一種提高蛋白血清半衰期的組合物和方法
【專利說明】一種提高蛋白血清半衰期的組合物和方法 發(fā)明背景
[0002]候選藥物的藥代動(dòng)力學(xué)是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，經(jīng)常在很大程度上決定是否候選藥物將 被進(jìn)一步發(fā)展成藥物，或用于治療性應(yīng)用。針對(duì)蛋白質(zhì)類或多肽類藥物，包括抗體的藥代動(dòng) 力學(xué)研究已經(jīng)表明，這樣的治療劑具有完全不同的血清半衰期。那些多肽類和蛋白質(zhì)類藥 物一般具有短的血清半衰期，盡管可能具有治療潛力，但往往不適合進(jìn)一步的藥物開發(fā)。例 如，白蛋白和γ-免疫球蛋白（IgG)已知具有的長達(dá)20天[1]的血清半衰期。此外，其他的IgG 的Fc結(jié)構(gòu)域可以被工程化以改變它們與新生兒Fc受體的結(jié)合相互作用，達(dá)到延長血清半衰 期的方法[2]。然而，許多其他天然人蛋白質(zhì)，如胰島素，抗體片段，例如抗原結(jié)合片段(Fab 的）或單鏈可變片段(scFv)，以及短肽通常具有更短的血清半衰期，從數(shù)分鐘到大約只需1 小時(shí)。因此，一種高效，低廉和安全的延長蛋白質(zhì)和多肽這些分子血清半衰期的方法對(duì)于這 類分子成為治療性藥物、診斷工具等是至關(guān)重要的。
[0003]目前已經(jīng)有幾種策略被開發(fā)用于延長蛋白質(zhì)和其他肽分子較短的半衰期，以避免 治療或診斷的蛋白質(zhì)因半衰期短被從體內(nèi)清除。這幾個(gè)用于促進(jìn)蛋白質(zhì)和多肽分子的血清 半衰期延長的技術(shù)，包括化學(xué)修飾，如聚乙二醇（即PEG化）[3]，融合抗體Fc區(qū)[4]，或者是和 天然具有長血清半衰期的蛋白質(zhì)進(jìn)行融合，如白蛋白[5]。不幸的是，這些技術(shù)遭受易引起 并發(fā)癥，復(fù)雜的制造和鑒定工藝，低表達(dá)水平，可能產(chǎn)生的不希望的分子功能等問題的困 擾。
[0004] 最近一種采用使用抗血清蛋白抗體片段延長蛋白質(zhì)和其它肽分子的血清半衰期 的方法被開發(fā)出來。白蛋白，主要是由于它的高血清濃度和長血清半衰期，一直是最適合選 定用于此目的?？谷税椎鞍讍斡蚩贵w在和IFN-a2b兩個(gè)分子在基因水平融合，表達(dá)為融合蛋 白后可延長血清半衰期。[6,7]。新生成的融合蛋白分子的血清半衰期是不僅長于IFN_a2B， 但即使長于白蛋白的融合蛋白和IFN_a2B。
[0005] 駱駝重鏈抗體(HCAbs)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，也稱為VHH或單域抗體（sdAb也被開發(fā) 用于這一目的。例如，針對(duì)人白蛋白一個(gè)sdAb被證明將抗TNFa的sdAb片段的血清半衰期，從 不到一小時(shí)延長至兩天以上[8]。
[0006] 另一種具有長半衰期的血清蛋白是轉(zhuǎn)鐵蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白是血漿糖蛋白，其傳送鐵 離子和具有約3克/升的血清濃度和7-8天的血清半衰期。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種理想的融合 蛋白，用于延長藥代動(dòng)力學(xué)不令人滿意的肽分子的血清半衰期。有研究表明，和轉(zhuǎn)鐵蛋白融 合顯著延長胰高血糖素樣肽1(GLP1)[9]和乙酰膽堿受體[10]的血清半衰期。
[0007] 然而，使用抗體和抗體片段，如抗轉(zhuǎn)鐵蛋白sdAbs，用于增加蛋白類分子的血清半 衰期還未見報(bào)道。新的用于增加蛋白質(zhì)的血清半壽期和用于生產(chǎn)具有改進(jìn)的血清半衰期的 蛋白質(zhì)的方法，高效率，成本優(yōu)越，高產(chǎn)率將有利于新的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的藥物或者診斷試劑 的開發(fā)。本發(fā)明實(shí)例將涉及這樣的方法。 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0008] 本發(fā)明涉及針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體，并且特指針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白的單域抗體(sdAbs)。本發(fā) 明還涉及使用特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗體，在轉(zhuǎn)鐵蛋白存在下增加靶蛋白的半衰期的方 法;包含在轉(zhuǎn)鐵蛋白存在下增加半衰期的靶蛋白的新型融合蛋白；在特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白 的抗體或者融合蛋白的組合物。
[0009] 在總的方面，本發(fā)明涉及一個(gè)分離的抗體或其片段特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白，該抗體 或片段，其包含一種或多種選自下組中選擇： (a) -種互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)l，其包括下列之一的氨基酸序列GSGFGINGVI(SEQ ID NO: I)；GSGFGVNGVI(SEQ ID NO：2)；GNVFTIAAMG(SEQ ID NO：3)；GNVFTIAAMA(SEQ ID N0：4)； GNVFTIDAMG(SEQ ID NO：5)；GSVFSIDAMG(SEQ ID N0：6)；GNVFGIDAVG(SEQ ID N0：7)； GSIFSIKVMG(SEQ ID N0:8);和GSIFPLNDMG(SEQ ID N0:9); (b) -種互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)2,其包括下列之一的氨基酸序列LIKSDGYTNYRESVKG(SEQ ID NO：10)；LIKSDGYTNYRESVRG(SEQ ID NO：11)；GITTGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：12)； GMTNGGKTNYADSVKG(SEQ ID NO：13)；AMTNAGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：14)； ATTTSGSSTNYADSVKG(SEQIDN0:15);DITSGGSTDYSDSVKG(SEQIDN0:16)jP TITRGGTTNYADSVKG(SEQIDN0:17)jP (c) 一種互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)3,其包括下列之一的氨基酸序列PGVP(SEQ ID N0:18); VTKffAARVGGSAEYE(SEQ ID NO：19)；RSKLIATINNPYDY(SEQ ID NO：20)；RSKLIARINNPYEY(SEQ ID N0:21);RPKQATLIRDDY(SEQ ID N0:22);DLGCSGAGSCPDY(SEQ ID N0:23);和DNRVGGSY (SEQ ID N0:24)。
[0010] 抗體或其片段最好是單域抗體，更好地是抗體或抗體片段，其是含SdAb A60219的： QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSGFGINGVIWYRQAPGKQRELVALIKSDGYTNYRESVKGRFTISRDDAKNT VffLQMNALEPEDTGVYYCKTPGVPFGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：26)；A60401: QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEASGNVFTIAAMGWFRQAPGKERELVAGITTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAQNT MYLQMNSLRPEDTAAYSCNAVTKffAARVGGSAEYEYffGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：28)；A69449： QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCVASGSVFSIDAMGWYRQAPGNQRELVAAMTNAGSTNYADSVKGRFTISRDNAENT VYLQMNSLKPEDTAVYYCNARSKLIARINNPYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：56)；A69433： QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGNVFGIDAVGWYRQAPGKQRELVAATTTSGSSTNYADSVKGRFTISRDIAKN TVYLQMDSLKPEDTAVYYCYARPKQATLIRDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:58);或A69447: QVKLEESGGGSVQAGGSLRLSCTGSGSIFPLNDMGWYRQAPGKQRELVATITRGGTTNYADSVKGRFTISRDSNAKN TVYLQMNSLKVEDTAVYYCNMDNRVGGSYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:62)的氨基酸序列。
[0011] 本發(fā)明還涉及到一個(gè)融合蛋白包含本發(fā)明實(shí)施例的抗體或其片段，一個(gè)靶蛋白， 和一個(gè)隨意的linker，其中抗體或其片段可融合到目標(biāo)蛋白質(zhì)的羧基末端或氨基末端， linker也隨意地分割抗體和革巴蛋白。
[0012] 本發(fā)明還涉及一種核酸分子，其包含本發(fā)明實(shí)施例抗體或其片段編碼cDNA或合成 的DNA，或者本發(fā)明實(shí)施例的融合蛋白的核酸編碼序列，相關(guān)表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
[0013] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種提高靶蛋白的半衰期的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施 例，該方法包括： (1) 獲得融合蛋白，其中所述融合蛋白包含抗體或其片段特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白，所述靶 蛋白，和任選的I inker，其中所述抗體或其片段融合于靶蛋白的羧基末端或氨基末端，并且 任選的I inker分離抗體和靶蛋白的羧基末端或氨基末端;和 (2) 使融合蛋白與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，從而相對(duì)于單獨(dú)靶蛋白，增加靶蛋白的半衰期。
[0014] 根據(jù)一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，融合蛋白通過一如下方法獲得： (a) 獲得編碼融合蛋白基因的表達(dá)載體； (b) 將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以得到重組細(xì)胞； (c) 培養(yǎng)重組細(xì)胞，以允許融合蛋白的表達(dá);和 (d) 從重組細(xì)胞獲得所述融合蛋白。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)一般性方面涉及一種組合物，其包含融合蛋白的有效量，其中所 述融合蛋白包含抗體或其片段特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白，靶蛋白，和任選的linker，其中所述抗 體或其片段融合至靶蛋白的羧基末端或氨基末端，和任選的連接體分離抗體和靶蛋白的羧 基末端或氨基末端。該組合物最好還包含轉(zhuǎn)鐵蛋白。
[0016] 本發(fā)明還涉及一種方法，包括根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的組合物和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，從而 增加融合蛋白中靶蛋白的半衰期在。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于提高靶蛋白半衰期的系統(tǒng)，，該系統(tǒng)包括： (1) 一個(gè)表達(dá)載體，包含編碼特異性結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體或其片段的第一個(gè)核苷酸序列， 和任選的編碼linker的第二個(gè)核苷酸序列，其中第一和第二核苷酸序列連接在一起， (2) 宿主細(xì)胞，以及 (3) 轉(zhuǎn)鐵蛋白
[0018] 其它方面，特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將從下面的公開內(nèi)容可以看出，包括本發(fā)明的詳 細(xì)描述及其優(yōu)選實(shí)施方案和所附的權(quán)利要求。 附圖的簡(jiǎn)單說明
[0019] 前面的概述，以及本發(fā)明的以下詳細(xì)描述，結(jié)合附圖來閱讀時(shí)將更好地理解。附圖 中已經(jīng)展示的實(shí)施例是目前首選用于說明本發(fā)明的，然而，應(yīng)該被理解的是，本發(fā)明不限于 所展示在附圖中的實(shí)施例：
[0020] 圖1是人轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫美洲駝后的免疫應(yīng)答曲線。
[0021 ]圖2是19個(gè)分離得到結(jié)合人轉(zhuǎn)鐵蛋白單域抗體(SdAbS)的氨基酸序列的比對(duì);互補(bǔ) 性決定區(qū)（CDR)和構(gòu)架區(qū)（FR)之間用的空間；序列根據(jù)Kabat的編碼方式編號(hào)；示出的sdAb 序列包括A60219(SEQ ID N0:26)，A13152(SEQ ID N0:30)，A12722(SEQ ID N0:34)，A12680 (SEQ ID N0:36)，A12690(SEQ ID N0:38)，A13154(SEQ ID N0:40)，A13146(SEQ ID NO: 42),A13149(SEQ ID NO：44),Al2666(SEQ ID N0：46),A12659(SEQ ID N0：48),A13355(SEQ ID N0：50),A12692(SEQ ID NO：52),A60401(SEQ ID NO：28),A13376(SEQ ID N0：32), A69476(SEQ ID N0:54)，A69449(SEQ ID N0:56)，A69433(SEQ ID N0:58)，A69441(SEQ ID N0:60)4PA69447(SEQIDN0:62);
[0022] 圖3是從大腸桿菌表達(dá)純化單域抗體460219 460401469433 469447和469449聚 丙烯酰胺凝膠檢查圖像，這些抗體的氨基酸序列示于圖2;
[0023]圖4轉(zhuǎn)鐵蛋白sdAbs結(jié)合人轉(zhuǎn)鐵蛋白的表面等離子體共振(SPR)傳感圖；圖4A示出 A60401的在2nM，InM，0.5nM，0.25nM，and 0.125nM條件下SPR傳感圖變化的情節(jié)的底部結(jié) 合；圖 4B示出A60219在不同濃度2nM，InM，0 · 5nM，0 · 25nM，and 0 · 125nM下SPR傳感圖。
[0024] 圖5是轉(zhuǎn)鐵蛋白sdAbs A60401和A60219尺寸排阻色譜法的色譜(SEC)數(shù)據(jù)；
[0025] 圖6示出了轉(zhuǎn)鐵蛋白sdAbs在202納米，208納米和217納米由圓二色性(CD)的測(cè)得 轉(zhuǎn)熱變性曲線圖；圖6A示出A60219的熱變性曲線；圖6B示出A60401的熱變性曲線；圖6C示出 了A69433的熱變性曲線；圖6D顯示A69447的熱變性曲線；圖6E顯示A60449的熱變性曲線；和
[0026] 圖7顯示單獨(dú)人轉(zhuǎn)鐵蛋白，sdAb A60219，sdAb-A60219融合蛋白在Wist