包括促進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)性、促進(jìn)精子前向運(yùn)動(dòng)性、增加精子計(jì)數(shù)。

5、根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了用于分離攜帶x染色體和y染色體的精子細(xì)胞的方法，所述方法包括：(a)使精子樣品與由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc接觸，(b)進(jìn)行上游程序，(c)獲得包含活動(dòng)精子(motile?sperm)的級(jí)分，以及(d)分離步驟(c)中獲得的級(jí)分的上相和下相，其中所述上相富集有攜帶y染色體的精子，并且所述下相富集有攜帶x染色體的精子。

6、根據(jù)又另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)，用于在治療雄性不育中使用。

7、根據(jù)一些方面，本發(fā)明提供了用于在有相應(yīng)需要的受試者中治療雄性不育的方法，包括向所述受試者所述受試者施用包含有效量的由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)的藥物組合物。

8、根據(jù)上述方面中的任何一個(gè)，acc由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，穩(wěn)定劑選自：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機(jī)酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機(jī)化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類(lèi)和其衍生物、蛋白、磷酸化的蛋白、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

9、本技術(shù)提供如下內(nèi)容：

10、1.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)，用于在治療選自肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和軸突缺陷的疾病或狀況中使用。

11、2.如項(xiàng)目1所述的藥物組合物，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良癥選自杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、眼咽型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、遠(yuǎn)端型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和emery-dreifuss肌營(yíng)養(yǎng)不良癥。

12、3.如項(xiàng)目2所述的藥物組合物，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良癥是杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(dmd)。

13、4.如項(xiàng)目1所述的藥物組合物，其中所述軸突缺陷是軸突損害。

14、5.如項(xiàng)目4所述的藥物組合物，其中治療軸突損害包括促進(jìn)受損神經(jīng)的再生。

15、6.如項(xiàng)目1、4和5中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述缺陷或損害是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)或外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)的缺陷或損害。

16、7.如項(xiàng)目1至6中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述至少一種穩(wěn)定劑選自：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機(jī)酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機(jī)化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類(lèi)及其衍生物、蛋白、肽、磷酸化的蛋白、磷酸化的肽、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

17、8.如項(xiàng)目7所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自磷酸絲氨酸、三磷酸鹽、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、植酸、檸檬酸、依替膦酸、焦磷酸鹽、乙醇、六偏磷酸鹽、幾丁質(zhì)以及它們的任意組合。

18、9.如項(xiàng)目1至8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物通過(guò)全身施用被施用。

19、10.如項(xiàng)目9所述的藥物組合物，其中所述組合物被口服施用。

20、11.如項(xiàng)目9或10所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物被配制成選自片劑、膠囊、丸劑、粉末或顆粒的固體劑型；或選自酏劑、酊劑、懸浮液、糖漿、乳劑、膠體或凝膠的液體或半液體劑型。

21、12.如項(xiàng)目1和4至8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述疾病或狀況是軸突缺陷，并且所述藥物組合物被局部施用。

22、13.如項(xiàng)目12所述的藥物組合物，其中所述acc在缺陷的或損傷的神經(jīng)附近被施用。

23、14.如項(xiàng)目12或13所述的藥物組合物，其中所述施用通過(guò)注射、輸注或通過(guò)泵進(jìn)行。

24、15.如項(xiàng)目12至14中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物被配制為選自懸浮液、乳劑、膠體或凝膠的液體或半液體劑型。

25、16.如項(xiàng)目1至15中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定的acc的一次顆粒的平均直徑為約10nm至約500nm。

26、17.一種用于體外受精的方法，包括(a)使哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外受精；以及(b)體外培養(yǎng)胚胎，其中步驟(a)、步驟(b)或步驟(a)和(b)兩者在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行。

27、18.如項(xiàng)目17所述的方法，包括在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細(xì)胞培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)所述胚胎，從而促進(jìn)胚胎發(fā)育。

28、19.如項(xiàng)目17或18所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟(a)之前，在包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc的細(xì)胞培養(yǎng)基中卵母細(xì)胞的體外成熟的步驟。

29、20.一種用于改進(jìn)精子質(zhì)量的方法，包括將精子暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)。

30、21.如項(xiàng)目20所述的方法，其中改進(jìn)精子質(zhì)量選自由以下組成的組：促進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)性、促進(jìn)精子前向運(yùn)動(dòng)性、增加精子計(jì)數(shù)以及它們的任意組合。

31、22.如項(xiàng)目21所述的方法，其中增加精子計(jì)數(shù)包括在進(jìn)行運(yùn)動(dòng)性或前向運(yùn)動(dòng)性程序后增加精子計(jì)數(shù)。

32、23.一種用于分離攜帶x染色體和y染色體的精子的方法，包括：(a)使精子樣品與由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc接觸，(b)進(jìn)行上游程序，(c)獲得包含活動(dòng)精子的級(jí)分，以及(d)分離步驟(c)中獲得的級(jí)分的上相和下相，其中所述上相富集有攜帶y染色體的精子，并且所述下相富集有攜帶x染色體的精子。

33、24.如項(xiàng)目17至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述精子、卵母細(xì)胞或胚胎是人或非人哺乳動(dòng)物的精子、卵母細(xì)胞或胚胎。

34、25.如項(xiàng)目24所述的方法，其中所述非人哺乳動(dòng)物選自由家畜動(dòng)物、家養(yǎng)寵物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物組成的組。

35、26.如項(xiàng)目24所述的方法，其中所述精子、卵母細(xì)胞或胚胎是人精子、卵母細(xì)胞或胚胎。

36、27.如項(xiàng)目17至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種穩(wěn)定劑選自：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機(jī)酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機(jī)化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類(lèi)及其衍生物、蛋白、肽、磷酸化的蛋白、磷酸化的肽、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

37、28.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)，用于在治療雄性不育中使用。

38、29.如項(xiàng)目28所述的藥物組合物，其中所述雄性不育選自由低精子計(jì)數(shù)、低精子運(yùn)動(dòng)性和低精子前向運(yùn)動(dòng)性造成的雄性不育。

39、30.一種用于在有相應(yīng)需要的受試者中治療選自肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和軸突缺陷的疾病或狀況的方法，包括向所述受試者施用包含由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)的藥學(xué)上可接受的組合物。

40、31.如項(xiàng)目30所述的方法，其中所述肌營(yíng)養(yǎng)不良癥選自由以下組成的組：杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、眼咽型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、遠(yuǎn)端型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和emery-dreifuss肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，或其中所述軸突缺陷是軸突損害。

41、32.一種用于在有相應(yīng)需要的受試者中治療雄性不育的方法，包括向所述受試者向所述受試者施用包含有效量的由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的無(wú)定形碳酸鈣(acc)的藥物組合物。

42、33.如項(xiàng)目32所述的方法，其中所述雄性不育選自由以下組成的組：與低精子計(jì)數(shù)相關(guān)的雄性不育、與低精子運(yùn)動(dòng)性相關(guān)的雄性不育和與低精子前向運(yùn)動(dòng)性相關(guān)的雄性不育。

43、34.如項(xiàng)目30或33所述的方法，其中所述穩(wěn)定劑選自由以下組成的組：聚磷酸鹽、磷酸化的氨基酸、有機(jī)酸、磷酸化、膦酸化、硫酸化或磺化的有機(jī)化合物、羥基羧酸的磷酸酯或硫酸酯、二膦酸鹽、糖類(lèi)及其衍生物、蛋白、磷酸化的蛋白、天然和合成的生物聚合物及其衍生物、以及它們的任意組合。

44、35.一種用于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括將細(xì)胞暴露于由至少一種穩(wěn)定劑穩(wěn)定的acc。