苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽的新應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽的新應(yīng)用，苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽對乳腺癌細(xì)胞系MCF?7，4T1?luc2，MDA?MB?231，SKBR3有很強(qiáng)的抑制作用，而且整體動物實(shí)驗(yàn)也有明顯效果，以證明苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽可應(yīng)用于制備抗乳腺腫瘤、抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤的藥物。
【專利說明】
苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽的新應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物的新應(yīng)用，特別是涉及苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽的新應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 1998年Wessler提出非神經(jīng)元性膽堿能系統(tǒng)的概念，非神經(jīng)元性Ach，從細(xì)胞中分 泌出來，通過自分泌或旁分泌機(jī)制，作用于自身或鄰近細(xì)胞上的nAChR和mAChR，調(diào)節(jié)細(xì)胞的 基本功能，如基因表達(dá)、擴(kuò)增、分化、細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞間接觸等，近年研究發(fā)現(xiàn)非神經(jīng) 元膽堿能系統(tǒng)與多種腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。
[0003] 目前文獻(xiàn)報(bào)道支配乳腺的神經(jīng)主要是感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)，副交感神經(jīng)或者是迷 走神經(jīng)對乳腺的支配還不清楚。交感神經(jīng)影響乳腺癌的轉(zhuǎn)移，在小鼠乳腺癌模型中，不同的 壓力應(yīng)激如游泳應(yīng)激、手術(shù)應(yīng)激、社交沖突和低溫均能夠促進(jìn)腫瘤向肺轉(zhuǎn)移，注射腎上腺 素能夠促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移;更為重要的是，非留體抗炎藥吲哚美辛，和腎上腺素拮抗劑納 多洛爾(nadolol )，能夠阻止癌細(xì)胞向其他器官轉(zhuǎn)移，因此癌細(xì)胞向其他器官轉(zhuǎn)移這種效應(yīng) 能夠被腎上腺素能信號所調(diào)節(jié)。
[0004] 膽堿能信號是否調(diào)節(jié)乳腺生理還不清楚，但影響乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移確有文獻(xiàn)報(bào) 道，如膽堿能信號通過a9_nAChR影響細(xì)胞Ca 2+機(jī)制激活蛋白激酶A(protein kinase A， PKA)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide_3kinases， PI3K)/Akt，和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等信號 通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生和生長。
[0005] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，痛苦的生活經(jīng)歷增加了婦女患乳腺癌的幾 率，多種腫瘤低生存率和高死亡率與慢性抑郁相關(guān)聯(lián)，精神壓力興奮交感神經(jīng)系統(tǒng)從而影 響乳腺功能是清楚的。
[0006] 苯扎托品也是多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，可應(yīng)用于可卡因成癮。最近研究還揭示了苯 扎托品的新用途，其對繼發(fā)型多發(fā)性硬化癥有較好的治療效果，其作用機(jī)制不是通過抑制 煙堿型乙酰膽堿受體和組胺的釋放，也不是通過抑制多巴胺的再攝取，而是作為一種毒蕈 堿型受體抑制劑，促進(jìn)少突前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells)的分化成熟而 發(fā)揮藥理作用。
[0007] 甲橫酸苯扎托品[End0-3_(diphenylmethoxy )-8-methyl-8_azabicyclo[3，2，1 ] octane methanesulfonate，benztropine mesylate]，結(jié)構(gòu)式為：
*. ?是苯扎托品（benztropine)的甲磺酸鹽，為 阿托品類衍生物，可以穿過血腦屏障，具有中樞性抗膽堿、抗組胺及輕度局麻等藥理作用， 用于治療帕金森綜合癥。
[0009] 目前，由于腫瘤生長和治療的復(fù)雜性，尚未有關(guān)于苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的 鹽可用于制備抗乳腺腫瘤、抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移等的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽的新應(yīng) 用。
[0011] 具體技術(shù)方案如下：
[0012] 本發(fā)明提供了苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗乳腺腫瘤的藥物中的應(yīng) 用。
[0013] 在其中一些實(shí)施例中，所述苯扎托品藥學(xué)上可接受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
[0014] 在其中一些實(shí)施例中，所述乳腺腫瘤為乳腺癌。
[0015] 本發(fā)明還提供了苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾 病或腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0016] 在其中一些實(shí)施例中，所述苯扎托品藥學(xué)上可接受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
[0017] 在其中一些實(shí)施例中，所述乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤為乳腺腫瘤向腹股溝淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤。
[0018] 在其中一些實(shí)施例中，所述乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤為乳腺腫瘤向肝臟轉(zhuǎn)移的 疾病或腫瘤。
[0019] 本發(fā)明還提供一種防治乳腺腫瘤的藥物，其活性成分為苯扎托品或其藥學(xué)上可接 受的鹽。
[0020] 在其中一些實(shí)施例中，所述苯扎托品藥學(xué)上可接受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
[0021] 本發(fā)明相較現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)以及有益效果為：
[0022] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,4Tl-luc2， MDA-MB-231，SKBR3有很強(qiáng)的抑制作用，而且整體動物實(shí)驗(yàn)也有明顯效果，以證明苯扎托品 及其藥學(xué)上可接受的鹽可應(yīng)用于制備抗乳腺腫瘤、抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤的藥 物；由于腫瘤生長和治療的復(fù)雜性，苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽可應(yīng)用制備的抑制乳 腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤的藥物為抑制乳腺腫瘤向腹股溝淋巴結(jié)以及肝臟轉(zhuǎn)移的藥物。
[0023] 苯扎托品藥學(xué)上可接受的鹽，如甲磺酸苯扎托品，其發(fā)揮藥效的為主結(jié)構(gòu)苯扎托 品，但其相較苯扎托品具有水溶性大，可增加藥物在人體內(nèi)的吸收的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0024] 圖1為苯扎托品對細(xì)胞增殖的影響示意圖；
[0025] 圖2為苯扎托品對在體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用示意圖，其中A為重量大小變化示意 圖，B為腫瘤重量變化示意圖，C為小鼠體重變化示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0027] 以下實(shí)施例中所用原料均為市售普通原料。
[0028] 實(shí)施例
[0029](一)苯扎托品對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
[0030] 1 材料
[0031] 1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系 4Tl-luc2cells，MDA-MB-231cells，SKBR3cells，MCF_7cells，均來 源于ATCC公司。
[0032] 1 ? 2試劑CCK-8試劑盒、DMEM。
[0033] 1.3儀器15mL離心管、1.5mL EP管、lmL和200yL槍頭、排槽，在實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好，121°C 30min滅菌后置于超凈臺中；
[0034] 96孔培養(yǎng)板為一次性塑料制品；
[0035]超凈臺、C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機(jī)、單道及八道移液槍、凍存管、細(xì)胞計(jì)數(shù) 板，酶聯(lián)免疫檢測儀等。
[0036] 1.4藥品甲磺酸苯扎托品。
[0037] 1.5實(shí)驗(yàn)方法
[0038] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0039] 一、復(fù)蘇
[0040] 1、把裝有 4Tl-luc2cells，MDA-MB-231cells，SKBR3cells，MCF_7cells 四個細(xì)胞系 的凍存管分別從液氮中取出來，立即投入37°C水浴鍋中，輕微搖動;液體都融化后(大概1~ 1.5分鐘），拿出來噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺里；
[0041] 2、把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一 遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來），1000轉(zhuǎn)離心5分鐘；
[0042] 3、把上清液倒掉，加lml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來，吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng) 皿中前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布；
[0043] 4、標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培 養(yǎng)基；
[0044] 5、3天換一次培養(yǎng)基。
[0045] 二、傳代
[0046] 1、培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80 %~90 %時傳代；
[0047] 2、把原有培養(yǎng)基吸掉；
[0048] 3、加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌?能覆蓋細(xì)胞就行），消化1~2分鐘；
[0049] 4、細(xì)胞都變圓后加入等體積的含10%牛胎兒血清卬85，11^1讓(^611)的培養(yǎng)基 (Gibco)終止消化；
[0050] 5、用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來；
[0051 ] 6、把細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘；
[0052] 7、倒掉上清液，加1~2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來；
[0053] 8、把細(xì)胞傳到五個培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0054] 三、凍存
[0055]把細(xì)胞消化下來并離心（離心條件同上）；用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來，分裝 到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細(xì)胞種類，凍存日期;4 °C 30min，-20 °C 30min，-80 °C過 夜，然后放到液氮灌中保存。
[0056] 凍存液的配制：70%的完全培養(yǎng)基（Gibco)+20%FBS+10%DMS0;DMS0(二甲基亞 砜)要慢慢滴加，邊滴邊搖。
[0057] CCK8法實(shí)驗(yàn)步驟
[0058](一)按常規(guī)CCK8法來進(jìn)行細(xì)胞活性檢測實(shí)驗(yàn)，步驟如下：
[0059] 1、在96孔板中加入100yl細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(在37°C，5% C02的條件下）；
[0060] 2、向每孔中加入1 Oyl CCK-8溶液(比例是10 :1)，同時設(shè)置空白對照孔；（注意，不 要在孔中生成在氣泡，它們會影響0D值的讀數(shù)）
[0061 ] 3、將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D450nm處測量各孔的吸光 值。
[0062](二)按常規(guī)CCK8法來進(jìn)行細(xì)胞增值-毒性檢測實(shí)驗(yàn)，步驟如下：
[0063] 1、在96孔板中加入100yl細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(在37°C，5% C02的條件下）；
[0064] 2、向培養(yǎng)板加入不同濃度梯度的甲磺酸苯扎托品，每孔lOOiil，設(shè)5個復(fù)孔；
[0065] 3、5%C02,37°C孵育6天，倒置顯微鏡下觀察；
[0066] 4、每孔加入10yl CCK溶液；（注意，不要在孔中生成在氣泡，它們會影響0D值的讀 數(shù)）
[0067] 6、將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D450nm處測量各孔的吸光 值。
[0068]活力計(jì)算：
[0069] 細(xì)胞活力*( % ) = [A(加藥)_A(空白）]x100
[0070] A(加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
[0071 ] A(空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度
[0072] A(0加藥）：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
[0073] *細(xì)胞活力:細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力
[0074]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0075] 采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力和藥物對細(xì)胞增殖的影響，在MCF-7細(xì)胞系，苯扎托品 0 ? 1，1，10，50，100yM 處理6天，測定 IC50是7 ? 2yM。
[0076] 隨后在4!'1-1此2，]\0^-]\?-231，501?3三種細(xì)胞系（41'1-11^2〇6118，]\0^-]\?-231cells以及SKBR3cells)上進(jìn)行了同樣的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1(圖中的縱坐標(biāo)Cell viability代表細(xì)胞活力），分別為在4Tl-luc2，MDA-MB-231，SKBR3三種細(xì)胞系的DMS0(未加 藥前)對照組與不同濃度的甲磺酸苯扎托品（benztropine mesylate)組的細(xì)胞活力對比， 與對照組相比，#P〈〇. 01，*#P〈〇. 001，結(jié)果表明苯扎托品處理6天有顯著的抑制細(xì)胞增殖 作用。
[0077] (二)苯扎托品在體抑制小鼠乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移
[0078] 1 材料
[0079] 1.1實(shí)驗(yàn)動物
[0080] BALB/c 小鼠
[0081] 1.2儀器與藥品
[0082] PBS，紫杉醇（paclitaxel)，甲橫酸苯扎托品（benztropine mesylate)，0.9%生理 鹽水(0.9%8&1丨1^)，41'1細(xì)胞以了〇：)，光學(xué)檢測儀器。
[0083] 1.3實(shí)驗(yàn)方法
[0084]小鼠活體成像檢測
[0085]用0.0 lmol/1的PBS洗滌4T1細(xì)胞兩次后，用PBS將細(xì)胞密度調(diào)至丨」1.0 X 106/ml，注射 0.2ml細(xì)胞懸浮液至BALB/c小鼠乳腺脂肪墊，定期用活體成像法檢測小鼠體內(nèi)腫瘤的生長 和轉(zhuǎn)移情況。
[0086] 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件和Excel2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行配對t檢 驗(yàn)。
[0087] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0088] 在BALB/c小鼠接種4T1細(xì)胞建立乳腺癌模型（4Tltumor model)，連續(xù)腹腔注射紫 杉醇（pacl itaxel) (10mg/kg)，甲橫酸苯扎托品（benztropine mesylate)(l. 5mg/kg)， 0 ? 9 %生理鹽水(0 ? 9 % sal ine)做對照。
[0089] 結(jié)果請見圖2,圖A(其中橫坐標(biāo)表示給藥后的天數(shù)，縱坐標(biāo)表示腫瘤大?。(其中 縱坐標(biāo)表示腫瘤重量）、C(其中縱坐標(biāo)表示小鼠體重，橫坐標(biāo)表示給藥后的天數(shù)）分別為 benztropine mesylate( 1 ? 5mg/kg)，paclitaxel(10mg/kg)以及0 ? 9%saline給藥后的腫瘤 大?。ˋ)，腫瘤重量(B)和小鼠體重（C)變化，x土SD(n= 10)，甲磺酸苯扎托品與對照組比 較，*?〈0.05，**?〈0.01，***?〈0.001，？&(：1^&叉61組與對照組比較，#牝〈0.01，##牝〈0.001 ; 通過活體成像檢測的轉(zhuǎn)移小鼠數(shù)量請見表1。
[0090] 表1活體成像檢測的轉(zhuǎn)移小鼠數(shù)量表
[0092] 上表中與對照組(0 ? 9%生理鹽水組)相比，*p〈0 ? 05，林*p〈0 ? 001。
[0093] 由圖2以及表1可知，從15天開始，與對照組比，給藥組紫杉醇(paclitaxel)和甲磺 酸苯扎托品（benztropine mesylate)顯著減少了腫瘤大小和瘤重(p〈0.01)，甲磺酸苯扎托 品組小鼠體重與對照組沒有顯著性差別；甲磺酸苯扎托品組顯著抑制了乳腺腫瘤向腹股溝 淋巴結(jié)和肝臟轉(zhuǎn)移，但對肺和腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移抑制作用不顯著。
[0094] 以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí) 施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存 在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
[0095] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗乳腺腫瘤的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述苯扎托品藥學(xué)上可接受的鹽為甲磺酸 苯扎托品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述乳腺腫瘤為乳腺癌。4. 苯扎托品及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抑制乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤藥物中的 應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述苯扎托品藥學(xué)上可接受的鹽為甲磺酸 苯扎托品。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤為乳 腺腫瘤向腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤。7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤為乳 腺腫瘤向肝臟轉(zhuǎn)移的疾病或腫瘤。8. -種防治乳腺腫瘤的藥物，其特征在于，其活性成分為苯扎托品或其藥學(xué)上可接受 的鹽。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的防治乳腺腫瘤的藥物，其特征在于，所述苯扎托品藥學(xué)上可接 受的鹽為甲磺酸苯扎托品。
【文檔編號】A61P35/00GK105853420SQ201610211586
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】崔繼紅, 項(xiàng)輝, 王瑞霞
【申請人】中山大學(xué)