miR-125b 慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種miR?125b 慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明具有明顯的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】
m i R-125b慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種miR-125b慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物的研發(fā)，一直是科研人員長(zhǎng)期的研究課題，尋找一種有 效的藥物是廣大科研人員的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種miR-125b慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中 的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：
[0005] -種miR_125b慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0006] 所述miR-125b慢病毒是miR-125b過表達(dá)慢病毒。
[0007] 本發(fā)明具有明顯的心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說明】
[0008] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0009] 圖1是本發(fā)明慢病毒轉(zhuǎn)染后miR-125b的表達(dá)情況示意圖。
[0010] 圖2是Bcl-2表達(dá)水平示意圖。
[0011] 圖3是bax表達(dá)水平示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 一種miR-125b慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述miR-125b慢病毒是miR-125b過表達(dá)慢病毒。
[0014] 材料與方法
[0015] 2.1研究資料與儀器設(shè)備
[0016] 2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0017]出生2d的Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠，雌雄不拘，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心提供。
[0018] 2.1.2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
[0019] MiR-125b慢病毒表達(dá)載體及陰性對(duì)照載體的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司 完成。
[0020] 2.1.3引物設(shè)計(jì)
[0021] MiR-125b引物包括反轉(zhuǎn)錄特異莖環(huán)（stem-loop)引物及實(shí)時(shí)熒光定量PCR上下游 引物。由上海睿安生物科技有限公司合成。
[0022] 2.1.4主要試劑
[0023]胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA(美國(guó)Corning 公司）；RNA Master SYBR Green I(瑞士Roche公司）；Bax抗體、Bcl_2抗體、GAFOH抗體（德國(guó) SIGMA公司）；碘化丙啶(PI)、RNase A(南通碧云天生物技術(shù)研究所）；凋亡試劑盒(美國(guó)BD公 司）；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司）；0pti_MEM Reduced Serum Medium(美國(guó)Gibco公司）； 四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Amresco公司）；二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)sigma公司）
[0024] 2.1.5主要儀器
[0025] FastStart Universal SYBR Green Master(瑞士Roche公司）；高速冷凍離心機(jī) (日本Hitachi公司）；紫外分光光度計(jì)(德國(guó)IimPlen公司）；7500 Real Time PCR儀（美國(guó) ABI公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Life Technologies公司）；PTC-2000核酸擴(kuò)增儀、Light cycler定量PCR擴(kuò)增儀、Allergra TM64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Backman-Coulter公司）；細(xì) 胞培養(yǎng)設(shè)備(恒溫培養(yǎng)箱、溫控?fù)u床、C02培養(yǎng)箱）；核酸蛋白紫外測(cè)定儀、U-0080D核酸紫外 檢測(cè)儀、DolPhin-Doc凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Wealtec公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）；Bi〇-Rad Model 550酶標(biāo)儀、THZ-C恒溫振蕩儀等；可控溫水浴鍋(上海電 理儀器廠）；TDL80-2B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電子天平（TP200S，瑞士 Mettler Toledo公司）；LX-100手掌型離心機(jī)(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；SZ-3自動(dòng)三重純 水蒸餾儀(上海滬西分析儀器廠）；電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；DK電熱恒溫水 槽(江蘇海門市恒昌儀器廠）；5-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠）；Z-C恒溫振蕩器(江 蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；生物分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf公司）；各種型號(hào)的移液器（法國(guó) Gilson公司）。
[0026] 2.2實(shí)驗(yàn)流程與方法
[0027] 2.2.1乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)
[0028] (1)消化酶溶液配制：0.06%胰酶25ml，另外加入0.5ml DNase I溶液和0.5gBSA， 顛倒混勻，并于水浴鍋中使消化酶溶液預(yù)熱至37%
[0029] (2)做兩個(gè)冰臺(tái)：將平皿裝滿冰后倒置即可，75%酒精擦拭平皿后放進(jìn)操作臺(tái)。取2 個(gè)60-mm的一次性組織培養(yǎng)平皿，加入5ml預(yù)冷的Ads緩沖液，標(biāo)記上1，2放進(jìn)操作臺(tái)的冰臺(tái) 上。
[0030] (3)取2日齡的SD乳鼠若干只，低溫麻醉，75%酒精浸泡lmin;
[0031] (4)無(wú)菌條件下開胸，暴露心臟，用眼科剪于心臟收縮期剪取心尖部，將取下的心 臟組織放進(jìn)標(biāo)記為1的培養(yǎng)皿中，以去除殘留血液；
[0032] (5)上述操作完成后，用兩把鑷子剔除心臟上結(jié)締組織和血塊再轉(zhuǎn)入標(biāo)記為2的平 皿中，再洗一遍，用鑷子將心臟組織移入一青霉素瓶。
[0033] (6)用準(zhǔn)備好的無(wú)菌眼科剪把心臟切碎成0.5-lmm3大小，Ads緩沖液沖洗2次。
[0034] (7)向青霉素瓶中加入相當(dāng)于組織塊10倍體積預(yù)溫的消化酶，把上述切碎的心臟 及胰酶液轉(zhuǎn)入加了攪拌子的錐形瓶中，加上塞子，放入37°C水浴中，消化5min，期間每隔 lmin輕輕震蕩錐形瓶以使心臟組織塊散開與消化酶充分接觸。
[0035] (8)用粗口巴氏滴管輕柔緩慢吹打分離組織塊，停止吹打待組織塊沉降后，吸去上 清液(因其含有殘留血細(xì)胞和從組織邊緣消化下來(lái)的壞死心肌細(xì)胞）。
[0036] (9)加入適量消化酶，37°C水浴在作用5min，如前法期間每隔lmin輕輕震蕩錐形 瓶；
[0037] (10) 5min后輕柔吹打分離組織塊，待組織塊沉降，收集上清液，上清液移至一支新 的15ml離心管中，與含10%胎牛血清(FBS)的M199終止培養(yǎng)液1:1等體積混合以終止胰酶消 化。
[0038] (11)重復(fù)(9)(10)步驟，直至只剩余少許組織塊為止
[0039] (12)將上述收集的含培養(yǎng)基和細(xì)胞上清的細(xì)胞懸液，以1000r/min離心5分鐘。輕 輕棄去上清，加 l〇ml含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)基輕輕吹打以重新懸浮細(xì)胞團(tuán)。
[0040] (13)將上述10ml懸液轉(zhuǎn)移到100-mm規(guī)格的無(wú)菌組織培養(yǎng)平皿中，于5%⑶2,高濕 度的37°C溫箱中差速貼壁90分鐘，目的是減少成纖維細(xì)胞的污染(這些細(xì)胞比心臟細(xì)胞貼 壁快）。
[0041] (14)孵育后，收集平皿中的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液包含非貼壁細(xì)胞(經(jīng)富集了的心臟細(xì) 胞），細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至5 X 105細(xì)胞/ml，向培養(yǎng)液中加入0. lmmol 5-Brdu 以抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，將其接種于六孔板中。
[0042] (15) 24h后倒置顯微鏡下觀察可見大多數(shù)心臟細(xì)胞出現(xiàn)自律性搏動(dòng)，當(dāng)日首次換 液以含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)日后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0043] 2.2.2原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞純度鑒定
[0044] (1)心肌細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板中經(jīng)0.1 %明膠處理過的12mm X 12mm蓋玻片上，純化培 養(yǎng)4d后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)溫的PBS輕輕沖洗細(xì)胞爬片3次，每次5min;
[0045] (2)固定:加入適量4%多聚甲醛固定30min;
[0046] (3)清洗:加入適量PBS清洗3次，每次5min;
[0047] (4)透膜：加入適量 0.5%TritonX-100 透膜 15min;
[0048] (5)清洗:加入適量PBS清洗3次，每次5min;
[0049] (6)封閉：封閉液(0 · 5 % TritonX-100+BSA+羊血清)室溫封閉2小時(shí)，以封閉非特異 性背景；
[0050] (7)棄血清(不用洗，用濾紙吸去血清）；
[0051 ] (8) -抗孵育：加入稀釋后的肌鈣蛋白抗體Troponin I(1:100)于4°C冰箱孵育過 夜；
[0052] (9)清洗:加入適量PBS清洗3次，每次5min;
[0053] (10)二抗孵育:FITC標(biāo)記二抗（1:100)避光孵育2小時(shí)；
[0054] (11)染核:加適量DAPI (100ng/mL)細(xì)胞核染色標(biāo)記；
[0055] (12)激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照(激發(fā)波長(zhǎng)488nm);用PBS代替一抗作為陰性 對(duì)照。
[0056] (13)取6個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)troponin I陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)作為心肌細(xì)胞數(shù)，DAPI熒光陽(yáng)性 的為細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞比例。
[0057] 2.2.3細(xì)胞總1?熟提取
[0058] (1)細(xì)胞Trizol混懸液取出后置于冰上溶化。
[0059] (2)將融化好的混合液瞬時(shí)離心。
[0060] (3)將液體吹打混勻，之后加入0 · 2ml氯仿(三氯甲烷，Trizol:氯仿=1:0 · 2)。
[0061] (4)蓋緊蓋子，用力震蕩(手動(dòng)顛倒)混勻15s，之后置于冰上靜置3min。
[0062] (5)離心，4°C 12,000以1^11，151^11，樣品分成三層(紅色:有機(jī)相蛋白，中間層0嫩， 上層水相RNA)。（統(tǒng)籌安排:期間配步驟9中要用到的lml乙醇，lml 75%的乙醇=750μ1無(wú)水 乙醇+250μ1 DEPC水）。
[0063] (6)小心吸取上層水相液體（約500μ1，即加入Trizol量的60%)，移入1.5ml離心 管。
[0064] (7)加入500μ1的異丙醇沉淀RNA(與吸取的水相液體比=1:1)，顛倒混勻，之后冰 上孵育15min。
[0065] (8)離心，4°C 12,000以1^11，101^11，可見到管底有膠狀沉淀。
[0066] (9)棄上清，留膠狀沉淀，加 lml 75 %的乙醇洗滌（步驟5中，配置的75 %的乙醇， Trizol和乙醇的體積比為1:1)，溫和震蕩，顛倒混勻。
[0067] (10)離心，4°C 7,500r/min lOmin(統(tǒng)籌普安排:期間打開烘箱預(yù)熱加溫至50°C)。
[0068] (11)直接倒掉上清，盡量吸棄殘留液體但保留沉淀，蓋好蓋子準(zhǔn)備烘干。
[0069] (12)將離心管蓋子打開，置于50 °C烘箱中，5~1 Omin，至沉淀變透明。
[0070] (13)蓋好蓋子取出，后依次加入30μ1的DEPC水(具體所需溶解體積按實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)、濃 度及用量而定），槍頭吹打充分混合，蓋好蓋子后置于60°C烘箱中，孵育5~lOmin，得到RNA 原液。
[0071] (14)配制測(cè)濃度的樣品：取2μ1提取好的原液，10倍比例稀釋（即2μ1原液+18μ1 DEPC水），置于200μ1的離心管內(nèi)，于細(xì)胞室分光光度儀上測(cè)濃度。
[0072] (15)將RNA原液按下一步實(shí)驗(yàn)要求分裝凍存于_80°C。
[0073] 2.2.4逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
[0074] 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(miR_125b)
[0075]
[0076] 混勻，瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件如下：
[0077] 42°C 60min,
[0078] 70°C 5min,
[0079] 4°C
[0080] 經(jīng)過一個(gè)循環(huán)反應(yīng)后，收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將其置于冰箱_20°C保存。
[0081 ] 2.2.5實(shí)時(shí)熒光定量?〇?(91^-?〇0
[0082] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(miR-125b)
[0083]
[0084] 混勻，瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件如下：
[0085] 95°C lOmin,
[0086] 95〇C 15s,
[0087] 58〇C 31s,
[0088] 經(jīng)過40個(gè)循環(huán)后收集熒光，繪制溶解曲線，通過溶解曲線驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性。每個(gè) 樣本做三個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取其均值。
[0089] 2.2.6細(xì)胞總蛋白提取
[0090] ⑴冰上配制裂解混合液，按六孔板每孔200μ1混合液配制，配制比例為RIPA: PMSF =100：1〇
[0091] (2)將細(xì)胞培養(yǎng)板(六孔板)上生長(zhǎng)良好的新生乳鼠心肌細(xì)胞棄去上層培養(yǎng)基。用1 X PBS沖洗3遍，吸凈殘留PBS，使細(xì)胞培養(yǎng)板盡量干燥。
[0092] (3)將裂解混合液按量加入，均勻搖晃，使混合液迅速鋪滿板后，冰上靜置lOmin， 至有膠狀物附著即可進(jìn)行下一步。
[0093] (4)取特制干凈的細(xì)胞刮子，均勻刮取細(xì)胞膠狀物于1.5ml EP管。
[0094] (5)離心，4°C 12,000r/min，15min。
[0095] (6)離心完畢，吸取上清液于新的1.5ml EP管。
[0096] (7)在紫外分光度計(jì)上測(cè)蛋白濃度。
[0097] (8)按測(cè)得濃度，吸取50μ1蛋白原液加入5μ1的5 X loading buff er(蛋白上樣緩沖 液），吹打混勻。
[0098] (9)沸水煮蛋白8min，完畢取出后-80°C凍存。
[0099] 2.2.7蛋白免疫印跡(Western Blot)
[0100] (1)細(xì)胞總蛋白提取(方法見2.2.5)
[0101] (2)配聚丙烯酰胺凝膠
[0102] (3)根據(jù)蛋白分子量大小及所需樣本孔數(shù)，選擇配膠濃度及所需體積，具體配方：
[0103] 聚丙烯酰胺凝膠配方(分離膠）
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108] 清洗玻璃板，傾斜晾干。將每組玻璃板對(duì)齊卡緊垂直卡在架子上，加去離子水測(cè) 漏，完成后先加分離膠，加至距上端1.5cm處時(shí)，立即加水液封，靜置30min后棄上層液封水， 加濃縮膠至溢出，立即插入梳子，室溫放置2h。
[0109] ⑷電泳
[0110] 安裝電泳儀，按定量逐一加樣至各加樣孔，接通電源，按恒壓調(diào)節(jié)80V-40min/ 100V-lh，電泳結(jié)束，根據(jù)Maker的位置切取目的蛋白。
[0111] (5)轉(zhuǎn)膜
[0112] 在一平皿中加入少量100 %甲醇，將一定大小的PVDF膜剪下并置于甲醇中極化，約 5min，極化結(jié)束，夾于轉(zhuǎn)膜液中水洗平衡lOmin。安裝轉(zhuǎn)膜裝置，"三明治"裝置疊放次序：陰 極碳板(黑色面)+海綿+三濾+膠-膜+三濾+海綿+陽(yáng)極碳板（白色面），將PVDF膜蓋于膠上，夾 好各層濾紙，調(diào)整裝置，恒流轉(zhuǎn)膜(2h，300mA或4 °C 12V轉(zhuǎn)膜過夜），此過程均需冰袋降溫。
[0113] (6)封閉，
[0114] 加一抗、二抗孵育將轉(zhuǎn)膜完成的PVDF膜浸入封閉液(將5g脫脂奶粉溶于100ml 1 X TBST)中，以60r/min轉(zhuǎn)速封閉2h。封閉結(jié)束，按轉(zhuǎn)速80r/min，用1 X TBST洗5min。按RAGE-抗 稀釋比例（1:1000)配一抗稀釋液，4 °C過夜。第二天按轉(zhuǎn)速80r/min，用1 X TBST洗膜3次，每 次lOmin。洗膜結(jié)束，孵上相應(yīng)種屬的二抗，室溫孵育1.5h，結(jié)束后，按80r/min，用1 X TBST洗 膜4次，每次4min。
[0115] ⑴顯影
[0116]將洗滌完畢的PVDF膜用濾紙吸干殘夜，平鋪于顯影儀相應(yīng)位置，將配好的ECL的A、 B發(fā)光液等比例混合(即用即配)后，均勻滴加于膜上，凝膠成像系統(tǒng)拍照、保存。顯影所得條 帶用Image J軟件進(jìn)行灰度值掃描分析。
[0117] 2.2.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
[0118] (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期目的細(xì)胞，0.25 %胰酶消化，細(xì)胞密度為1 X 105個(gè)/ml接種于6孔 板中，37 °C、5 % C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
[0119] (2)干預(yù)24h后，消化制備細(xì)胞懸液，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度約為1 X 106個(gè)/ml。
[0120] (3)l，000r/pm，4°C離心5min，棄上清。加入 195μ1 Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重 懸細(xì)胞。
[0121] (4)加入5μ1 Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育lOmin，使用鋁箱進(jìn)行避 光。
[0122] (5)1，000r/pm離心5min，棄上清，加入190μ1 Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì) 胞。
[0123] (6)加入ΙΟμΙ碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。
[0124] (7)隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0125] 2.2.9 miR-125b慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
[0126] miR-125b過表達(dá)慢病毒(LV-miR-125b-GFP)及對(duì)照慢病毒(LV-GFP)的構(gòu)建由上海 吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司完成，其制作過程包括病毒包裝輔助質(zhì)粒的構(gòu)成，高質(zhì)量病毒載體的準(zhǔn) 備，獲得目的基因片段，載體與目的基因共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞系，然后進(jìn)行病毒顆粒的包裝、 生存、收獲和濃縮工作，并標(biāo)記GFP。最后進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。參照慢病毒轉(zhuǎn)染操作手冊(cè)，首 先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定新生乳鼠心肌細(xì)胞感染復(fù)數(shù)值，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，每孔中加入5yg/mL polybrene增強(qiáng)感染效率，轉(zhuǎn)染72h后在熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，估算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效 率，選擇轉(zhuǎn)染效率達(dá)80 %以上的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)
[0127] 2.2.10細(xì)胞凋亡模型制作
[0128] 將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100ul，37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80 % -90 %細(xì)胞 融合。陰性對(duì)照組加入PBS 100uL，測(cè)定組分別加入終濃度50、100、200&400ymol/U9 H2〇2100ul，37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中處理6h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。
[0129] 2.2.10 MTT法檢測(cè)不同濃度H2〇2對(duì)新生乳鼠心肌細(xì)胞增殖活性的影響
[0130] (1)不同終濃度的H2〇2 (50、100、200、400umo 1/L)損傷新生乳鼠心肌細(xì)胞6h后每孔 加入20ul(5mg/ml)MTT試劑，37°C培養(yǎng)箱孵育4h終止培養(yǎng)。
[0131] (2)用移液槍吸棄上層培養(yǎng)液，每孔加入150ulDMS0，振蕩10min充分融解結(jié)晶物。
[0132] (3)選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定每個(gè)孔的光吸收度，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì) 胞增殖抑制率表示。細(xì)胞增殖抑制率=1-處理組平均0D值/對(duì)照組平均0D值X 100%。
[0133] 2.2.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0134] 所有數(shù)據(jù)均采用SPASS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行繪圖。 計(jì)數(shù)資料的比較采用X2檢驗(yàn);計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（X±s)表示;兩組間比較采用 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用方差分析。以P〈0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0135] 結(jié)果
[0136] 3.1慢病毒轉(zhuǎn)染后miR-125b的表達(dá)情況
[0137] LV-miR-125b-GFP及LV-GFP慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染新生乳鼠心肌細(xì)胞第48小時(shí)后， 采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-125b的表達(dá)情況。細(xì)胞內(nèi)miR-24表達(dá)量顯著升高， 與轉(zhuǎn)染LV-CON-GFP及對(duì)照組細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖1;
[0138] 慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-125b表達(dá)情況與LV-GFP組比較，*Ρ<0·05;與control組 比較，**Ρ<0·05。
[0139] 3.2新生乳鼠心肌細(xì)胞凋亡模型的建立
[0140] 采用50、100、200、40(^111〇1/1!1202分別處理新生乳鼠心肌細(xì)胞611后結(jié)果顯示如表。 按下列公式計(jì)算抑制率:抑制率（IR% ) = (1-處理組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值） X 100%，結(jié)果見表。
[0141 ] 不同濃度H2〇2對(duì)新生乳鼠心肌細(xì)胞0D值和增殖的抑制率(X土S)
[0142]
[0143] 200ymol/L H2〇2處理新生乳鼠心肌細(xì)胞6h，抑制率為50.21 % ± 10.21 %，與正常對(duì) 照組0%相比，兩者有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異化〈0.01)。應(yīng)用5(^111〇1/1!1202和10(^111〇1/1!1 202預(yù) 處理差異不顯著。應(yīng)用400ymol/L H2〇2預(yù)處理細(xì)胞基本全部死亡。所以選擇200ymol/L H2〇2 制作新生乳鼠心肌細(xì)胞凋亡模型。
[0144] 3.3 miR-125b可增加由H2〇2誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率
[0145] LV-GFP-miR-125b+H2〇2組、LV-GFP+H2〇 2組、H2〇2組及NC組新生乳鼠心肌細(xì)胞分別用 200ymol/L H2〇2處理6h。與NC組相比，H2〇2組新生乳鼠心肌細(xì)胞抑制率顯著增加(P〈0.05)。 LV-GFP-miR-125b+H2〇2組與LV-GFP+H2〇 2組及H2〇2組相比，細(xì)胞抑制率明顯減少，但仍較NC組 高(？〈0.05)。1^-6??+出02組及出02組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(？>0.05)。結(jié)果如表。
[0146] 各組新生乳鼠心肌細(xì)胞0D值和抑制率
[0147]
[0148] 3.4 miR-125b對(duì)H2O2誘導(dǎo)的新生乳鼠心肌細(xì)胞的抗凋亡作用
[0149] LV-GFP-miR-125b+H2〇2組、LV-GFP+H2O2組、H2O2組及NC組新生乳鼠心肌細(xì)胞分別用 200ymol/L H2O2處理6h。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：LV-GFP-miR-125b+H2〇2組、LV-GFP+H2O2組、 H2O2組及NC組凋亡率分別為（26·83±6·67 44·67±9·98 46·35±10·78 11.23±5.33)。與 NC組相比，Η202組新生乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加(Ρ〈0.05)。
[0150] LV-GFP-miR-125b+H2〇2組與LV-GFP+H2O2組及Η2Ο2組相比，細(xì)胞抑制率明顯減少，但 仍較NC組高(？〈0.05)。1^-6??+出02組及11202組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(？>0.05)。
[0151 ] 各組新生乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率
[01521
[0153] 3.5 miRNA-125b對(duì)新生乳鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
[0154]抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是凋亡信號(hào)通路的主要相關(guān)蛋白，在正常狀態(tài) 下定位于線粒體膜上的Bcl-2與Bax相結(jié)合，當(dāng)觸發(fā)凋亡信號(hào)時(shí)，下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)裂解Bcl-2與 Bax分離，Bax行使凋亡功能，并觸發(fā)caspase，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0155] LV-GFP-miR-125b+H2〇2組、LV-GFP+H2〇 2組、H2〇2組及NC組新生乳鼠心肌細(xì)胞分別用 200ymol/L H2O2處理Stuwestrern blot結(jié)果顯不：
[0156] 1.與NC組相比，H2〇2組新生乳鼠心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低(P〈0.05)。
[0157] LV-GFP-miR-125b+H2〇2 組與 LV-GFP+H2O2 組及 H2O2 組相比，Bcl-2 表達(dá)增加，但仍低 于NC組(P〈0.05) IV-GFP+H：^組及H2〇2組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
[0158] 與NC組相比，H2〇2組新生乳鼠心肌細(xì)胞ΒΑΧ表達(dá)增加（P〈0.05)LV-GFP-miR-125b+ H2〇2組與LV-GFP+H2〇2組及H2〇2組相比，Bax表達(dá)降低，但仍高于NC組(P〈0.05) dLV-GFP+H：^組 及H2〇2組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種miR-125b慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miR-125b慢病毒在制備心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)藥物中的應(yīng) 用，其特征是:所述miR_125b慢病毒是miR-125b過表達(dá)慢病毒。
【文檔編號(hào)】A61P9/00GK105833291SQ201610257547
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】叢輝, 鞠少卿, 申嫻娟, 儲(chǔ)海丹, 朱冰影, 吳珊
【申請(qǐng)人】南通大學(xué)附屬醫(yī)院