一種預(yù)防豬流行性腹瀉疾病的疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種預(yù)防豬流行性腹瀉疾病的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉疾?。≒orcine epidemic diarrhea, PED)的病 原，該病以產(chǎn)房1-7日齡仔豬淡黃色水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水為主，剖檢可見(jiàn)仔豬腸道內(nèi)脹氣、 有黃色乳凝塊。PEDV主要通過(guò)糞-口途徑傳播，產(chǎn)房仔豬通過(guò)消化道攝入病毒后，病毒主要 入侵空腸和回腸部位小腸黏膜上皮細(xì)胞，并開(kāi)始病毒復(fù)制。PEDV的感染導(dǎo)致上皮細(xì)胞膜表 面的雙糖酶（乳糖酶、蔗糖酶、麥芽糖酶）、氨肽酶、堿性磷酸酶的活性下降；同時(shí)，腸絨毛上 皮細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)破壞并發(fā)生細(xì)胞破碎，造成腸絨毛萎縮，腸道表面積減少，從而導(dǎo)致小腸消 化不良、吸收不良等機(jī)能障礙，誘發(fā)仔豬發(fā)生腹瀉并脫水。
[0003] PEDV最早在英國(guó)發(fā)現(xiàn)，并流行于歐洲從上世紀(jì)八十年代以后，中國(guó)、日本、韓國(guó)也 開(kāi)始有所報(bào)導(dǎo)。2010年至今，該病已廣泛流行于中國(guó)、韓國(guó)、泰國(guó)、美國(guó)等國(guó)。該病對(duì)產(chǎn)房仔 豬極高的發(fā)病率和致死率、較高的治療成本及防控成本，以及病毒基因發(fā)生變異造成強(qiáng)毒 株的出現(xiàn)，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。
[0004] 隨著PEDV分子生物學(xué)研究的深入，PEDV免疫機(jī)理基本清楚，屬于典型的局部黏膜 免疫為主，存在于血清中PEDV IgG不能提供有效保護(hù)，而腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型抗 體（SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔豬通過(guò)初乳來(lái)獲得母源SIgA，從而產(chǎn)生對(duì)流行性腹瀉的被 動(dòng)免疫保護(hù)。
[0005] 目前大多都是傳統(tǒng)型滅活苗和弱毒苗，但是它存在毒力返強(qiáng)及散毒的風(fēng)險(xiǎn)，需要 改進(jìn)。為了研制出更為安全、高效、成本低廉、保存和使用方法簡(jiǎn)易的豬流行性腹瀉疫苗，人 們開(kāi)始利用基因工程手段開(kāi)發(fā)黏膜免疫疫苗，以期達(dá)到進(jìn)一步預(yù)防和控制該病的目的。如， 徐麗麗等構(gòu)建了可表達(dá)PEDV S蛋白COE區(qū)域、SD區(qū)域的減毒沙門氏菌重組疫苗，其包含的 抗原基因長(zhǎng)，菌株穩(wěn)定性越差，同時(shí)其包含crp毒力基因，安全性難以保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的重組菌株。
[0007] 本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌在制備預(yù)防豬流 行性腹瀉疾病的藥物中的用途。
[0008] 目的基因 S499_789核昔酸序列（SEQ ID NO :1):
[0009] Gttactttgccatcat ttaatgatca ttcttttgtt aatattactg tctctgcggc ttttggtggt
[0010] cttagtagtg ccaatctcgt tgcatctgac actactatca atgggtttag ttctttctgt
[0011] gttgacacta gacaatttac cattacactg ttttataatg ttacaaacag ttatggttat
[0012] gtgtctaaat cacaggatag taattgtcct ttcaccttgc aatctgttaa tgattacctg
[0013] tcttttagca aattttgtgt ttcaaccagc cttttggctg gtgcttgtac catagatctt
[0014] tttggttacc ctgcgttcgg tagtggtgtt aagttgacgt ccctttattt tcaattcaca
[0015] aaaggtgagt tgattactgg cacgcctaaa ccacttgaag gtatcacaga cgtttctttt
[0016] atgactctgg atgtgtgtac caagtatact atctatggct ttaaaggtga gggtattatt
[0017] acccttacaa attctagcat tttggcaggt gtttattata catctgattc tggacagttg
[0018] ttagccttta agaatgtcac tagtggtgct gtttattctg tcacgccatg ttctttttca
[0019] gagcaggctg catatgttaa tgatgatata gtgggtgtta tttctagttt gtctaactcc
[0020] acttttaaca atactaggga gttgcctggt ttcttctacc attctaatga cggctccaat
[0021] tgtacagagc ctgtgttggt gtatagtaac ataggtgttt gtaaatctgg cagtattggc
[0022] tatgttccat ctcagtatgg ccaagtcaag attgcaccca cggttactgg gaatattagt
[0023] attcccacca actttagtat gagtatt
[0024] 對(duì)應(yīng)的 S499_789氨基酸序列（SEQ ID NO :2):
[0025] VKLVKAKARGPRQAGICEVRYTSLVVGSTTKVVSKRVENANVNLVVVDEDVTLNTTGRTVVVDGLAFFE SDGFYRHLADADWIEHPVYKSACELKPVroCDPIPDFPLPVAASVAELCVQTDLLLKNYNTPYKTYSCWRGDKCC ITCTLQFKAPSYVEDAVNFVDLCTKNIGTAGFHEFYITAHEQQDLQGFLTTCCTMSGFECFMPTIPQCPAVLEEIDG GSIWRSFITGLNTMWDFCKRLKVSFGLDGIVVTVARKFKRLGALLAEMYNTYLSTVVENLVLAGVSFK
[0026] 優(yōu)選地，所述重組沙門氏菌包含攜帶有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的重組 pVAXl質(zhì)粒。
[0027] 其中，所述藥物包含致免疫有效量的重組沙門氏菌。
[0028] 本發(fā)明疫苗它是由包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌和藥學(xué)上可 接受的輔料或者載體制備而成。
[0029] 優(yōu)選地，所述重組沙門氏菌包含攜帶有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列的重組 pVAXl質(zhì)粒。
[0030] 優(yōu)選地，所述的輔料或者載體為免疫佐劑和/或防腐劑。
[0031] 優(yōu)選地，所述佐劑為霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素或大腸桿菌不耐熱腸毒素 B 單位。
[0032] 優(yōu)選地，所述防腐劑為硫柳汞。
[0033] 前述的疫苗在制備預(yù)防豬流行性腹瀉疾病的藥物中的用途。
[0034] 優(yōu)選地，所述的防豬流行性腹瀉疾病的藥物是口服制劑，通過(guò)口服的方式給藥。
[0035] 在研究過(guò)程中，發(fā)明人根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇S蛋白的第499-789段基因片段，制備得到了 免疫原性非常強(qiáng)的重組菌株，其產(chǎn)生的針對(duì)豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA抗體高于滅活 疫苗，可以有效預(yù)防豬流行性腹瀉疾病，取得了意料不到的技術(shù)效果。
[0036] 本發(fā)明重組沙門氏菌免疫豬后，可以產(chǎn)生大量針對(duì)豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA 抗體，對(duì)豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉疾病有良好的保護(hù)作用，本發(fā)明疫苗中包含的 SEQ ID N0:1所示核苷酸序列短，穩(wěn)定性好，不包含crp毒力基因，安全性好，臨床應(yīng)用前景 優(yōu)良。
[0037] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖 I S499_789基因擴(kuò)增。M :DNA Marker III ;1，2S 499_789基因擴(kuò)增；
[0039] 圖 2 pMD19-T-S499_789的鑒定。M :DNA Marker III ;1:S 499_789基因擴(kuò)增； 2:pMD19-T-S499