巖藻多糖在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致雄性生殖毒性的藥物中的應(yīng)用
【專利說明】巖藻多糖在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致雄性生殖毒性的藥物 中的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及涉及巖藻多糖的應(yīng)用，具體涉及巖藻多糖在制備預(yù)防與治療因有機(jī)磷 農(nóng)藥所致雄性生殖毒性疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 有機(jī)磷農(nóng)藥（OPs)是一類高效、低殘留的農(nóng)藥，已經(jīng)成為當(dāng)今中國使用的最廣譜農(nóng) 藥。有機(jī)磷農(nóng)藥的使用為農(nóng)、林、漁業(yè)的增產(chǎn)豐收立下了汗馬功勞，但隨著有機(jī)磷農(nóng)藥的廣 泛使用，其在蔬菜水果等食物中的殘留現(xiàn)象也較為普遍。雖然大多數(shù)人已經(jīng)注意預(yù)防有機(jī) 磷農(nóng)藥的急性中中毒，但有機(jī)磷農(nóng)藥的長期、低劑量、慢性暴露對(duì)人類健康的影響，尤其是 對(duì)男性生殖力影響，還未引起人們的足夠重視。
[0004] 有機(jī)磷農(nóng)藥具有生殖毒性，對(duì)男性生殖系統(tǒng)的影響更為顯著。國內(nèi)外流行病 學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在長期遭受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的地區(qū)或者農(nóng)藥廠的工人，男性精子的數(shù)量和 質(zhì)量均受到影響，造成精子數(shù)量減少、精子存活率和活動(dòng)度下降、精子畸形率增加，最終 導(dǎo)致男性不育人數(shù)明顯增多（Recio-Vega R，Ocamp〇-G0mez G，Bor ja-Aburto VH，et al. Organophosphorus pesticide exposure decreases sperm quality: association between sperm parameters and urinary pesticide levels. J Appl Toxicol,2008 Jul， 28 (5) :674-680.)。我們和國內(nèi)外多位學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)雄性生殖生殖系統(tǒng)具 有損傷作用，有機(jī)磷農(nóng)藥可直接作用于睪丸、附睪、前列腺、精囊等組織，破壞其結(jié)構(gòu)，最終 導(dǎo)致男性生殖力的下降（Koureas M，Tsakalof A，Tsatsakis A，et al. Systematic review of biomonitoring studies to determine the association between exposure to organophosphorus and pyrethroid insecticides and human health outcomes. Toxicol Lett，2011 Oct 15.)。因此探討有機(jī)磷農(nóng)藥的雄性生殖毒性作用機(jī)制，尋找有效的干預(yù)藥 物，對(duì)于保護(hù)我國人民的身體健康及優(yōu)生優(yōu)育至關(guān)重要。
[0005] 巖藻多糖（Fucoida)又稱褐藻糖膠、巖藻多糖硫酸酯，是存在于所有褐藻中的一 種水溶性雜多糖。大量科學(xué)研究表明，巖藻多糖具有廣泛的生理生化活性，巖藻多糖具有雙 向調(diào)節(jié)免疫力，可清除自由基，抗衰老，抗凝血和抗血栓，抗腫瘤和抗病毒，可消除胃腸系統(tǒng) 紊亂，抗過敏，增強(qiáng)肝功能，降低高血脂和高血壓，穩(wěn)定血糖水平，并具有促進(jìn)肌膚再生、皮 膚保濕等多種生理功效。巖藻多糖無任何毒副作用，可以長期服用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供巖藻多糖在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致雄性生殖力損傷方 面的藥物新用途。
[0007] 具體的說，本發(fā)明涉及巖藻多糖在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致雄性生殖毒性的藥物 中的應(yīng)用。
[0008] 此外，還涉及巖藻多糖在制備預(yù)防與治療因有機(jī)磷農(nóng)藥所雄性生殖毒性誘發(fā)的疾 病的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 其中所述疾病為因有機(jī)磷農(nóng)藥所致的雄性生殖毒性疾病，主要包括：精子數(shù)量降 低、精子活動(dòng)性下降、變性精子數(shù)量增多、精液減少、精子畸形率升高、睪丸疾病等。
[0010] 本發(fā)明所述有機(jī)磷農(nóng)藥為久效磷、辛硫磷、對(duì)氧磷、三唑磷等常用有機(jī)磷農(nóng)藥。
[0011] 本發(fā)明所屬藥物是指以巖藻多糖為主要活性成分，與可藥用載體制成的醫(yī)療上可 接受的制劑，如片劑、丸劑或膠囊劑等。
[0012] 本發(fā)明通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：服用巖藻多糖可達(dá)到防治低濃度有機(jī)磷農(nóng)藥所致 雄性生殖毒性的效果，巖藻多糖的治療有效量，應(yīng)按照治療者的年齡、身體狀況、接觸有機(jī) 磷農(nóng)藥量等確定。
[0013] 本發(fā)明所述的巖藻多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，能起到抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗凝 血、抗過敏等作用，并且目前尚未發(fā)現(xiàn)其有任何毒副作用。巖藻多糖可以通過市售得到，也 可以通過多種方法提取獲得，提取方法成熟。
[0014] 本發(fā)明人以高毒有機(jī)磷農(nóng)藥久效磷和低毒有機(jī)磷農(nóng)藥辛硫磷為代表，研究了低濃 度有機(jī)磷農(nóng)藥的雄性生殖毒性作用，發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的雄性生殖毒性作用主要是引起雄性 小鼠睪丸臟器系數(shù)和附睪臟器系數(shù)下降；精子數(shù)量減少、精子活率降低、精子畸形率增加； 誘導(dǎo)睪丸組織CAT活性和LDH活性降低、MDA含量增加，睪丸組織氧化損傷，從而引起如精 子數(shù)量降低、精子活動(dòng)性下降、變性精子數(shù)量增多、精液減少、生殖器畸變、睪丸疾病、男性 不孕等一系列疾病。
[0015] 本發(fā)明通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)雄性小鼠的生殖毒性作用，以及巖藻多 糖對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥雄性生殖毒性的抑制作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖能抑制(如久效磷和辛硫 磷）有機(jī)磷農(nóng)藥所致的雄性小鼠睪丸臟器系數(shù)和附睪臟器系數(shù)下降；精子數(shù)量減少、精子活 率降低、精子畸形率增加；睪丸組織CAT活和LDH活性降低、MDA含量增加，睪丸組織氧化損 傷；巖藻多糖能抑制有機(jī)磷農(nóng)藥的雄性生殖毒性，有較好的劑量依賴性。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于： 1. 本發(fā)明提供了有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)雄性生殖毒性作用的直接證據(jù)，并以此尋找有效的干預(yù) 藥物。 2. 本發(fā)明提供了巖藻多糖的醫(yī)藥新用途，其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥引起的雄性生殖毒性具有很 好的抑制和保護(hù)作用。巖藻多糖能抑制有機(jī)磷農(nóng)藥(如久效磷和辛硫磷)所致的雄性小鼠睪 丸臟器系數(shù)和附睪臟器系數(shù)下降；精子數(shù)量減少、精子活率降低、精子畸形率增加；睪丸組 織CAT活和LDH活性降低、MDA含量增加啊，睪丸組織氧化損傷；巖藻多糖能抑制有機(jī)磷農(nóng) 藥的雄性生殖毒性，有較好的劑量依賴性。
[0017] 3.本發(fā)明對(duì)長期接觸有機(jī)磷農(nóng)藥的人尤其是農(nóng)藥廠的工人和農(nóng)民具有深遠(yuǎn)的意 義，能起到保護(hù)男性及其子代身體健康、提高生活質(zhì)量、降低不孕不育、優(yōu)生優(yōu)育、延長壽命 等作用。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明中巖藻多糖的醫(yī)藥新用途及其有益效果，但 不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0019] 試驗(yàn)例1 :巖藻多糖抑制久效磷所致雄性生殖毒性的試驗(yàn)研究 1材料與方法 1. 1材料 久效磷（40%的水溶性制劑，青島農(nóng)藥廠)，巖藻多糖（中國海洋大學(xué)提供)，過氧化氫酶 (CAT)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH)試劑盒和丙二醛（MDA)試劑盒均購自南京建成生物公司。
[0020] 1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇健康SPF級(jí)雄性昆明小鼠90只，體重在（25 ± 2 ) g之間，購自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫（25±2) °C，濕度50%-55%。
[0021] 將小鼠隨機(jī)分為6組，每組15只。分別為正常對(duì)照組（A)、巖藻多糖對(duì)照組（B)、久 效磷對(duì)照組（C)、巖藻多糖低劑量保護(hù)組（D)、巖藻多糖中劑量保護(hù)組（E)、巖藻多糖高劑量 保護(hù)組（F)。其中對(duì)照組(A)不給藥，給予蒸餾水，巖藻多糖對(duì)照組（B)給予巖藻多糖I g/ kg，久效磷對(duì)照組（C)給予0.20 mg/kg，巖藻多糖低劑量保護(hù)組（D)給予巖藻多糖0.5 g/ kg+久效磷0.20 mg/kg，巖藻多糖中劑量保護(hù)組（E)給予巖藻多糖I g/kg+久效磷0.20 mg/ kg，巖藻多糖高劑量保護(hù)組（F)給予巖藻多糖2 g/kg+久效磷0.20 mg/kg。并保證充足的 飲水和飼料供應(yīng)。在連續(xù)60d采用灌胃方式進(jìn)行染毒，染毒劑量為10 ml/kg，每天1次。
[0022] 1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以1±8進(jìn)行表示，多組間 比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析（One Way AN0VA)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較時(shí)， 若方差齊時(shí)，采用SNK檢驗(yàn)；若方差不齊時(shí)，采用Games-Howell檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均 以率表示，組間兩兩比較采用X 2檢驗(yàn)。以P〈0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0023] 2方法與結(jié)果 染毒60天后，稱量體重，處死小鼠，立即取出雙側(cè)睪丸及附睪，剝離周圍脂肪組織和結(jié) 締組織準(zhǔn)確稱量睪丸和附睪的重量，計(jì)算睪丸及附睪的臟器系數(shù)；將雙側(cè)附睪置于盛有生 理鹽水的培養(yǎng)皿中剪碎，制備精子懸液。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)上述精子懸液中的精子數(shù)， 并換算為每克附睪精子數(shù)；取混勻的精子懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片于光鏡下觀察 精子活動(dòng)力，按WHO推薦的方法，按精子的泳動(dòng)狀態(tài)將精子活動(dòng)度分為四級(jí) ：I級(jí)：直線運(yùn) 動(dòng)明顯活躍，活動(dòng)良好；II級(jí)：直線運(yùn)動(dòng)，活動(dòng)稍差；III級(jí)：精子向前移動(dòng)的能力差，在原處 移動(dòng)或作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)；IV級(jí)：精子無任何活動(dòng)，每只至少檢查400個(gè)精子，計(jì)算精子活率(精子 活率=I + II + III級(jí)精子數(shù)/ I + II + III + IV級(jí)精子數(shù)X 100%);將部分精子懸液作涂片， 空氣干燥后，用甲醇固定5min，干燥后用2%伊紅水溶液染色I(xiàn)h，用水輕沖，干燥，在光鏡下， 每只小鼠檢查至少檢查400個(gè)精子，記錄精子的畸形類型和數(shù)量，凡精子輪廓不清，有頭無 尾，或頭部與其它精子或碎片重疊，或兩個(gè)以上精子重疊，或明顯屬人為剪碎者均不計(jì)算， 畸形類型主要分為：無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、尾折疊、雙頭、雙尾等，畸形率以百分率表 示（％);取睪丸組織加入適量的冰生理鹽水，在冰浴條件下用玻璃勻漿器研磨制成睪丸組織 勻漿，然后在低溫（4°C )條件下以2000rpm，離心10min，靜置片刻，取上清液，參照試劑盒說 明書，檢測(cè)睪丸勻漿液中CAT、LDH活性和MDA含量。
[0024] 表1巖藻多糖對(duì)久效磷所致小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)下降的保護(hù)作用（n=15)
注：與A組比較：*P〈0. 05,與C組比較：Λ P〈0. 05。
[0025] 表1顯示，與正常對(duì)照組（A)相比，久效磷對(duì)照組（C)睪丸臟器系數(shù)和附睪臟器 系數(shù)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈〇. 05)。巖藻多糖保護(hù)組能抑制久效磷染毒引起的小 鼠睪丸臟器系數(shù)和附睪臟器系數(shù)下降，以巖藻多糖高劑量保護(hù)組（F)作用最顯著，巖藻多 糖高劑量保護(hù)組（F)睪丸臟器系數(shù)和附睪臟器系數(shù)，與久效磷對(duì)照組（