專利名稱：與抗生素有關(guān)的腹瀉的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與抗生素相關(guān)的腹瀉包括與艱難梭菌(Clostridiumdifficile)相關(guān)的腹瀉(CDAD)和假膜性結(jié)腸炎(PMC)的治療。更具體地說，本發(fā)明是關(guān)于與CDAD相關(guān)的艱難梭菌毒素A的中和。
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如同這里具體地和單獨地包括了上述各個刊物、專利或?qū)＠暾埖奈淖謨?nèi)容一樣，這里在同等程度上將上述刊物、專利或?qū)＠暾埖墓_內(nèi)容作為整體進(jìn)行了參考。
背景技術(shù)：
在醫(yī)院或長期護(hù)理機構(gòu)的大部分老年患者中，厭氧生物艱難梭菌是與抗生素相關(guān)的細(xì)菌性腹瀉和假膜性結(jié)腸炎(PMC)的主要致病因素[1，2]。在成年人結(jié)腸中，該生物體不能與正常菌群成功地競爭，但當(dāng)正常腸道菌群被改變(例如通過抗生素治療)時，艱難梭菌就能大量聚集腸道?？股刂委熣妓信c艱難梭菌相關(guān)的腹瀉(CDAD)病例的98％。但是，任何改變正常菌群的誘發(fā)疾病，包括任何需要廣泛免疫抑制治療的疾病，也可導(dǎo)致CDAD的發(fā)生。例如，最近的證據(jù)表明艾滋病患者也是患CDAD的高危險者。
艱難梭菌產(chǎn)生兩種外毒素，毒素A(腸毒素)和毒素B(細(xì)胞毒素)，它們對引起CDAD起重要作用。毒素A對這種疾病起重要作用。其作用是與腸道上皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致這些細(xì)胞的破裂并引起向腸道分泌液體由。毒素A引起的這些保護(hù)性上皮細(xì)胞的破裂是導(dǎo)致腹瀉產(chǎn)生的關(guān)鍵一步。一旦上皮細(xì)胞出現(xiàn)損害，有效的細(xì)胞毒素B便可進(jìn)入下層敏感組織并帶來其它臨床癥狀。
已發(fā)現(xiàn)毒素A表現(xiàn)出外源凝集素樣活性，使其與上皮細(xì)胞上的寡糖受體結(jié)合。已鑒別出作為毒素A潛在受體的幾種寡糖序列，包括下列結(jié)構(gòu)[5-7]αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAcβGal(1-4)βGlcNAc(人血型抗原X)(1-3)αFucβGal(1-4)βGlcNAc(人血型抗原Y)(1-2) (1-3)αFuc αFucβGal(1-4)βGlcNAc(人血型抗原I)(1-6)βGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc另外，用具有末端αGal(1-3)βGal(1-4)βG1cNAc寡糖序列的牛甲狀腺球蛋白親合柱已獲得了高度純化的毒素A制劑[8.9]。
現(xiàn)在對患CDAD或PMC的患者的治療是除去上述有害物質(zhì)并開始口服抗生素甲硝噠唑或萬古霉素，同時進(jìn)行流體替代[3，14]。萬古霉素僅在患者對甲硝噠唑治療不能忍受或不敏感的某些情況下使用。另外，由于萬古霉素價格昂貴，故不能常規(guī)性使用。這種治療方式對患CDAD或PMC患者的有效率約80％。約20％的病人在停止抗生素治療后又出現(xiàn)腹瀉[15]。在這些個體中，還會間斷地出現(xiàn)腹瀉，直至重新建立起正常腸道菌群并降低艱難梭菌的數(shù)量。這是一個緩慢過程，因為每當(dāng)發(fā)生腹瀉時服用抗生素，如甲硝唑破壞了正常腸道菌群的平衡。
唯一的另外一種去除腸道毒素活性治療CDAD和PMC的方法包括使用數(shù)克數(shù)量的陰離子交換樹脂，如與抗生素結(jié)合口服給予消膽胺和降脂2號樹脂。這種方法已用于治療患輕度至中度疾病的患者，以及多次腹瀉發(fā)作的病人[16，17]。這種治療形式在這種疾病的治療中僅獲得少許進(jìn)步[18]。除了離子交換樹脂效力差的缺點外，還有一些與使用樹脂有關(guān)的其它缺點。離子交換樹脂不與毒素A特異性結(jié)合。因此，它們可與抗生素本身結(jié)合，導(dǎo)致腸道內(nèi)抗生素水平不能達(dá)到最佳。另外，如果患者接受了其它與離子交換樹脂結(jié)合的藥物，則會降低藥效。離子交換樹脂的另一個缺點是由口服這些化合物引起的令人討厭的味覺和余味。
就樣品中毒素A的存在的診斷方法來說，一種測定樣品中艱難梭菌的方法是培養(yǎng)該樣品。該方法的缺點包括所需時間長以及非致病艱難梭菌即非—毒素產(chǎn)生菌菌株的干擾。其它方法包括使用特異的抗血清或單克隆抗體。美國專利號4,863,852和5,098,826描述了通過使用含毒素A和生物學(xué)受體的試劑來檢測艱難梭菌毒素A的方法，其中受體包括與載體結(jié)合的αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc、X和Y抗原寡糖序列。
從上面的敘述可見，需要一種可治療與抗生素相關(guān)的腹瀉的化合物。優(yōu)選的化合物應(yīng)是非侵害性給藥，如口服。
木發(fā)明概述本發(fā)明提供了治療由艱難梭菌引起的與抗生素相關(guān)的腹瀉的組合物和方法。
一方面，本發(fā)明提供了從懷疑含所述毒素A的樣品中結(jié)合并除去毒素A的方法，該方法包括在使其中所述毒素A被吸附到載體上的條件下將所述樣品與寡糖序列相接觸，寡糖序列通過非肽基相容性連接臂與固態(tài)惰性載體共價連接，其中所述寡糖序列與毒素A相連；以及從樣品中分離含被吸附的毒素A的載體。
另一方面，本發(fā)明提供了一種治療由毒素A介導(dǎo)的腹瀉的方法，該方法包括給予需要這種治療的受治療者有效量的組合物，組合物中含有通過非肽基相容性連接臂與藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列，其中所述寡糖序列與毒素A相連，并且其中所述組合物能從胃腸道被排除。
另一方面，本發(fā)明提供了一種可用于治療由毒素A引起的CDAD及相關(guān)疾病的藥用組合物，該組合物包括通過非肽基相容性連接臂與藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列，其中所述寡糖序列與毒素A相連；以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述組合物能從胃腸道被排除。
附圖的簡要說明

圖1表明用含各種寡糖序列的SYNSORB板中和純化的毒素A的血細(xì)胞凝集活性的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)幾種SYNSORBS有效地中和了毒素A的活性。
圖2顯示了用SYNSORB52和90中和毒素A的活性的濃度依懶性。在濃度為20mg/ml時兩種SYNSORB均可有效地中和約75％以上的毒素A的活性。
圖3表明在濃度為20mg/ml時用SYNSORB52和90中和毒素A活性的時間依懶性。
圖4顯示了幾種SYNSORB與毒素A的結(jié)合親合性。發(fā)現(xiàn)不同的SYNSORB具有不同的與毒素的結(jié)合親合性。
對本發(fā)明的詳細(xì)描述A.定義此處所用的下列術(shù)語具有下面的含義術(shù)語“與抗生素相關(guān)的細(xì)菌性腹瀉”是指因抗生素療法破壞了腸道微生物菌群的平衡，使致病生物體如艱難梭菌大量繁殖的疾病。這些生物體引起了腹瀉。與抗菌素相關(guān)的細(xì)菌性腹瀉包括如與艱難梭菌相關(guān)的腹瀉(CDAD)和假膜性結(jié)腸炎(PMC)等。
術(shù)語“生物相容”是指對人體組織或體液的化學(xué)惰性。
術(shù)語“相容性連接臂”是指將寡糖結(jié)構(gòu)與生物相容性固態(tài)載體隔開并且具有生物功能的部分，其中一個官能團(tuán)能與載體的相應(yīng)官能團(tuán)相連，而另一個官能團(tuán)能與寡糖結(jié)構(gòu)的相應(yīng)官能團(tuán)相連。本發(fā)明中優(yōu)選的相容性連接臂是非肽基間隔臂。
術(shù)語“假膜性結(jié)腸炎”(PMC)也被稱作假膜性小腸結(jié)腸炎或腸炎，是指小腸和大腸的粘膜感染，并伴隨著假膜性物質(zhì)(包括纖維蛋白、粘液、壞死的上皮細(xì)胞和白細(xì)胞)的形成和進(jìn)入大便。
術(shù)語“固態(tài)載體”是指寡糖序列可通過相容性連接臂與之相連接的惰性、固態(tài)物質(zhì)。當(dāng)體內(nèi)使用時，固態(tài)載體應(yīng)是生物相容性的。
術(shù)語“SYNSORB”是指合成的8-甲氧羰基辛基寡糖結(jié)構(gòu)，其與衍生的硅膠顆粒紅色硅藻土色譜載體pTM(Manville Corp.，Denver，colorado)(12)共價偶聯(lián)。
術(shù)語“毒素A”是指引起CDAD及相關(guān)癥狀的艱難梭菌腸毒素。該毒素有植物凝集素樣活性。
為本發(fā)明的目的，所有糖均用通常的三字母命名法來表示，除果糖為L—型外，所有糖除非另外指明均認(rèn)為是D—型。并且所有糖均為吡喃糖形式。
B.合成可用本領(lǐng)域已知的方法完成寡糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)法合成。通常是用被適宜保護(hù)的單個的單糖裝配這些物質(zhì)。
所用的具體方法通常是根據(jù)所要合成的各個結(jié)構(gòu)進(jìn)行變動和優(yōu)化。通常，寡糖糖苷的全部或部分的化學(xué)合成首先包括還原糖或單糖的異構(gòu)碳原子上配糖鍵的形成。具體地說，在還原單位的異構(gòu)中心選擇性修飾天然存在或化學(xué)修飾的糖結(jié)構(gòu)(糖基給體)的適宜保護(hù)形式，從而引入包括鹵化物、三氯乙酰亞氨基化物、乙?；?、硫代糖苷等的離去基團(tuán)。然后在本領(lǐng)域已知的催化條件下將給體與糖苷配基或碳水化合物受體的適宜形式反應(yīng)，糖苷配基或碳水化合物受體中在其將建立配糖鍵的位置上具有一個自由羥基。本領(lǐng)域中已知許多種糖苷配基部分，它們可以適當(dāng)構(gòu)型與還原單位異構(gòu)中心相連。
適當(dāng)使用碳水化合物合成本領(lǐng)域中已知的相容性保護(hù)基團(tuán)，會使合成的結(jié)構(gòu)得以選擇性修飾或者使其它糖單位與受體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步相連。
配糖鍵形成后，可用糖苷進(jìn)行其它糖單位的偶聯(lián)或在選擇的位置上進(jìn)行化學(xué)修飾或者，在常規(guī)的脫保護(hù)之后，用于酶法合成。通常，將天然存在或化學(xué)修飾的糖單位化學(xué)偶聯(lián)成糖苷是通過使用文獻(xiàn)中大量記載的化學(xué)方法[21-37]來完成的。
本發(fā)明寡糖結(jié)構(gòu)與之相連的固態(tài)載體可以是片狀或顆粒狀的形式。本領(lǐng)域中已知許多種生物相容性的固態(tài)載體物質(zhì)。其實例是硅膠、合成硅酸鹽如多孔玻璃，生物硅酸鹽如硅藻土、含硅酸鹽的礦物質(zhì)如高嶺土，以及合成多聚物如聚苯乙烯、聚丙烯和多糖。優(yōu)選用于體內(nèi)的固態(tài)載體粒度為從約10至500微米。特別優(yōu)選的粒度為100至200微米。
寡糖結(jié)構(gòu)是被共價連接或非共價(被動地)吸附在固態(tài)載體上。共價連接可以是通過載體上和寡糖結(jié)構(gòu)的相容性連接臂上官能團(tuán)之間的反應(yīng)完成的。意外地發(fā)現(xiàn)通過相容性連接臂使寡糖結(jié)構(gòu)與生物相容性固態(tài)載體相連得到了一種產(chǎn)物，它在固態(tài)載體存在的情況下仍能有效地去除毒素。用于間接成鍵的連接部分優(yōu)選是有機的、有適當(dāng)長度的(至少一個碳原子)生物官能化的分子，它僅僅是為了將寡糖結(jié)構(gòu)從固態(tài)載體表面分開。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選用下式表示(寡糖-Y-R)n-固態(tài)載體。其中寡糖表示至少2個糖單位的寡糖基團(tuán)，其基團(tuán)與毒素A相連，Y是氧、硫或氮，R是至少一個碳原子的糖苷配基連接臂，固態(tài)載體如上面所定義的，n為大于或等于1的整數(shù)。可使用含約2至10個糖單位的寡糖序列。優(yōu)選含約3至5個糖單位的序列。
本領(lǐng)域中已知許多糖苷配基連接臂。例如，已經(jīng)公開了含對-硝基苯基基團(tuán)(即-OC6H4pNO2)的連接臂[38]。在合成的適當(dāng)時間，將硝基還原成氨基，該氨基可以被保護(hù)成N-三氟乙酰氨基。在與載體偶聯(lián)之前除去三氟乙酰氨基，從而暴露氨基。
已公開了含硫的連接臂[39]。具體地說，該連接臂是從2-溴乙基基團(tuán)衍生的，在與硫代親核基團(tuán)的取代反應(yīng)中，其形成了具有各種末端官能團(tuán)如-OCH2CH2SCH2CO2CH3和-OCH2CH2SC6H4-pNH2的連接臂。這些末端官能團(tuán)可以與固態(tài)載體上的互補官能團(tuán)反應(yīng)，從而與固態(tài)載體形成共價鍵。該反應(yīng)是本領(lǐng)域已知的。
已經(jīng)公開了6-三氟乙酰氨基-己基連接臂(-O-(CH2)6-NHCOCF3)[40]，其中三氟乙酰氨基保護(hù)基可被除去，暴露用于偶聯(lián)的伯氨基。
其它已知的連接臂的例子包括7-甲氧羰基-3，6二噁庚基連接臂[41](-OCH2-CH2)2OCH2CO2CH3)；2-(4-甲氧羰基丁烷羧酰氨基)乙基[42](-OCH2CH2NHC(O)(CH2)4CO2CH3)；烯丙基連接臂[43](-OCH2CH＝CH2)，其與適宜單體進(jìn)行游離基共聚反應(yīng)，生成共聚體；其它已知的烯丙基連接臂[44]是[-O(CH2CH2O)2CH2CH＝CH2]。另外，可以在2-氨基乙硫醇的存在下衍生烯丙基連接臂[45]，形成連接臂-OCH2CH2CH2SCH2CH2NH2。還公開了其它適宜的連接臂[21-23，25，26]。
用于將寡糖基團(tuán)與固態(tài)載體共價相連的具體連接方法并不是關(guān)鍵。
優(yōu)選地，糖苷配基連接臂是疏水性基團(tuán)，最優(yōu)選地，糖苷配基連接臂是選自下面的組中的疏水性基團(tuán)，該組包括 ，-(CH2)5OCH2CH2CH2和-(CH2)8CH2O-。
我們發(fā)現(xiàn)與生物相容性固態(tài)載體如紅色硅藻土色譜載體PTM共價連接的合成寡糖序列(SYNSORB)可用于連接毒素A。這些組合物適用于治療CDAD和PMC。這些組合物中特別優(yōu)選SYN-SORB，因為它無毒性，并且耐機械和化學(xué)沉淀。在使用大鼠的研究中(臨床前研究廣泛接受的模型，因為它們預(yù)示了人的反應(yīng))，發(fā)現(xiàn)SYNSORBs不受影響地從大鼠胃腸道通過。發(fā)現(xiàn)它們在口服后被完全、迅速地排除(在72小時中排除了99％)。
另外，SYNSORB上高密度的寡糖部分特別適用于連接毒素A，因為據(jù)信該毒素具有多個寡糖連接位點。
優(yōu)選用非肽基連接臂作為本發(fā)明的相容性連接臂。使用糖肽并不理想，因為糖肽通常含有與同一蛋白質(zhì)相連的多個不同的寡糖。寡肽還很難大量獲得，并且需要昂貴和冗長的純化。同樣，使用BSA或HSA偶聯(lián)物也不理想，因為當(dāng)口服給藥時其在胃腸道中的穩(wěn)定性不好。
含毒素A連接單位的寡糖基團(tuán)通過非肽基間隔臂與惰性固態(tài)載體的共價連接可以有效地從用于分析毒素A的存在的樣品中結(jié)合并除去毒素A，或者從患CDAD的病人的腸道中結(jié)合并除去毒素A。當(dāng)合成與該相容性連接臂相連的寡糖時(以非衍生形式)，可以獲得高度純化的組合物。其可與多種固態(tài)載體相連。
C.藥物組合物通過使用包括一種或多種的與連接于固態(tài)載體的毒素A相連的寡糖結(jié)構(gòu)的藥物組合物，從而獲得了本發(fā)明的方法。
當(dāng)使用優(yōu)選的口服給藥方式時，可將這些組合物配制成各種形式。優(yōu)選是液體或半固體形式。含有液體藥用惰性載體如水的組合物可用于口服給藥。也可使用其它藥學(xué)上相容的液體或半固體。這些液體或半固體的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
也優(yōu)選能與半固體食品如蘋果醬、冰激淋或布丁相混合的組合物。優(yōu)選不具有令人不愉快的口味或余味的制劑，如SYNSORBs。也可用鼻胃管將組合物直接送入胃。
還可使用固態(tài)組合物，其可選擇性地和便利地用于含藥用惰性載體的劑型，這類載體包括常用的固態(tài)載體如乳糖、淀粉、糊精或硬脂酸鎂，它們常常出現(xiàn)在片劑或膠囊形式中。SYNSORB本身還可不添加惰性藥用載體來使用，特別適用于膠囊形式。
選擇藥物劑量，從而中和并消除被感染的患者腸道中發(fā)現(xiàn)的毒素A。有效劑量是從約0.25至1.25微摩爾寡糖/kg體重/每天，優(yōu)選約0.5至1.0微摩爾寡糖/kg體重/每天。對于SYNSORB組合物，意味著約0.5至1.0gSYNSORB/kg體重/每天，它導(dǎo)致腸道中SYNSORB的濃度約20mg/ml。每天應(yīng)給藥3或4次，連續(xù)一周或直至解除臨床癥狀。給藥劑量水平和時間表可以根據(jù)所用的特定多糖構(gòu)型以及受治療者的年齡和病情來改變。發(fā)現(xiàn)完全去除毒素A活性的最適時間是在37℃約1小時，所用SYNSORB濃度為1ml試樣中20mg。
在多至7天的時間內(nèi)給予本發(fā)明的含寡糖組合物將有效地治療CDAD和PMC。
如前面所討論的，優(yōu)選口服給藥，但也可考慮其它給藥方式如通過直腸給藥。這些劑型的使用決定于所用的特定組合物以及接受治療的特定患者。這些劑型可含有液態(tài)載體，其可以是油狀的、水狀的或被乳化的或含有適合于給藥方式的某些溶劑。
可將組合物配制成單位劑量的形狀，或者是多次或亞單位劑量的形式。對于先前已確定的期待劑量，口服液體組合物應(yīng)優(yōu)選含約1微摩爾寡糖/ml。
D.方法學(xué)我們發(fā)現(xiàn)艱難梭菌毒素A可以被與毒素結(jié)合的某些寡糖序列中和。特別是已發(fā)現(xiàn)通過非肽基相容性連接臂與固態(tài)載體共價相連的合成寡糖能有效地中和毒素A。這樣的組合物的例子是結(jié)合并中和毒素A活性的某些SYNSORBs。
我們測試了幾種通過8-甲氧基羰基辛基(MCO)間隔臂與紅色硅藻土色譜載體P相連的寡糖序列中和毒素A的性能。所測試的結(jié)構(gòu)物(也稱作SYNSORBs)示于表1。如圖1至4中所示，所測試的SYNSORBs中和至少約50％毒素A活性的能力是不同的。
本發(fā)明中用于與固態(tài)載體相連的寡糖序列是那些連接毒素A的寡糖序列。通過一個簡單的體外試驗可以快速測定寡糖與毒素A的連接親合力，例如下面的實施例4中所描述的。為了本發(fā)明的目的，連接毒素A的與固態(tài)載體相連的寡糖序列是指那些能使血細(xì)胞凝集試驗終點滴度至少降低50％的組合物。
然后用按上面所述的所測試的某些SYNSORBs研究這些寡糖組合物中和人糞試樣中的毒素A的能力。
已經(jīng)研究了志賀樣毒素(SLTs)與化學(xué)合成的寡糖序列的連接[10]。
SLTs是一組細(xì)胞毒素，其由兩部分組成A亞單位和B寡聚體。B寡聚體是毒素的連接部位，使之同宿主細(xì)胞受體連接。SLT毒素連接到含αGal(1-4)βGal決定基的糖脂受體上。A亞單位具有使哺乳動物細(xì)胞中的28s核糖體RNA脫嘌呤的酶活性(N-糖苷酶)。該酶活性破壞了被毒素感染的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的能力。
SLT作用的位點是腎和腸系膜脈管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細(xì)胞，SLTs可引起能導(dǎo)致腎衰和尿中血紅蛋白的損害。SLTs是溶血性尿毒癥的致病因素。SLTs還部分地導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎(出血性腹瀉)。
另一方面，毒素A是一種腸毒素，其可導(dǎo)致液體分泌、粘膜損傷以及腸道感染。它是作為人中性白細(xì)胞的化學(xué)吸引劑。毒素A是一種單體蛋白。它引起單細(xì)胞中細(xì)胞素的活化并導(dǎo)致釋放。這些炎性作用對引起假膜性結(jié)腸炎中所見的結(jié)腸感染起重要作用。
毒素A好象是與糖蛋白受體連接，糖蛋白受體的結(jié)構(gòu)還有待于確定。還未完全了解作用機理，但認(rèn)為毒素A是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞并改變細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架。毒素A受體被認(rèn)為是與鳥嘌呤調(diào)節(jié)蛋白連接。毒素A是產(chǎn)生CDAD和PMC的第一步。
定義寡糖毒素A連接特異性的在先研究已經(jīng)鑒別了幾種毒素連接的結(jié)構(gòu)要求[5-7]。終止于與2型核心(βGal(1-4)βGlcNAC)相連的α-Gal(1-3)βGal序列的寡糖已顯示出對連接的重要性。另外，毒素A還識別帶有與2型核心。半乳糖的2羥基或N-乙酰基葡糖胺的3-羥基相連的果糖的寡糖的。所選擇的用于毒素中和研究的SYNSORBs包括具有這些結(jié)構(gòu)特征的碳水化合物以及其它具有6型(βGal(1-4)βGlc)和1型(βGal(1-3)βGlcNAc)核心結(jié)構(gòu)的寡糖。其它所選擇的用于連接研究的SYNSORBs含有先前已顯示出與毒素A相連的寡糖序列。
通過分析上層液相對于不添加任何SYNSORB的對照品對血細(xì)胞凝集實驗中終點滴度的降低來測定毒素A吸附到SYNSORB上的量。結(jié)果示于圖1。發(fā)現(xiàn)那些具有X、Y和αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc寡糖序列的SYNSORBs(SYNSORBs51、52和115)分別能有效地去除75、88和88％的毒素A活性。另外，含有先前未顯示出與毒素A相連的寡糖序列的兩種其它SYNSORBs(SYNSORBs9和90)也同樣對中和毒素A活性有效。SYNSORBs2、5、104、105和l 34中和毒素A活性的約50％。僅含有MCO間隔臂的對照品SYNSORB(ASA)僅能輕微地中和毒素A的活性。
從而，我們發(fā)現(xiàn)中和毒素A的能力直接與同惰性載體相連的寡糖序列相關(guān)。圖1的結(jié)果顯示了αGal(1-3)βGal鍵對高親合性毒素連接的重要性。另外，我們發(fā)現(xiàn)具有豐乳糖與N-乙酰葡糖胺(2型中心)或葡萄糖(6型)之間的β(1-4)鍵的寡糖序列顯示出高親合性毒素連接。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)毒素A連接具有僅與半乳糖的2羥基相連的果糖的寡糖序列。
圖1和圖4中的結(jié)果顯示了血細(xì)胞凝集實驗中終點滴度的降低。在使用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的組織培養(yǎng)分析中獲得了類似的結(jié)果。這些研究表明當(dāng)將SYNSORB加入純化的毒素A制劑中時CHO細(xì)胞顯示出相對于對照品的終點稀釋度的降低。
已發(fā)現(xiàn)通過相容性連接臂與固態(tài)載體相連的幾種不同的寡糖序列具有中和毒素A活性的能力。這些以及其它連接毒素A的序列可用于治療CDAD和PMC。發(fā)現(xiàn)完全去除毒素A活性的最適時間為在37℃約1小時，所用SYNSORB濃度為1ml樣品中20mg。因為每克SYNSORB約含0.25至1.0微摩爾寡糖，每日劑量中給予寡糖的總量將在7.5至30微摩爾的范圍，所用腸道體積為4升。
還通過SYNSORB組合物中和人糞樣中毒素A的能力表明了通過相容性連接臂與固態(tài)載體相連的寡糖序列治療CDAD和PMC的用途。這些人體樣品的實驗可以預(yù)測體內(nèi)結(jié)果，因為這一分析的體外條件與體內(nèi)條件之間基本上沒有組合物的或化學(xué)的變化。另外，分析條件接近于在人體腸道中所發(fā)現(xiàn)的實際條件，該實驗已經(jīng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員接受為與人體使用大體相關(guān)。
表2中的結(jié)果表明SYNSORB52能有效地中和人糞樣中毒素A的活性。通常，水樣糞中毒素的量越大中和越有效。僅含低水平毒素的固態(tài)糞樣中的毒素不太被有效中和。
通過口服含經(jīng)相容性連接臂與固態(tài)載體共價相連的寡糖序列的組合物(例如SYNSORBs)可以治療CDAD或PMC。例如，已發(fā)現(xiàn)SYNSORB完整地通過大鼠的胃。然后其與腸道中的毒素A結(jié)合。完整的SYNSORB同與之相連的毒素A隨后排除，故而從患者中排除毒素A。
通過相容性連接臂與固態(tài)載體共價連接的寡糖序列，例如SYNSORB可用于治療患多發(fā)性腹瀉的病人。在腹瀉開始復(fù)發(fā)時，讓患者用SYNSORB治療，從腸道中除去毒素A。毒素A的去除防止了對腸道內(nèi)表面最初的組織損傷，從而防止或減少了腹瀉。不需要進(jìn)一步給予抗生素治療。在腸道中使正常腸道菌群重新建立。這一治療的優(yōu)點是它不影響正常菌群在腸道中的重新繁殖。治療到腹瀉停止，使完全恢復(fù)。
除了對患反復(fù)性腹瀉病人的用途外，用通過相容性連接臂與固態(tài)載體共價相連的寡糖序列如SYNSORBs進(jìn)行治療還可用于治療患有或易于發(fā)展成CDAD或PMC的所有病人。與抗生素治療結(jié)合使用SYNSORB將能夠更有效地減少腹瀉，使患者更快地恢復(fù)。
本發(fā)明的一個主要方面是出現(xiàn)在生物樣品中的生理濃度的毒素A快速有效連接，從而能夠分析這些樣品中毒素A的存在和/或毒素A的量。典型地，生物樣品是糞樣。可用標(biāo)準(zhǔn)萃取技術(shù)提取并制備樣品。然后在樣品中的任何毒素A被吸附的條件下將樣品或提取物同通過相容性連接臂與固態(tài)載體共價相連的毒素——結(jié)合寡糖序列相接觸。
可以用任何適宜的檢測體系在含寡糖的載體的表面直接測定毒素A。例如，放射活性的、生物素化的或熒光標(biāo)記的對毒素A特異的單克隆或多克隆抗體可用于測定與載體連接的毒素A的量。本領(lǐng)域中已知許多與標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)類似的測定特異性結(jié)合配合物生成的方法。
E.實施例用下列方法進(jìn)行后面的實施例的研究。
1.毒素A的純化用略微改變的Sullivan等人的方法[13]從艱難梭菌的毒素產(chǎn)生菌株(ATCC43255，VPI菌株10463)分離毒素A。
在無氧罐中使艱難梭菌在2、3升腦心臟浸液肉湯中于37℃生長72小時。將粗培養(yǎng)物于5,000xg離心20分釧沉淀細(xì)菌。小心分出所得培養(yǎng)物上層液并加入固體硫酸銨(897g)達(dá)到60％的飽和度。將培養(yǎng)物上層液于4℃攪拌過夜，然后在10,000xg離心30分鐘。將所得沉淀溶解于少量緩沖液A(50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5)中，對2-4升變化的緩沖液A透析。異用YMl00(截留100,000分子量)膜超濾濃縮。
將濃縮后的含毒素溶液加到用緩沖液A平衡的DEAE-Sephadex A-25柱上。用緩沖液A洗滌離子交換樹脂除去未吸附的蛋白后，用含增長量的NaCl(從0.1至0.4M變化)的緩沖液A沖洗使柱子分段鹽梯度展開。用含0.25M NaCl的緩沖液A從柱子中洗脫出毒素A活性，而用0.4M NaCl緩沖液A除去毒素B活性。
通過測定蛋白質(zhì)濃度以及使用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的細(xì)胞毒素終點來檢測每部分毒素的整體純度和量。還通過測量使用兔紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集活性來測定毒素A活性的量。含毒素B的部分不能對兔紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集起作用，這決定了毒素B部分缺乏毒素A活性。
2.使用兔紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集實驗將新鮮的兔紅細(xì)胞在磷酸緩沖的生理鹽水(PBS)中洗滌一次并懸浮在濃度為4％(V/V)的冷PBS中。在U型微量滴定池中在冷PBS中制備含毒素A溶液的連續(xù)2-倍稀釋液(50μl)。然后向每個池中加入等體積(50μl)兔紅細(xì)胞，輕輕混勻微量滴定板。將滴定板于4℃保溫4小時后，目測血細(xì)胞凝集滴度。
3.使用中國倉鼠卵巢細(xì)胞測定毒素活性。
用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞測定毒素A的細(xì)胞毒活性。將CHO細(xì)胞在5％CO2空氣中于37℃保存在補充有10％胎牛血清的HamsFl2介質(zhì)中。
將待測毒素A樣品以l∶10稀釋在Hams介質(zhì)中并通過0.22微米注射濾器除菌過濾。將待測樣品連續(xù)5-倍稀釋于介質(zhì)中，將各稀釋液100μl加到用CHO細(xì)胞連成單層的滴定池中，然后在5％CO2空氣中于37℃保溫24小時。每份樣品分析2次。
通過與未含毒素A的對照池比較，保溫24小時后可以輕易看到細(xì)胞毒作用。24小時后用95％甲醇固定細(xì)胞并用Giemsa染色劑染色。通過比較含有和不含有SYNSORB樣品的終點稀釋度測定了中和研究中的中和百分度。
用下列實施例說明本發(fā)明，但并不意味著可理解為限制了本發(fā)明的范圍。
實施例1篩選含寡糖的固態(tài)載體中和毒素A活性的能力將按上面所述制得的含純化的毒素A的溶液(0.5ml)加到各種SYNSORBs上，各種SYNSORBs含有通過MCO相容性連接臂與固態(tài)載體共價相連的不同的寡糖序列。所用SYNSORB量的范圍是從10.1至17.5mg。在1.5ml微量離心管中制備樣品，將微量離心管在立式圓筒離心機上于室溫保溫2小時。
保溫后，使SYNSORB置于管底部并小心分出上層液，制備上層液的連續(xù)二倍稀釋液并按上面所述測定血細(xì)胞凝集終點。
通過比較樣品終點與不加SYNSORB的對照品終點來測定SYNSORB存在下的終點降低程度。所用的另外對照品是僅含MCO(疏水8碳)間隔臂的SYNSORB(ASA)。
結(jié)果示于圖1，并表明發(fā)現(xiàn)幾種寡糖結(jié)構(gòu)有效地中和了毒素A的活性。
實施例2用SYNSORBs52和90測定最佳結(jié)合條件在1.5ml微量離心管中向預(yù)先稱重的每種SYNSORB加入1ml純化的毒素A溶液，從而測定最大地中和毒素A所需的SYN-SORBs52和90的量。用12.8、21.6和43.3mg量的SYNSORB52測定SYNSORB52樣品；用12.9、19.2和42.3mg量的SYNSORB90測定SYNSORB90樣品。將樣品在立式圓筒離心機上于37℃保溫2小時。還測定了僅含毒素A溶液的對照樣品。
通過比較含有或不含有SYNSORB樣品的血細(xì)胞凝集實驗的終點滴度測定了每份樣品的中和的量。結(jié)果示于圖2，結(jié)果表明約20mg的每種所測定的SYNSORB能中和至少75％的1ml毒素A溶液中的毒素A。
通過保溫含1ml純化的毒素A溶液和20mgSYNSORB52或SYNSORB90的微量離心管測定了最佳中和所需的保溫時間長度。將樣品在立式圓筒離心機上于37℃保溫10、20、40.80或160分鐘。
如上所述測定每個保溫期間的中和程度。結(jié)果示于圖3，結(jié)果表明保溫約1小時(40和80分鐘之間)能有效中和毒素A。
實施例3中和毒素陽性人糞樣品中毒素A的活性從Alberta醫(yī)院大學(xué)微生物實驗室獲得了毒素A陽性的人糞樣品。將1ml每種糞樣置于1.5ml微量離心管中，加入20mgSYNSORB52(預(yù)先用50μl PBS潤濕)，將試管于37℃在立式圓筒離心機上保溫4小時。還同時測定了沒有SYNSORB的對照糞樣品。保溫后，將糞樣在Eppendorf微量離心機中于14,000rpm離心10分鐘。小心地分出所得上層液并置于干凈的微量離心試管中。
用PREMIERTM艱難梭菌毒素A檢測試劑盒(Meridian Diag-nostics，Cincinnati，俄亥俄)測定每份樣品中毒素A的量。通過測定相對于不加SYNSORB的單獨對照樣品在450nm吸收度的降低來估算中和百分度。
結(jié)果示于表2，結(jié)果表明SYNSORB52能中和人生理樣品中的毒素A活性。
實施例4連接親合性的測定如實施例1中所述將各種SYNSORB與毒素A結(jié)合來估算各種SYNSORBs與毒素A的結(jié)合親合性，如在先所述測定了用兔紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集實驗的終點滴度。能較有效地中和毒素A活性的SYNSORB具有與毒素A更高親合性結(jié)合的寡糖結(jié)構(gòu)。那些降低大于50％滴度的SYNSORB被視為與毒素A結(jié)合。
結(jié)果示于圖4，并且表明按照這種判斷標(biāo)準(zhǔn)有些SYNSORB(SYNSORBs52和68)結(jié)合毒素A，而其它的(SYNSORB34和89)看來似乎不結(jié)合毒素A。
按照本發(fā)明前面所述的技術(shù)對上述完成本發(fā)明的各種實施方案的模式進(jìn)行改進(jìn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。上述實施例僅僅是本發(fā)明的示范，而不限制下面的權(quán)利要求書中所定義的范圍。
表1.用于毒素A中和研究的SYNSORBsSYNSORB號結(jié)構(gòu)號通用名 寡糖結(jié)構(gòu)＊21 B αGal(1-3)βGal(1-2)αFuc52 H2型 βGal(1-4)βGlcNAc(1-2)αFuc93 B2 αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNA(1-2)αFuc34 4 N-乙?；肴樘前乏翯al(1-4)βGlcNAc(1-2)αFuc51 5 X βGal(1-4)βGlcNAc(1-3)αFuc52 6 Y βGal(1-4)βGlcNAc(1-2)(1-3)αFucαFuo68 7 PK αGal(1-4)βGal(1-4)βGlc89 8 Sialyl-半乳糖 αNeuAc(2-6)βGal(1-4)βGalc90 9 - αGal(1-3)βGal(1-4)βG1c104 10H6型αGal(1-4)βGlc(1-2)αFuc105 11B6型αGal(1-3)βGal(1-4)βGlc(1-2)αFuc115 12- αGal(1-3)βGal(1-4)βGlcNAc134 13- αGal(1-3)βGal(1-3)βGlcNAc＊所有寡糖通過標(biāo)準(zhǔn)疏水8碳間隔臂與紅色硅藻土色譜載體P連接。
表2.用SYNSORB52中和糞樣品中的毒素A活性糞樣品中的毒素A水平a糞的類型b中和百分度++++SS 96++++SW 80++++SW 77
++++W70++++SS 64+++ SW 63++ W80++ W72++ SW 46+ S50+ S42+ W35+ W0a用PREMIERTM艱難梭菌毒素A檢測試劑盒測定糞樣中毒素A的水平。表2中的正號表示每種樣品中毒素A的相對量，其是用下面所示的450nm處的吸收度所測定的量。還顯示了對于糞樣中毒素A水平使用SYNSORB52的平均中和百分度。
A450 平均中和百分度++++＞1.5 77±12％(n＝5)+++ 1.1-1.463％(n＝1)++ 0.6-1.066±18％(n＝3)+ 0.1-0.432±22％(n＝3)b所測糞樣品的整體稠度?？s寫S、SS、SW和W分別指固體、半固體、半水樣和水樣的。對于糞便稠度用SYNSORB52對毒素A活性的平均中和百分度如下S(31±27％，n＝3)，SS(80±23％，n＝2)，SW(67±16％，N＝4)和W(62±19％，n＝4)。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改11、根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中通過非肽基相容性連接臂與藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列是選自包括表1中給出的SYNSORBs號2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一組物質(zhì)。
12、根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述連接臂是-(CH2)8C(O)-。
13、一種用于治療由毒素A引起的CDAD和相關(guān)疾病的藥學(xué)組合物，該組合物包括a)通過非肽基相容性連接臂與藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列，其中所述寡糖序列與毒素A連接；以及b)藥學(xué)上可接受的載體，其中所述組合物能被從胃腸道排除。
14、根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述寡糖序列有2至10個糖單位。
15、根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述寡糖序列有3至5個糖單位。
16、根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述寡糖序列是選自包括表1中給出的寡糖結(jié)構(gòu)號1-3、5-7和9-13的一組物質(zhì)。
17、根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述通過非肽基相容性連接臂與所述藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列是選自包括表1中給出的SYNSORBs2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一組物質(zhì)。
18、根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述連接臂是-(CH2)8C(O)-。
權(quán)利要求
1.從懷疑含有毒素A的樣品中結(jié)合并除去所述毒素A的方法，該方法包括a)在使其中所述毒素A被吸附到載體上的條件下將所述樣品與寡糖序列相接觸，寡糖序列通過非肽基相容性連接臂與固態(tài)惰性載體共價連接，其中所述寡糖序列與毒素A相連；并且b)從樣品中分離含被吸附的毒素A的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述寡糖序列有2至10個糖單位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述寡糖序列有3至5個糖單位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述寡糖序列是選自包括表1中給出的寡糖結(jié)構(gòu)號1-3、5-7和9-13的一組物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過非肽基相容性連接臂與固態(tài)惰性載體共價連接的所述寡糖是選自包括表1中給出的SYN-SORBs號2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一組物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述連接臂是-(CH2)8C(O)-。
7.一種治療受治療者由毒素A介導(dǎo)的腹瀉的方法，該方法包括給予需要這種治療的患者有效量的含有通過非肽基相容性連接臂與藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體相連的寡糖序列的組合物，其中所述寡糖序列與毒素A連接，并且其中所述組合物能從胃腸道排除。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述寡糖序列有2至10個糖單位。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述寡糖序列有3至5個糖單位。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述寡糖序列是選自包括表1中給出的SYNSORBs號1-3、5-7和9-13的一組物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中通過非肽基相容性連接臂與藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列是選自包括表1中給出的SYNSORBs號2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一組物質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述連接臂是-(CH2)8C(O)-。
13.一種用于治療由毒素A引起的CDAD和相關(guān)疾病的藥學(xué)組合物，該組合物包括a)通過非肽基相容性連接臂與藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列，其中所述寡糖序列與毒素A連接；以及b)藥學(xué)上可接受的載體，其中所述組合物能被從胃腸道排除。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述寡糖序列有2至10個糖單位。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述寡糖序列有3至5個糖單位。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述寡糖序列是選自包括表1中給出的寡糖結(jié)構(gòu)號1-3、5-7和9-13的一組物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述通過非肽基相容性連接臂與所述藥學(xué)上可接受的固態(tài)惰性載體共價連接的寡糖序列是選自包括表1中給出的SYNSORBs2、5、9、51、52、68、90、104、105、115和134的一組物質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述連接臂是-(CH2)8C(O)-。
全文摘要
本發(fā)明涉及用連接艱難梭菌毒素A的寡糖組合物治療與抗生素有關(guān)的腹瀉，包括與艱難梭菌有關(guān)的腹瀉(CDAD)和假膜性結(jié)腸炎(PMC)的方法。更具體地說，本發(fā)明是關(guān)于與CDAD相關(guān)的艱難梭菌毒素A的中和。
文檔編號A61K47/48GK1140415SQ95191615
公開日1997年1月15日 申請日期1995年2月9日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月14日
發(fā)明者L·D·赫爾茲, G·D·阿姆斯特朗格 申請人:辛索爾布生物技術(shù)有限公司