專利名稱：含基因的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含基因的組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及用于把一基因?qū)肴焉锬阁w所帶的胎兒以表達該基因的含基因的組合物。本發(fā)明還涉及一種用于把一基因?qū)氚▽嶒瀯游?、家畜、?jīng)濟動物在內(nèi)的動物的胎兒的方法。
近年來，已開發(fā)出幾種直接把外源基因?qū)雱游锘蛉梭w內(nèi)的方法，希望將這些方法應(yīng)用于治療基因組異常所引起的疾病用的基因治療。
象先天性基因缺陷這樣的由先天性基因異常引起的疾病最好在產(chǎn)前階段治療。就把基因?qū)氘a(chǎn)前受治療者而言，在動物試驗中對受精卵進行微量注射是目前唯一的有效方法[Palmitter，R.D.&Brinster，R.L.Annu.Rev.Genet.，20，465-499(1986)]。
盡管用于受精卵的微量注射法為把基因?qū)肱咛グl(fā)育早期開辟了道路，但尚未開發(fā)出把外源基因?qū)胩旱氖侄?。此外，微量注射法不能用于人體妊娠情況下胎兒的基因治療。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于把外源基因?qū)氚l(fā)育期胎兒的方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種用于該方法中的含基因的組合物。
本發(fā)明人對用于把目的基因通過胎兒母體導(dǎo)入胎兒的方法進行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把基因和特定運輸因子一起導(dǎo)入母體時，它們能穿過作為胎兒和母體間血液屏障的胎盤基底膜；還發(fā)現(xiàn)，基因可以導(dǎo)入胎兒細胞以進行原位表達。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
因此，本發(fā)明提供一種包括一種基因和一種運輸因子的含基因的組合物，所述運輸因子能夠把該基因從妊娠母體運輸?shù)教杭毎?br> 本發(fā)明還提供了一種通過將上述含基因的組合物導(dǎo)入妊娠母體而把基因?qū)胩杭毎姆椒ā?br> 附圖簡述


圖1表示用本發(fā)明的組合物給藥后胎兒和母體肝臟的基因組DNA的Southern印跡分析結(jié)果。
圖2表示只用外源基因給藥后胎兒和母體肝臟的基因組DNA的Southern印跡分析結(jié)果。
圖3表示交媾后第3、6、9、12和15天用本發(fā)明組合物給藥時的胎兒基因組DNA的Southern印跡分析結(jié)果。
圖4表示交媾后第9天用本發(fā)明組合物給母體給藥時從小鼠胎兒、新生小鼠、一月齡幼鼠收集的基因組DNA的Southern印跡分析結(jié)果。
圖5表示從圖4中所示一月齡幼鼠的器官收集到的基因組DNA的狹線印跡分析結(jié)果。
圖6表示交媾后第9天用本發(fā)明組合物給母體給藥時從小鼠胎兒和新生小鼠收集到的RNA的Northern印跡分析結(jié)果。
圖7表示收集自已導(dǎo)入了SV40-CAT基因的小鼠和新生小鼠的蛋白質(zhì)的CAT活性。
圖8表示用X-gal染色獲得的組織化學(xué)切片圖，以及β-肌動蛋白-lacZ的表達。所述β-肌動蛋白-lacZ已通過在交媾后第8.5天用本發(fā)明的組合物給母體給藥而導(dǎo)入胎兒中。
圖9表示小鼠胎兒(已導(dǎo)入的β-肌動蛋白-lacZ在其中得到表達)的組織切片。
圖10表示已導(dǎo)入SR-α-HST-1基因的2周齡小鼠及其母鼠的血小板數(shù)目(其中，血采自心臟)。
圖11表示已導(dǎo)入SR-α-HST-1基因的3周齡小鼠及其母鼠的血小板數(shù)目(其中，血采自眶靜脈)。
圖12表示已導(dǎo)入SR-α-HST-1基因的3周齡小鼠及其母鼠血清中的HST-1蛋白濃度。
本發(fā)明中“運輸因子”這一術(shù)語用來指幫助基因運輸至靶細胞的物質(zhì)。本發(fā)明中所用的運輸因子能把基因從母體導(dǎo)入其胎兒細胞。更具體地說，當(dāng)把該運輸因子導(dǎo)入帶有胎兒的妊娠母體時，它能將基因?qū)胩杭毎?。運輸因子的例子有陽離子脂多胺。其中，雙C10-C20烷基酰胺甘氨酰基精胺是優(yōu)選的，而雙十八烷基酰胺甘氨?；肥翘貏e優(yōu)選的。
對本發(fā)明中所用的基因沒有特別限制，只要該基因能用于最好在胎兒期治療或預(yù)防的疾病即可，或者能用于為飼養(yǎng)象實驗動物、家畜和寵物這樣的經(jīng)濟動物而進行的基因?qū)爰纯伞?br> 例如，當(dāng)已經(jīng)證實胎兒缺少某一基因時或當(dāng)很清楚胎兒因其家族史而缺少某一基因時，這類基因就可用于本發(fā)明。此外，也可使用用于治療胎兒患有的先天性疾病的基因。
下表顯示了先天性遺傳病和缺陷基因產(chǎn)物之間的關(guān)系。
表1先天性遺傳病缺陷基因產(chǎn)物家族性高膽固醇血癥 低密度脂蛋白受體脂質(zhì)中的代謝錯誤載脂蛋白苯丙酮尿癥 苯丙氨酸羥化酶血友病甲因子VIII血友病乙凝固因子IX鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶基因高酪氨酸血癥富馬酰乙酰乙酸羥化酶囊性肺纖維化通過囊性肺纖維化的跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子假肥大性肌營養(yǎng)不良 小肌營養(yǎng)不良蛋白基因產(chǎn)物L(fēng)i-Fraumeni綜合癥 p53蛋白成視網(wǎng)膜細胞瘤 RB蛋白Lesch-Nyhan綜合癥 次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶腺苷脫氨酶缺陷 腺苷脫氨酶Nieman-Pick病 鞘磷脂磷酸二酯酶ITay-Sacks病 氨基己糖苷酶Aα1-抗胰蛋白酶缺陷 α1-抗胰蛋白酶抗凝血酶III缺陷 抗凝血酶III氨甲酰磷酸合成酶缺陷氨甲酰磷酸合成酶生長激素缺陷(IA型)生長激素甲狀腺球蛋白缺陷 甲狀腺球蛋白21-羥化酶缺陷 21-羥化酶(先天性腎上腺增生)丙酮酸脫氫酶缺陷 丙酮酸脫氫酶另外，通過把本發(fā)明的組合物和方法用于患自發(fā)遺傳病的動物或敲除的動物(用人工方法使其具有基因功能障礙的動物)，它們就可用于基因?qū)肽Ｐ汀６?，在病毒性肝炎或嬰兒惡性腫瘤的治療中，一些反義寡核苷酸在病毒性肝炎(甲、乙或丙肝)存在下抑制病毒性基因產(chǎn)物，其它一些反義寡核苷酸抑制癌基因(癌基因?qū)е孪缶S爾姆斯瘤和成神經(jīng)細胞瘤這樣的嬰兒惡性腫瘤)和造成其它疾病的基因的表達。
被導(dǎo)入動物體內(nèi)的基因的例子有(1)用于在動物體內(nèi)產(chǎn)生藥物的基因，(2)用于改善動物肉、物理成分、毛、乳質(zhì)量的基因，(3)通過將基因從胎生動物中剔除或?qū)⒒驅(qū)胩ド鷦游锒鴮蚬δ苓M行研究的基因材料，(4)用于恢復(fù)基因在基因缺陷(造成子宮中死胎)動物中的表達的基因材料。
胎兒包括除人之外的哺乳動物如狗、牛、馬、山羊、綿羊、猴、貓、豬、小鼠和大鼠的胎兒，也包括人的胎兒。
對所采用的基因形式?jīng)]有特別限制。然而，就導(dǎo)入和表達的容易程度而言，為表達基因而構(gòu)建的質(zhì)粒是特別優(yōu)選的。一個強有力的啟動子和/或增強子和一個基因的組合更為優(yōu)選，因為促進了表達。如果使用高度器官特異性的啟動子，所謂的器官擊靶(organtargeting)也是可能的，其中基因在特定器官中表達。
在本發(fā)明的含基因的組合物中，基因和運輸因子可以混合物的形式存在。也可以這樣的形式存在，即把混溶狀態(tài)的運輸因子與基因相混合。此外，也可以把已形成脂質(zhì)體的運輸因子與基因相混合。如果運輸因子已形成一種脂質(zhì)體，那么基因最好存在于脂質(zhì)體內(nèi)部、其膜中或膜的表面中。用來形成脂質(zhì)體的方法例如有渦動處理、超聲處理、反相蒸發(fā)、冷凍干燥、增濕、采用多元醇的方法、機械化學(xué)法、脂溶法以及噴霧干燥法。制備脂質(zhì)體時，下列成分可以作為成膜成分添加磷脂如雙十四?；字８视?、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸等，膽固醇，α-生育酚，磷酸三十二烷基酯以及十八烷胺。
基因和運輸因子的比例根據(jù)它們的性質(zhì)而有所變化。通常優(yōu)選的是，每μg DNA中摻入1-100nmol、特別是5-10nmol的運輸因子。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選通過注射方法給妊娠母體給藥，特別優(yōu)選的是動脈注射或靜脈注射。此外，本組合物可以通過導(dǎo)管給藥到母體的血管中。如果在妊娠期的話，對給藥時間就沒有特別的限制。不過，特別優(yōu)選的是，在器官發(fā)生期間(organogenic period)用本組合物給藥。
本發(fā)明的組合物給藥到母體后穿過胎盤基底膜，然后到達臍帶，最后到達胎兒，這樣就將基因?qū)肓颂杭毎Ｒ呀?jīng)證實，被導(dǎo)入的基因在產(chǎn)出后的新生兒細胞中存在并得以表達。
因此，本發(fā)明的組合物在把基因?qū)胩旱膶嶒炛?、在預(yù)防基因缺陷嬰兒的出生中、在胎兒基因缺陷的預(yù)防和治療中都很有用。該組合物也可用于飼養(yǎng)經(jīng)濟動物和寵物。
實施例下面將通過實施例更具體地描述本發(fā)明。這些實施例不能被理解成對本發(fā)明的限定。實施例1(1)用于導(dǎo)入的質(zhì)粒采用SV40-氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)質(zhì)粒[4752bp，Promega的產(chǎn)品]。(2)運輸因子采用雙十八烷基酰氨基甘氨?；?DOGS)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)p6983](Transfectum，Biosepra Inc.的產(chǎn)品)。(3)本發(fā)明組合物的制備向133μgSV40-CAT質(zhì)粒中加入250μl 0.3M NaCl水溶液以制備質(zhì)粒溶液。另外，把20μl96％乙醇加入500μgDOGS中并在室溫下保溫5分鐘。向所得溶液中加入180μl純化水以制備DOGS溶液。向含有200μl DOGS溶液和250μl純化水的溶液中加入質(zhì)粒溶液。將混合物在渦流混合器中機械搖動，以獲得本發(fā)明的組合物。(4)基因的導(dǎo)入i)在交媾后(P.C.)第9.5天，把按上述方法制備的組合物注射到每只妊娠雌性小鼠(體重約30g，Charles River Co.)的尾靜脈中。七天后(交媾后第16.5天)取出母體肝臟。同樣，用剖腹產(chǎn)術(shù)分離出胎兒。從肝臟和胎兒收集基因組DNA，對其進行Southern印跡分析檢查CAT基因的存在。按Pro.Natl.Acd.Sci.USA83，4993-4997(1986)所述方法收集基因組DNA。通過在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳來分離被限制酶SalI完全消化的DNA和未被消化的DNA，然后將DNA印跡到Hybond-N+nylon膜(Amersham的產(chǎn)品)上。采用由32P標(biāo)記過的SV40-CAT片斷(1908bp，Hind III片斷)作探針，將印跡雜交。在放射自顯影圖上檢測特定區(qū)帶。
結(jié)果證實，如圖1所示，外源基因即SV40-CAT質(zhì)粒被導(dǎo)入胎兒細胞。
圖1中，線1和2是對照SV40-CAT質(zhì)粒(33pg)的基因組DNA，線3和4得自未處理過的母體肝臟，線5和6來自未處理過的胎兒，線7和8來自用本發(fā)明組合物給藥過的母體肝臟，而線9和10來自處理過的胎兒。ii)結(jié)果示于圖2，該結(jié)果是在這樣的實驗中獲得的，即未與運輸因子混合的純SV40-CAT質(zhì)粒以類似于i)中所述的方式給妊娠小鼠藥給。從圖2可清楚地看出，在沒有運輸因子的情況下SV40-CAT質(zhì)粒不能有效地導(dǎo)入胎兒細胞中。圖2中，線1和2是來自對照SV40-CAT質(zhì)粒(33Pg)的基因組DNA，線3和4來自只用質(zhì)粒給藥的母體肝臟，而線5和6來自其胎兒。iii)圖3表示在類似于上述i)的實驗中獲得的結(jié)果，該實驗中在不同的時刻用本發(fā)明組合物給藥。從圖3可清楚地看出，當(dāng)在交媾后第3～6天期間給藥時，幾乎沒有基因被導(dǎo)入；交媾后大約9天后給藥基因開始能被導(dǎo)入；交媾后大約第9天導(dǎo)入基因的效率最高。圖3中，線1和2是來自對照SV40-CAT質(zhì)粒(33pg)的基因組DNA，線3和4來自在交媾后第3天導(dǎo)入了基因的胎兒，線5和6來自在交媾后第6天導(dǎo)入了基因的胎兒，線7和8來自在交媾后第9天導(dǎo)入了基因的胎兒，線9和10來自在交媾后第12天導(dǎo)入了基因的胎兒，而線11和12來自在交媾后第15天導(dǎo)入了基因的胎兒。實施例2以類似于實施例1中所述的方式，在交媾后第9天用實施例1(3)中獲得的本發(fā)明組合物給小鼠給藥。從交媾后第16.5天的胎兒、新生小鼠、1月齡小鼠收集基因組DNA。進行Southern印跡分析。
結(jié)果證實，如圖4所示，所有情況下都存在導(dǎo)入的基因。圖4中，線1和2是來自對照SV40-CAT質(zhì)粒(33pg)的基因組DNA，線3和4來自交媾后第16.5天的胎兒，線5和6來自新生小鼠，線7和8來自1月齡小鼠。然后，從1月齡小鼠的各種器官提取基因組DNA并進行狹線印跡分析。發(fā)現(xiàn)基因已被導(dǎo)入各器官。圖5中，線1是來自大腦的基因組DNA，線2來自甲狀腺，線3來自胸腺，線4來自心臟，線5來自肺，線6來自肝臟，線7來自脾，線8來自胰，線9來自腎，線10來自小腸，線11來自子宮，而線12來自肌肉。實施例3通過Northern印跡分析證實了如實施例1-i)所述導(dǎo)入的基因SV40-CAT的表達。
簡言之，從胎兒或新生小鼠的全身提取RNA，所述胎兒或新生小鼠已按類似于實施例1-i)的方式、采用同工基因(isogen)(Nippongene)導(dǎo)入了基因。通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離RNA(20μg)，然后印跡到硝化纖維素膜(Nitroplus Cellulosemembrane，Micron Separations Inc.的產(chǎn)品)上。以類似于實施例1所述的方式，采用由32P標(biāo)記的SV40-CAT片斷作探針進行雜交。結(jié)果在所有的胎兒及新生小鼠中都發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入的基因轉(zhuǎn)錄到RNA上。圖6中，線1代表未處理的胎兒，線2代表已導(dǎo)入了基因的胎兒，而線3代表已導(dǎo)入了基因的新生小鼠。
接著，從如實施例1-i)中所述導(dǎo)入了基因的胎兒和新生小鼠的全身提取蛋白質(zhì)樣品，然后分析外源基因的表達，即分析CAT的酶活性。簡言之，使每一樣品中的蛋白量彼此相等，并使樣品在60℃下熱處理5分鐘以使CAT固有抑制因子失活。用已知方法分析CAT活性(Zhu，N.，Liggitt，D.，Liu，Y.&Debs，R.，Science 261，209-211(1993)；以及Gorman，C.M.，Moffat，L.F.&Howard，B.H.，Mol.Cell.Biol.2，1044-1051(1982))。通過把200nmol乙酰輔酶A加入用0.1μCi14C(55mCi/mmol)標(biāo)記的終體積為150μl的氯霉素中來測定酶活性。
結(jié)果證實，導(dǎo)入的基因在所有胎兒和新生小鼠中都得到表達，這表明CAT蛋白已經(jīng)產(chǎn)生。圖7中，線1表示未處理的胎兒，線2表示已導(dǎo)入了外源基因的胎兒，線3表示已導(dǎo)入了外源基因的新生小鼠，而線4表示0.2μU CAT的對照CAT。實施例4把含有小雞β-肌動蛋白啟動子的lac Z質(zhì)粒(Sakura，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86，5758-5762(1989))用作待導(dǎo)入的質(zhì)粒。用133μg lac Z質(zhì)粒和400nmol DOGS，按類似于實施例1(3)中所述的方式制備本發(fā)明的組合物。
把這樣獲得的組合物注射到交媾后第8.5天的每只妊娠雌性小鼠的尾靜脈中以導(dǎo)入基因。在交媾后第10.5天分離胎兒。采用Cheng′s方法通過用X-gal染色來檢測β-肌動蛋白-lac Z活性(Cheng，T.C.，Wallace，M.C.，Merlie，J.P.&Olsow，E.N.，Science 201，215-218(1993))。把染色胎兒浸于含20％蔗糖和0.2％葡萄糖的4℃磷酸緩沖鹽水中之后，制備冷凍切片。把連續(xù)切片切成30μm厚，為用核堅牢紅進行復(fù)染選擇合適的切片。獲得了染色的切片。
圖8表示出導(dǎo)入了基因的小鼠的全身染色結(jié)果。切片染色的結(jié)果示于圖9。如圖所示，在胎兒的各種器官中β-肌動蛋白-lac Z活性都得到表達。圖8中，a-e表示已導(dǎo)入基因的胎兒，f表示未處理過的對照胎兒。圖9中，g表示沿縱向切開的胎兒的全身切片，h表示通過心臟切開的胎兒的全身前部切片，i表示右眼泡切片(放大圖)，j表示胰芽切片(放大圖)，k表示左前肢芽切片(放大圖)，F(xiàn)B指前腦，H指心臟，MT指中腎小管，Nc指脊索，IRS指視網(wǎng)膜內(nèi)的空間，PB指胰芽，D指背面，V指腹面。實施例5把HST-1基因用作待導(dǎo)入的基因。使用時，構(gòu)建含HST-1cDNA和SR-α啟動子的重組表達載體，將其導(dǎo)入妊娠母體。研究后代小鼠中HST-1基因是否得以表達。因為已經(jīng)知道HST-1基因產(chǎn)物能增加血小板數(shù)量，所以通過血小板計數(shù)來檢測表達與否。(1)待導(dǎo)入的基因采用含有與SR-α啟動子連接的HST-1基因的表達質(zhì)粒。(2)制備本發(fā)明的組合物重復(fù)實施例1(3)的步驟，所不同的是采用133μg SR-α-HST-1基因。(3)基因的導(dǎo)入把如上述制備的組合物注射到交媾后第10.5天的每只妊娠雌性小鼠的尾靜脈中以導(dǎo)入該基因。在后代小鼠出生后第2周和第3周測定其血小板數(shù)目。同時也測定其母體的血小板數(shù)目。結(jié)果示于圖10和11。圖10表示從心臟采集的血的結(jié)果，而圖11表示從眶靜脈采集的血的結(jié)果。
從這些結(jié)果可以清楚地看出，導(dǎo)入了HST-1基因的幼鼠的血小板數(shù)目高于對照小鼠血小板數(shù)目。這表明，HST-1基因被導(dǎo)入幼鼠體內(nèi)，并且該基因在小鼠中得到表達。
用ELISA測定3周齡小鼠血清中的HST-1蛋白。簡言之，用采自每只3周齡小鼠的50μl血清和已知方法進行ELISA以測定HST-1蛋白量(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，pp12368-12372，December1994)。結(jié)果示于圖12。圖12中的數(shù)據(jù)表明，在由導(dǎo)入了HST-1基因的母體生產(chǎn)的幼鼠的血液中檢測到HST-1蛋白。
用本發(fā)明的組合物給妊娠母體給藥時，可以防止有基因缺陷的后代的出生，而且可以在妊娠期間治療基因缺陷。在動物實驗中，在胚胎發(fā)生期把未知基因?qū)雱游镏校梢匝芯吭摶蛟趥€體發(fā)育中的作用。此外，該組合物可用于產(chǎn)生生理活性物質(zhì)(如動物體內(nèi)的藥物)或提高這類物質(zhì)的產(chǎn)量。因此，可通過改善物理成分、改善肉、乳和毛的質(zhì)量而用于飼養(yǎng)動物。
權(quán)利要求
1.一種包括基因和運輸因子的含基因的組合物，所述運輸因子能把該基因從母體運輸?shù)教杭毎?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，通過用該組合物給母體給藥而將該基因?qū)胩骸?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中運輸因子是雙C10-C20烷基酰胺甘氨酰基精胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中運輸因子是雙十八烷基酰胺甘氨酰基精胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的組合物，它被用于防止有基因缺陷的嬰兒的出生、防止和治療胎兒的基因缺陷、飼養(yǎng)動物。
6.一種用于通過給妊娠母體給藥而將基因?qū)胩杭毎暮虻慕M合物，該組合物是通過把含基因的溶液和含雙十八烷基酰胺甘氨?；返娜芤夯旌喜⒂脵C械搖動法搖動而獲得的。
7.一種把基因?qū)胩杭毎姆椒ǎ摲椒òㄓ脵?quán)利要求1-6中任一項定義的含基因的組合物給妊娠母體給藥。
全文摘要
一種包括基因和運輸因子的含基因的組合物，所述運輸因子能把該基因從母體運輸?shù)教杭毎Ｓ帽景l(fā)明的組合物給妊娠母體給藥時，可以防止有基因缺陷的后代的出生，而且可以在妊娠期間治療基因缺陷。在動物實驗中，在胚胎發(fā)生期把未知基因?qū)雱游镏校梢匝芯吭摶蛟趥€體發(fā)育中的作用。此外，該組合物可用于飼養(yǎng)象寵物、經(jīng)濟動物和家畜這樣的動物。
文檔編號A61K48/00GK1166788SQ9519565
公開日1997年12月3日 申請日期1995年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月14日
發(fā)明者本真, 落谷孝廣, 吉田尚, 杉村隆, 寺田雅昭 申請人:第一制藥株式會社