Fviii的位點定向修飾的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2005年11月14日、申請?zhí)枮?01310125428. 4、發(fā)明名稱為 "FVIII的位點定向修飾"的PCT申請的分案申請。
[0002] 與相關(guān)申請的交叉參考
[0003] 本申請要求享有2004年11月12日提交的美國專利申請系列號60/627, 277的優(yōu) 先權(quán)利益，其在運里整體引作參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及因子VIII(FVIII)突變蛋白，其允許在確定的位點偶聯(lián)一個或多個生 物相容的聚合物如聚乙二醇。另外，提供了用于治療目的的相關(guān)的制劑、其劑量及施用方 法。運些修飾的FVHI變體和相關(guān)的組合物和方法用于給遭受血友病A的個體提供具有減 少的注射頻率和減少的免疫原性應(yīng)答的治療選擇。
【背景技術(shù)】
[0005] 血友病A是最常見的遺傳性凝結(jié)障礙，估計的發(fā)病率為1/5000男性。它的原因是 FVIII的缺乏或結(jié)構(gòu)缺陷，所述FVIII是血液凝結(jié)的固有途徑中的關(guān)鍵組分。目前血友病A 的治療包含靜脈內(nèi)注射人FVIII。已經(jīng)重組地生產(chǎn)了人FVIII，作為約300kD的單鏈分子。 它由結(jié)構(gòu)域A1-A2-B-A3-C1-C2 組成燈hompson，2003,Semin.Hematol.29,卵.11-22)。前 體產(chǎn)物在高爾基體中被加工成200kD(重鏈）和80kD(輕鏈）的2條多膚鏈，運2條鏈通過 金屬離子結(jié)合到一起化aufman等，1988，J.Biol.Qiem. 263,P.6352;Andersson等，1986， Proc.化tl.Acad.Sci. 83,p. 2979)。
[0006]FVIII的B-結(jié)構(gòu)域似乎是可有可無的，因為還已經(jīng)顯示B-結(jié)構(gòu)域缺失的 FVIII度DD，90kDA1-A2重鏈+80kD輕鏈）可W有效地用作血友病A的替補療法。B-結(jié)構(gòu) 域缺失的FVIII序列含有B-結(jié)構(gòu)域的14個氨基酸W外的所有缺失。
[0007] 目前，通過根據(jù)需要靜脈內(nèi)施用FVHI來治療血友病A患者，或者作為預(yù)防療法每 周施用幾次。關(guān)于預(yù)防治療，每周施用15-25IU/kg體重的因子VIII3次?；颊呖偸切枰?因為它在人中的半衰期短，所W必須頻繁地施用FVIII。盡管全長蛋白具有大于300kD的大 尺寸，但。￥111具有僅約11小時的人中的半衰期巧*611316；[]1等，2004,56111；[]1.化111曰1:〇1.41， PP. 1-16)。對頻繁的靜脈內(nèi)注射的需要造成患者順應(yīng)性的巨大障礙。如果可W開發(fā)具有更 長的半衰期且因而需要更低頻率的施用的FVHI產(chǎn)物，則會更方便患者。另外，如果提高了 半衰期，那么由于需要更低的劑量，可W降低治療費用。
[0008] 現(xiàn)有療法的另一個缺點是，約25-30%患者發(fā)展抑制FVIII活性的抗體（Saenko 等，2002,化emo地ilia8,PP. 1-11)。抑制性抗體的主要表位定位于A2結(jié)構(gòu)域中的殘基 484-508、A3結(jié)構(gòu)域中的殘基1811-1818和C2結(jié)構(gòu)域?？贵w發(fā)展阻止FVIII作為替補療法 的應(yīng)用，迫使該組患者尋求使用高劑量重組因子Vila的甚至更昂貴的治療和免疫耐受療 法。
[0009] 下面的研究鑒別出了抑制性抗體的FVIII表位。在25份抑制性血漿樣品的研究 中，發(fā)現(xiàn)11份結(jié)合凝血酶產(chǎn)生的73kD輕鏈片段A3C1C2,4份結(jié)合A2結(jié)構(gòu)域，且10份結(jié)合 二者（Rilcher，C.等，1985,Proc.化tl.Acad.Sci. 2(22)，PP. 7728-32)。在另一項研究中， 重組A2多膚中和了 8種來自患者的A2結(jié)構(gòu)域抑制劑中的6種（Scandella，化等，1993， Blood82化），PP. 1767-75)。將9種來自患者的抑制劑中的6種的表位作圖到A2殘基 379-538 (Scandella，D.等，1988,Proc.化tl.Acad.Sci. 85 (16)，PP. 6152-6)。18 種重鏈抑 制劑的表位定位于相同的A2結(jié)構(gòu)域N-末端18. 3kD區(qū)域（Scandella，化等，1989,Blood 74(5)，pp. 1618-26)。
[0010] 通過用同源豬序列替代人A2結(jié)構(gòu)域殘基387-604產(chǎn)生的有活性的重組雜種人 / 豬FVIII分子，對患者A2 抑制劑是抗性的（Lubin，I.等，1994,J.Biol.Chem. 269(12)， PP.8639-41)，且對與患者A2抑制劑競爭結(jié)合A2的鼠單克隆抗體mAB413IgG是抗性的 (Scandella，D.等，1992，1"虹ombHaemost. 67(6)，PP. 665-71)。當(dāng)實驗表明mAB413IgG 和4種患者抑制劑不抑制其中用豬序列替代A2結(jié)構(gòu)域殘基484-508的雜種人/豬FVIII 時，該A2結(jié)構(gòu)域表位進一步定位于A2結(jié)構(gòu)域殘基484-508Ofealey，J.等，1995,J.Biol. 化em. 270 (24)，pp. 14505-9)。該雜種FVHI還對篩選的23份患者血漿的至少一半是更高抗 性的度arrow,R.等，2000,Blood95(2)，PP. 564-8)。丙氨酸掃描誘變鑒別的殘基487對結(jié) 合測試的所有5種患者抑制劑都是關(guān)鍵的，而殘基484、487、489和492對于與mAB413IgG 的相互作用都是重要的（Lubin，I.，J.Biol.Chem. 272 (48)，PP. 30191-5)。在接受R484A/ R489A/P492A突變體（而不是R484A/R489A突變體）的小鼠中的抑制性抗體效價，顯著低于 接受對照人抓DFVIII的小鼠（Parker，E.等，2004，Blood104(3)，pp.704-10)?？傊?，A2 結(jié)構(gòu)域的484-508區(qū)域似乎是FVIII活性的抑制劑的結(jié)合位點。
[0011] 除了發(fā)展對FVIII的免疫應(yīng)答W外，常規(guī)療法的另一個問題是，其需要頻繁的給 藥，因為FVIII的體內(nèi)半衰期短。已經(jīng)研究了從循環(huán)清除FVIII的機理。
[001引從循環(huán)清除FVIII，已部分地歸因于向低密度脂蛋白受體-相關(guān)蛋白化RP) 的特異性結(jié)合，所述LRP是具有廣泛配體特異性的肝清除受體（Oldenburg等，2004， 化emo地ilialOSu卵1 4,卵.133-139)。最近，還表明低密度脂蛋白（LDL)受體在FVIII清 除中起作用，如通過與LRP協(xié)同調(diào)節(jié)FVIII的血漿水平度ovenschen等，2005,Blood106， PP.906-910)。兩種相互作用都被結(jié)合細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖化SPG)所促進。當(dāng)LRP 被封閉時，可W使在小鼠中的血漿半衰期延長3. 3倍，或者當(dāng)LRP和細胞表面HSPG都被 封閉時，可W延長 5.5 倍（Sarafanov等，2001，J.Biol.Chem. 276,卵.11970-11979)。推 測服PG將FVm集中在細胞表面上，并將其呈遞給LRP。FVm上的LRP結(jié)合位點已經(jīng)被 定位在A2 殘基 484-509(Saenko等，1999,J.Biol.Chem. 274,卵.37685-37692)、A3 殘基 1811-1818 度ovenschen等，2003,J.Biol.Chem. 278,PP. 9370-9377)和C2 結(jié)構(gòu)域中的表位 (Xenting等，1999,J.Biol.Qiem. 274,PP. 23734-23739)。
[001引通過蛋白酶的作用，也可W將FVIII從循環(huán)中清除。為了理解該作用，人們必須理 解FVIII參與血液凝結(jié)的機理。FVIII作為結(jié)合vWF的重鏈和輕鏈的異源二聚體而循環(huán)。 VWF結(jié)合包含F(xiàn)VIII殘基 1649-1689 (化ster等，1988,J.Biol.Chem. 263,PP. 5230-5234) 和Cl(Jacquemin等，2000,Blood96,PP. 958-965)和C2 結(jié)構(gòu)域（Spiegel,P.等，2004， J.Biol.化em. 279巧1)，PP. 53691-8)的部分。FVin被凝血酶激活，該凝血酶切割殘基372、 740和1689之后的膚鍵，W產(chǎn)生A1、A2和A3-C1-C2結(jié)構(gòu)域的異源S聚體（Pittman等，2001， Proc.化tl.Acad.Sci. 276,pp. 12似4-12439)。激活后，F(xiàn)VIII從vWF解離，并通過結(jié)合憐 月旨，集中在血小板細胞表面。憐脂結(jié)合包含F(xiàn)VIII殘基2199、2200、2251和2252(Gnbed 等，2002,J.Biol.Chem. 277,PP. 6374-6381)。在運里，它通過與FVIII殘基 558-565(Fay 等，1994,J.Biol.Chem. 269,PP. 20522-20527)和 1811-1818 化enting等，1996,J.Biol. Chem. 271，pp. 1935-1940)的相互作用，結(jié)合FIX,并通過與FVIII殘基 349-372(Nogami等， 2004,J.Biol.Chem. 279,PP. 15763-15771)的相互作用，結(jié)合FX，并作為FX的FIX激活的 輔因子，所述FX是內(nèi)源性凝結(jié)途徑的基本組分。激活的FVIII(FVIIIa)受到蛋白酶激活的 蛋白C(APC)的部分滅活，運通過在FVIII殘基336和562后面的切割來實現(xiàn)巧egan等， 1996,J.Biol.Chem. 271，PP. 3982-3987)。但是，滅活的主要決定因素是A2結(jié)構(gòu)域從A1和 A3-C1-C2 解離（Fay等，1991，J.Biol.Chem. 266,PP. 8957-8962)。
[0014] 已經(jīng)證實增加蛋白的體內(nèi)半衰期的一種方法是PEG化（PEG^ation)。PEG化是長 鏈聚乙二醇（PEG)分子向蛋白或其它分子的共價附著。PEG可W是線性形式或分支形式，W產(chǎn)生具有不同特征的不同分子。除了增加膚或蛋白的半衰期W外，PEG化已經(jīng)用于減少抗 體發(fā)展，保護蛋白免受蛋白酶消化，和保持材料在腎濾液的外面（Harris等，2001，Clinical 化armacokinetics40，pp. 539-51)。另外，PEG化也可W增加蛋白的總穩(wěn)定性和溶解度。最 后，PEG化蛋白的持續(xù)的血漿濃度，可W通過減少藥物的低谷至頂點水平降低不利的副作用 的程度，從而消除對在早期時間點引入超生理水平的蛋白的需要。
[001引通過用大聚合物（如PEG和葡聚糖）祀向伯胺（N-末端和賴氨酸）來隨機修 飾FVIII的嘗試，已經(jīng)取得不同程度的成功（W094/15625、美國專利4970300、美國專 利6048720)。在1994年專利申請（W094/15625)中公開的最顯著的提高，顯示了4倍 半衰期提高，但是代價是，在全長FVIII與50倍摩爾過量的PEG反應(yīng)后，喪失2倍活性。 W02004/075923公開了通過隨機修飾生成的FVHI和聚乙二醇的綴合物。在過去，已經(jīng)批準(zhǔn) 隨機地陽G化的蛋白如干擾素a0(0zlowski等，2001，BioDrugs15, PP.419-429)用作治 療劑。
[0016] 但是，對于異源二聚體的FVIII，該隨機方案更容易出問題。FVIII具有數(shù)百個潛 在的陽G化位點，包括158個賴氨酸，2個N-末端和多個組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸， 它們都可能被主要祀向伯胺的試劑陽G化。例如，顯示陽G化的干擾素a-化的主要位置異 構(gòu)體是組氨酸（Wang等，2000,Biochemist巧39,卵.10634-10640)。此外，全長FVIII的不 均勻加工，可W導(dǎo)致原材料的混合物，運導(dǎo)致PEG化的產(chǎn)物的進一步復(fù)雜性。不控制FVIII 上的陽G化位點的另一個缺點是，如果PEG附著在關(guān)鍵的活性位點處或附化尤其是如果超 過一個PEG或單個大PEG綴合到FVIII上，那么潛在的活性降低。因為隨機的PEG化總是 產(chǎn)生大量多重PEG化的產(chǎn)物，所W僅僅得到單-PEG化的產(chǎn)物的純化會急劇降低總得率。最 后，產(chǎn)物概況的巨大異質(zhì)性使每批的一致合成和表征幾乎不可能。因為良好生產(chǎn)需要一致 的、充分表征的產(chǎn)品，所W產(chǎn)物異質(zhì)性是商業(yè)化的屏障。鑒于所有運些原因，需要更特異性 的PEG化FVIII的方法。
[0017]在近期的綜述中（Kochendoerfer，G.，Qirr.Opin.Qiem.Biol. 2005,可在線W Oct. 15,2005,directobjectidentifierdoi: 10. 1016/i.cbpa. 2005. 10. 007得到），已經(jīng) 總結(jié)了各種位點定向蛋白PEG化策略。一種方法包含，通過化學(xué)合成或重組表達，將非天然 氨基酸滲入蛋白，隨后添加將與非天然氨基酸特異性地反應(yīng)的PEG衍生物。例如，非天然氨 基酸可W是含有不存在于天然蛋白中的酬基的氨基酸。但是，蛋白的化學(xué)合成對于如FVIII運樣大的蛋白不可行。目前膚合成的界限是約50個殘基?？蒞連接幾個膚，W形成更大的 多膚片，但是生產(chǎn)甚至B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII，會需要超過20次連接，運會導(dǎo)致小于1 %回 收，甚至在理想的反應(yīng)條件下。迄今為止，含有非天然氨基酸的蛋白的重組表達主要限于非 哺乳動物表達系統(tǒng)。對于需要在哺乳動物系統(tǒng)中表達的大且復(fù)雜的蛋白如FVIII，預(yù)期該方 法有問題。
[0018] 蛋白的位點特異性的陽G化的另一種方法是，用陽G-醒祀向N-末端主鏈胺。在 該方法中需要低抑來實現(xiàn)超過其它胺基團的特異性。但是，運與FVIII的穩(wěn)定性所需的 狹窄的接近中性的抑范圍不相容（Wang等，2003，InternationalJ.F^harmaceutics259， pp. 1-15)。此外，F(xiàn)VIII的N-末端PEG化不會導(dǎo)致提高的血漿半衰期，如果該區(qū)域不參與血 漿清除的話。實際上，F(xiàn)VHI輕鏈的N-末端區(qū)域已經(jīng)參與結(jié)合vonWillebrand因子（vWF)， 后者是對FVin在循環(huán)中的存活至關(guān)重要的載體蛋白。通過因子VIII的N-末端修飾，可W 破壞或減弱與vWF的至關(guān)重要的結(jié)合。因而，F(xiàn)VIII的N-末端PEG化可能具有降低FVIII 的血漿半衰期的相反作用。
[0019]W090/12874公開了人IL-3、粒細胞集落刺激因子和促紅細胞生成素多膚的位點 特異性的修飾，運如下實現(xiàn)：插入半脫氨酸，或用半脫氨酸替代另一種氨基酸，然后加入具 有琉基反應(yīng)基團的配體。該配體選擇性地偶聯(lián)半脫氨酸殘基。沒有公開FVIII或其任何變 體的修飾。
[0020] 鑒于上述原因，仍然需要具有更大的體內(nèi)作用持續(xù)時間和降低的免疫原性、同時 保持功能活性的改良的FVIII變體。此外，希望W-致的方式將運樣的蛋白生產(chǎn)為均質(zhì)產(chǎn) 物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明的一個目的是，提供生物相容的聚合物-綴合的功能性FVIII多膚，其具有 提高的藥物代謝動力學(xué)特性和治療特性。
[0022] 本發(fā)明