一種免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的制備方法，其中，所述方法包括通過從培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液和裂解免疫細(xì)胞獲得的蛋白懸液，經(jīng)超濃縮后制備成免疫細(xì)胞精華液，富含抗炎抗氧化成分，具有抗炎抗氧化的功效；進(jìn)一步冷凍干燥后制備成凍干粉，可以長期在?80℃超低溫冰箱保存，成為皮膚抗炎抗氧化的生物美容原料；添加到面霜、潤膚露和爽膚水中可以制備成抗炎抗氧化面霜產(chǎn)品，加入到面膜中可以制備成抗炎抗氧化面膜產(chǎn)品以及直接制備成抗炎抗氧化精華液產(chǎn)品，可用于皮膚粉刺、除斑、防曬和抗氧化等美容。
【專利說明】
一種免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的制備方法及其產(chǎn)品
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的方法以及通過所述方法獲 得的免疫細(xì)胞來源的生物美容產(chǎn)品。特別地，本發(fā)明涉及采用從培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液和 裂解免疫細(xì)胞獲得的蛋白懸液，經(jīng)超濃縮后制備成免疫細(xì)胞精華液，冷凍干燥后制備成凍 干粉的生物美容原料，富含抗炎抗氧化成分，具有抗炎抗氧化的功效，可以制備成面霜、潤 膚露、爽膚水、面膜和精華液等產(chǎn)品，可用于皮膚粉刺、除斑、防曬和抗氧化等美容。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，各種化妝品主要以化學(xué)成分為主，再添加了一些植物提取精華素或者其他 深海營養(yǎng)物質(zhì)制備成的美容產(chǎn)品，對皮膚發(fā)揮保濕、美白和控油等作用。盡管這些化妝品含 有一些營養(yǎng)物質(zhì)，但因其有效成分含量和有效性等問題，在皮膚抗炎抗氧化等方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn) 不足。
[0003] 近年來，由于生物技術(shù)的發(fā)展，采用基因工程技術(shù)獲得細(xì)胞因子基因重組載體，在 大腸桿菌或酵母中發(fā)酵，大量獲得相關(guān)細(xì)胞因子。作為營養(yǎng)因子添加到化妝品中或直接使 用，在皮膚修復(fù)、抗炎和抗氧化中起到一定效果。但由于這些細(xì)胞因子是在大腸桿菌或酵母 等低等細(xì)胞中表達(dá)的，其缺少在哺乳動物細(xì)胞中的蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾，包括糖基化、甲基 化和末端修飾等過程，其功能和生物活性受到很大限制。所以使用大腸桿菌或酵母中發(fā)酵 制備的細(xì)胞因子應(yīng)用在化妝品中，很多可能生物活性不高甚至無效，或者由于免疫原性問 題皮膚造成過敏現(xiàn)象。
[0004] 本發(fā)明采用人免疫細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下連續(xù)培養(yǎng)，這些免疫細(xì)胞可天然地表達(dá) 和分泌大量的細(xì)胞因子，人免疫細(xì)胞表達(dá)和分泌的蛋白具有良好的轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾，具有 很好生物活性。這樣一來，也避免了進(jìn)行基因重組構(gòu)建，免疫細(xì)胞能表達(dá)和分泌大量天然的 細(xì)胞因子，沒有任何基因修飾而造成異源性免疫原性高的問題，這些細(xì)胞因子富含抗免疫 炎癥和抗氧化相關(guān)的分子。綜上所述，本發(fā)明利用人免疫細(xì)胞表達(dá)和分泌的細(xì)胞因子，通過 裂解、濃縮和冷凍干燥后制備成成品，在生物學(xué)有效期內(nèi)更好儲存及時使用，將對青春痘、 粉刺和皮疹等皮膚產(chǎn)生最佳的抗炎和抗氧化等美容作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 經(jīng)過本發(fā)明科研人員長期免疫細(xì)胞培養(yǎng)與美容應(yīng)用的研究，為了對皮膚的青春 痘、粉刺和皮疹等產(chǎn)生更好地抗炎和抗氧化等的作用，發(fā)現(xiàn)人免疫細(xì)胞表達(dá)和分泌的細(xì)胞 因子產(chǎn)生很好的消炎去腫、去紅斑和修復(fù)等作用，而且聯(lián)合美容物理療法將產(chǎn)生更好功效。 本發(fā)明通過從培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液和裂解免疫細(xì)胞獲得的蛋白懸液，經(jīng)超濃縮后制備成 免疫細(xì)胞精華液，富含抗炎抗氧化成分，具有抗炎抗氧化的功效。這些抗炎癥分子主要包括 白介素12(interleukin 12, IL-12)、白介素8(interleukin 8, IL-8)、白細(xì)胞介素-1 受體詰 抗劑（interleukinl receptor antagonist，IL_lRa)、干擾素 a(interferon a，TFN_a)和干 擾素 y (interferon γ，TFN-γ )等；抗氧化分子主要包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-01，TGF_01)、血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factor， PDGF)和超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)等;免疫細(xì)胞裂解液還含有核因子相 關(guān)因子2(nuclear factor E2_related factor 2，Nrf2)，具有抗炎癥和抗氧化雙重功能； 生長分子:細(xì)胞間粘附分子-1 (ICAM-1)、和中性粒細(xì)胞胞漿因子2(NCF-2)。
[0006] 免疫細(xì)胞分泌的抗炎癥分子能夠特異性地抑制炎癥，截斷炎癥產(chǎn)生的途徑，弱化 炎癥反應(yīng);維持真皮層細(xì)胞正常生理環(huán)境，抑制受損細(xì)胞與表皮細(xì)胞的粘附，防止炎癥在細(xì) 胞間的擴(kuò)散，促進(jìn)受損細(xì)胞代謝自然剝落，恢復(fù)皮膚健康；同時能夠抑制皮膚組織產(chǎn)生可激 發(fā)炎癥的毒素成分;對免疫復(fù)合物所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)同樣具有緩解功效。免疫細(xì)胞分泌的 抗氧化分子可清除機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基，提高皮膚對自由基損傷 而誘發(fā)疾病和對自由基外界誘發(fā)因子的抵抗力。
[0007] Nrf 2是結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件的基本轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)元件的目標(biāo)基因表 達(dá)，其中包括谷胱甘肽(glutathione，r-glutamyl cysteingl+glycine，GSH)，能誘導(dǎo)多種 類型的GST基因表達(dá)，而GST是具有抗氧化和整合解毒作用之王。而Nrf2高表達(dá)能抑制炎癥 相關(guān)因子如（1〇-10、11^-6，了冊-€[、1^)3和0^2等的表達(dá)，因而處€2不僅是抗氧化系統(tǒng)的總 司令，在抗炎癥方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用。
[0008] 同時我們發(fā)現(xiàn)ICAM-1和NCF-2具有更好地促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖和分化，表達(dá) 膠原蛋白和彈性蛋白，改善皮膚膚質(zhì)，特別是對皮膚瘢痕和疤痕具有很好修復(fù)作用。
[0009] 本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的制備方法，其中，所述方 法包括通過從培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液和裂解免疫細(xì)胞獲得的蛋白懸液，經(jīng)超濃縮后制備成 免疫細(xì)胞精華液，富含抗炎抗氧化成分;經(jīng)冷凍干燥后制備成凍干粉，可以長期在_80°C超 低溫冰箱保存，成為皮膚抗炎抗氧化的生物美容原料。
[0010] 本發(fā)明提供的人免疫細(xì)胞為細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T淋 巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，優(yōu)選地，為細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和自 然殺傷T淋巴細(xì)胞。
[0011] 所述免疫細(xì)胞來源人外周血或臍帶血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后獲得單 個核細(xì)胞，使用細(xì)胞因子干擾素 γ、抗人CD3單抗、白介素 Ια和白介素2在無血清培養(yǎng)基中連 續(xù)培養(yǎng)20天獲得細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞及其培養(yǎng)液;或通過細(xì)胞因子白介素15、白介素18 和白介素2在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20天獲得自然殺傷細(xì)胞及其培養(yǎng)液;或通過細(xì)胞因 子白介素15和α-GalCer在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20天獲得自然殺傷Τ淋巴細(xì)胞及其培養(yǎng) 液。
[0012] 優(yōu)選地，所述的MSC無血清培養(yǎng)基含0. l-200μg/ml氫化可地松、l-500μg/ml抗壞血 酸和l-lOOOμg/ml人胰島素，我們發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)細(xì)胞生長因子的分泌和表達(dá)，提高細(xì)胞生長 因子的含量，特別是促使了 ICAM-1和NCF-2的表達(dá)。
[0013] 培養(yǎng)獲得免疫細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后高速低溫離心，獲得細(xì)胞裂解上清，與免疫細(xì)胞 培養(yǎng)液混勻后濃縮，然后在冷凍干燥儀中冷凍干燥得到凍干粉，壓蓋密封后貼簽，放置-80 °C冰箱保存。
[0014] 本發(fā)明制備的免疫細(xì)胞培養(yǎng)液、含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液及其濃縮液經(jīng)酶聯(lián)免 疫吸附測定ELISA試劑盒檢測富含抗炎抗氧化分子，即：培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液中分泌的抗 炎癥分子白介素12含量超過10000pg/ml，白介素8含量超過100000pg/ml和白細(xì)胞介素-1受 體詰抗劑含量超過5000pg/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β?含量超過7000pg/ml和超氧化歧 化酶含量超過2000pg/ml，以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過1500pg/ml和中性粒細(xì)胞胞漿因 子2含量超過4000pg/ml。
[0015] 含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中抗炎癥分子白介素 12含量超過20ng/ml，白介素 8含 量超過150ng/ml和白細(xì)胞介素 -1受體詰抗劑含量超過15ng/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β 1含量超過13ng/ml和超氧化歧化酶含量超過5ng/ml;抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核因子 相關(guān)因子2含量超過5ng/ml;以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過3ng/ml和中性粒細(xì)胞胞楽:因 子2含量超過6ng/ml。
[0016] 濃縮液中抗炎癥分子白介素12含量超過100ng/ml，白介素8含量超過400ng/ml和 白細(xì)胞介素-1受體詰抗劑含量超過60ng/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β?含量超過50ng/ml 和超氧化歧化酶含量超過20ng/ml;抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核因子相關(guān)因子2含量超 過20ng/ml，以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過6ng/ml和中性粒細(xì)胞胞楽:因子2含量超過 llng/ml〇
[0017]優(yōu)選地為選擇含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液作為美容原料。
[0018] 本發(fā)明提供的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液凍干粉，可以作為生物美容原料，添加 到面霜、潤膚露和爽膚水等化妝品中生產(chǎn)成相關(guān)產(chǎn)品，凍干粉加入溶媒或生理鹽水溶解后， 加入到面霜、潤膚露和爽膚水等中混勻即可。
[0019] 本發(fā)明提供的一種免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容面膜，其特征在于，其由如下 成分組成：
[0020] 1 )5-50ml如上所述的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液；
[0021] 2)1張無紡布、生物纖維膜、蠶絲膜或水凝膠膜等；
[0022] 將面膜裝入含10ml濃縮液的錫箱紙袋中，熱縮密封包裝，形成產(chǎn)品；該生物面膜產(chǎn) 品保存在4°C條件下，保質(zhì)期為1個月。
[0023] 優(yōu)選地，選擇蠶絲膜或水凝膠膜作面膜原材料。
[0024]本發(fā)明提供的一種免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容精華液，其特征在于，其由如 下成分組成：
[0025] 取如上所述的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液10ml，裝入10ml滴瓶或帶噴嘴 瓶中，生產(chǎn)成皮膚抗炎抗氧化精華液。
[0026] 或取1瓶凍干粉用10ml溶媒進(jìn)行溶解，裝入10ml滴瓶或帶噴嘴瓶中，生產(chǎn)成皮膚抗 炎抗氧化精華液。
[0027] 裝盒包裝后形成產(chǎn)品，保存在4°C條件下，保質(zhì)期為1個月。
[0028] 通過本發(fā)明的方法，通過獲取的免疫細(xì)胞培養(yǎng)液、含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液及 其濃縮液富含抗炎癥和抗氧化分子，可以制備成面霜、潤膚露、爽膚水、面膜和精華液等產(chǎn) 品，能夠?qū)ζつw具有祛皺、粉刺瘢痕與疤痕修復(fù)、除斑以及抗氧化等美容作用。特別當(dāng)聯(lián)合 物理美容療法使用時，將產(chǎn)生更佳的美容療效，即高溫深藍(lán)射頻美容療法、微針療法等，能 打開表皮毛孔或微創(chuàng)表皮皮層，為細(xì)胞因子進(jìn)入皮膚的通道。
【附圖說明】
[0029] 圖1表示由實(shí)施例2所制備自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)液、含裂解液的培養(yǎng)液以及濃縮液 中各細(xì)胞因子表達(dá)和分泌水平圖
[0030] 圖2表示由實(shí)施例4所制備自然殺傷細(xì)胞精華液對面部粉刺受試者使用前后變化 圖
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的制備方法，其中，所述方 法包括通過從培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液和裂解免疫細(xì)胞獲得的蛋白懸液，經(jīng)超濃縮后制備成 免疫細(xì)胞精華液，富含抗炎抗氧化成分;經(jīng)冷凍干燥后制備成凍干粉，可以長期在_80°C超 低溫冰箱保存，成為皮膚抗炎抗氧化的生物美容原料。
[0032] 所述人免疫細(xì)胞為細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，優(yōu)選地，為細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和自然殺傷T 淋巴細(xì)胞。
[0033] 本發(fā)明所述方法中免疫細(xì)胞來源于人靜脈血、骨髓、臍帶血和胎盤血等的單個核 細(xì)胞。優(yōu)選地，來源于新鮮外周血或臍帶血。
[0034] 所述免疫細(xì)胞來源人外周血或臍帶血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后獲得單 個核細(xì)胞，使用100-5000IU/ml細(xì)胞因子干擾素 γ、5-500ng/ml抗人CD3單抗、10-1000IU/ml 白介素 Ια和50-5000IU/ml白介素2在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20天獲得細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷 細(xì)胞及其培養(yǎng)液；或通過細(xì)胞因子5_500ng/ml白介素15、5-500ng/ml白介素18和50-5000 IU/ml白介素2在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20天獲得自然殺傷細(xì)胞及其培養(yǎng)液;或通過 細(xì)胞因子5_500ng/ml白介素15和5-1000ng/mla-GalCer在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20天獲 得自然殺傷T淋巴細(xì)胞及其培養(yǎng)液。
[0035] 本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基為細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，如CellGro SCGM、AIM-V、X-VIVO 和GT-T551等商品化產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基含0.1-200μg/ml氫化可地 松、l_500μg/ml抗壞血酸和l-1000μg/ml人胰島素。
[0036] 將獲得免疫細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取109細(xì)胞加入l-10mllXPBS(pH=7.4)混勻后并加入 〇.l_5ug蛋白酶抑制劑，放置于冰上在超聲破碎儀中破碎3-10分鐘，高速15000轉(zhuǎn)每分種 (rpm)離心20min，取上清加入到1L培養(yǎng)過免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液中。再將該免疫細(xì)胞裂解液的 培養(yǎng)液通過1〇〇_1〇〇〇分子量的透析袋進(jìn)行透析濃縮，或者通過1〇〇 _1〇〇〇分子量的醋酸纖維 素膜進(jìn)行超濾濃縮，濃縮1-10倍，獲得100ml-500ml濃縮液。
[0037] 取l_5ml濃縮液加入到西林瓶中，在冷凍干燥儀中冷凍干燥得到凍干粉，壓蓋密封 后貼簽，放置-80°C冰箱保存，制備成美容化妝品原料。
[0038] 本發(fā)明制備的免疫細(xì)胞培養(yǎng)液、含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液及其濃縮液經(jīng)酶聯(lián)免 疫吸附測定ELISA試劑盒檢測富含抗炎抗氧化分子，即：培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液中分泌的抗 炎癥分子白介素12含量超過10000pg/ml，白介素8含量超過100000pg/ml和白細(xì)胞介素-1受 體詰抗劑含量超過5000pg/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β?含量超過7000pg/ml和超氧化歧 化酶含量超過2000pg/ml，以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過1500pg/ml和中性粒細(xì)胞胞漿因 子2含量超過4000pg/ml。
[0039] 含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中抗炎癥分子白介素12含量超過20ng/ml，白介素8含 量超過150ng/ml和白細(xì)胞介素-1受體詰抗劑含量超過15ng/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β 1含量超過13ng/ml和超氧化歧化酶含量超過5ng/ml;抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核因子 相關(guān)因子2含量超過5ng/ml;以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過3ng/ml和中性粒細(xì)胞胞楽:因 子2含量超過6ng/ml。
[0040]濃縮液中抗炎癥分子白介素 12含量超過100ng/ml，白介素 8含量超過400ng/ml和 白細(xì)胞介素 -1受體詰抗劑含量超過60ng/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β?含量超過50ng/ml 和超氧化歧化酶含量超過20ng/ml;抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核因子相關(guān)因子2含量超 過20ng/ml，以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過6ng/ml和中性粒細(xì)胞胞楽:因子2含量超過 llng/ml〇
[0041 ]優(yōu)選地為選擇含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液作為美容原料。
[0042] 本發(fā)明提供的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液凍干粉，可以作為生物美容原料，添加 到面霜、潤膚露和爽膚水等化妝品中生產(chǎn)成相關(guān)產(chǎn)品，即取1瓶凍干粉加入lml溶媒或生理 鹽水溶解后，加入到50ml面霜、潤膚露和爽膚水等中混勻即可。
[0043] 本發(fā)明提供的一種免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容面膜，其特征在于，其由如下 成分組成：
[0044] 1 )5_50ml如上所述的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液；
[0045] 2)1張無紡布、生物纖維膜、蠶絲膜或水凝膠膜等；
[0046] 將面膜裝入含10ml濃縮液的錫箱紙袋中，熱縮密封包裝，形成產(chǎn)品；該生物面膜產(chǎn) 品保存在4°C條件下，保質(zhì)期為1個月。
[0047] 優(yōu)選地，選擇蠶絲膜或水凝膠膜作面膜原材料。
[0048] 本發(fā)明提供的一種免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容精華液，其特征在于，其由如 下成分組成：
[0049] 取如上所述的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液10ml，裝入10ml滴瓶或帶噴嘴 瓶中，生產(chǎn)成皮膚抗炎抗氧化精華液。
[0050] 或取1瓶凍干粉用10ml溶媒進(jìn)行溶解，裝入10ml滴瓶或帶噴嘴瓶中，生產(chǎn)成皮膚抗 炎抗氧化精華液。
[0051 ]裝盒包裝后形成產(chǎn)品，保存在4°C條件下，保質(zhì)期為1個月。
[0052]本發(fā)明提供了通過獲取的免疫細(xì)胞培養(yǎng)液、含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液及其濃縮 液富含抗炎癥和抗氧化分子，可以制備成面霜、潤膚露、爽膚水、面膜和精華液等產(chǎn)品，能夠 對皮膚具有祛皺、粉刺瘢痕與疤痕修復(fù)、除斑以及抗氧化等美容作用。本發(fā)明還提供了聯(lián)合 物理美容療法使用，即高溫深藍(lán)射頻美容療法、微針療法等，能打開表皮毛孔或微創(chuàng)表皮皮 層，為細(xì)胞因子進(jìn)入皮膚的通道，將產(chǎn)生更佳的美容療效。
[0053]以下，對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。 [0054]實(shí)施例1人免疫細(xì)胞的培養(yǎng)
[0055]采集志愿者10〇1111外周血(與其簽署知情同意書），將其用1乂？83(?!1值為7.4)稀釋 1倍后，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后獲得單個核細(xì)胞，使用l〇〇〇IU/ml細(xì)胞因子干擾素 γ、50ng/ml抗人CD3單抗、100IU/ml白介素 Ια和500IU/ml白介素2(均購自德國美天旎公司） 在無血清培養(yǎng)基AIM-V (含50μg/ml氫化可地松、10μg/ml抗壞血酸和50μg/ml人胰島素，均購 自美國生命公司）中連續(xù)培養(yǎng)20天，獲得5.0 X 109細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞，以及3.0L培養(yǎng) 液。
[0056] 使用細(xì)胞因子200ng/ml白介素15、100ng/ml白介素18和lOOOIU/ml白介素2(均購 自德國美天旎公司）在無血清培養(yǎng)基AM-V中連續(xù)培養(yǎng)20天，獲得3.0X109自然殺傷細(xì)胞以 及2.0L培養(yǎng)液。
[0057] 使用細(xì)胞因子100ng/ml白介素15和1000ng/mla-GalCer(均購自德國美天旎公司） 在無血清培養(yǎng)基AM-V中連續(xù)培養(yǎng)20天，獲得3.6 X109自然殺傷T淋巴細(xì)胞以及2.4L培養(yǎng) 液。
[0058]實(shí)施例2人免疫細(xì)胞來源美容原料制備
[0059] 取實(shí)施例1中獲得的免疫細(xì)胞加入10ml lXPBS(pH = 7.4)混勻后并加入lug蛋白 酶抑制劑(大連寶生物公司），放置于冰上在超聲破碎儀(美國熱電公司）中破碎8分鐘，高速 15000轉(zhuǎn)rpm離心20min，取上清加入到培養(yǎng)過免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液中。
[0060] 將含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液加入到500分子量的透析袋(美國光譜公司）中，放 置冰箱冷藏中進(jìn)行透析濃縮，體積濃縮5倍。
[0061] 另外，也可以將含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液使用500分子量的醋酸纖維素膜(美國 光譜公司)進(jìn)行超濾濃縮，體積濃縮5倍。
[0062] 細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和自然殺傷T淋巴細(xì)胞濃縮后分別獲得 600ml、400ml和480ml濃縮液，取5ml免疫細(xì)胞濃縮液加入到西林瓶中，在冷凍干燥儀(美國 熱電公司）中冷凍干燥得到凍干粉，壓蓋密封后貼簽，放置-80°C冰箱保存，制備成美容化妝 品原料。
[0063] 實(shí)施例3人免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)與分泌水平檢測
[0064] 取實(shí)施例1中制備的免疫細(xì)胞培養(yǎng)液、含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液及其濃縮液經(jīng) ELISA試劑盒(美國R&D系統(tǒng)公司）檢測其中細(xì)胞表達(dá)和分泌水平，使用步驟參照使用說明 書，均以與未培養(yǎng)過免疫細(xì)胞的Am-v培養(yǎng)基做空白對照。表1中為免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液、含免 疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液和濃縮液中各細(xì)胞因子表達(dá)和分泌水平，所述單位為ng/ml。
[0065] 表 1
[0066]
[0067] 表1中顯示免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液、含裂解液的培養(yǎng)液以及濃縮液中均分泌高水平的 抗炎癥分子和抗氧化分子，其中細(xì)胞裂解液中含有雙重作用的Nrf2分子，表明這些細(xì)胞因 子在皮膚美容方面將發(fā)揮抗炎癥和抗氧化的作用。特別發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中 均高表達(dá)細(xì)胞生長因子ICAM-1和NCF-2,其在功能上具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和皮膚修復(fù)的作用。
[0068] 圖1為自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)液、含裂解液的培養(yǎng)液以及濃縮液中各細(xì)胞因子表達(dá) 和分泌水平圖，與原始AIM-V培養(yǎng)基相比，自然殺傷細(xì)胞具有很好的細(xì)胞因子分泌水平。
[0069] 實(shí)施例4制備免疫細(xì)胞培養(yǎng)液的美容產(chǎn)品
[0070] 制備免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容面膜，如下成分組成：
[0071 ] 1) 10ml實(shí)施例2制備的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液；
[0072] 2)1張水凝膠膜；
[0073] 將面膜裝入含10ml濃縮液的錫箱紙袋中，熱縮密封包裝，形成產(chǎn)品；該生物面膜產(chǎn) 品保存在4°C條件下，保質(zhì)期為1個月。
[0074] 制備免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容精華液，由如下成分組成：
[0075] 取實(shí)施例2制備的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液10ml，裝入10ml滴瓶或帶 噴嘴瓶中，生產(chǎn)成皮膚抗炎抗氧化精華液。
[0076] 或取實(shí)施例2制備的1瓶凍干粉用10ml溶媒進(jìn)行溶解，裝入10ml滴瓶或帶噴嘴瓶 中，生產(chǎn)成皮膚抗炎抗氧化精華液。
[0077] 裝盒包裝后形成產(chǎn)品，保存在4°C條件下，保質(zhì)期為1個月。
[0078]實(shí)施例5免疫細(xì)胞美容精華液
[0079]招募10名面部有紅斑和粉刺的受試者（簽署知情同意書），每天早上和完善睡覺 前，用潔面露洗臉，略干后涂抹或噴灑實(shí)施例4中制備的自然殺傷細(xì)胞美容精華液，連續(xù)使 用14天時間。
[0080]全部受試者中有紅斑者均全部消失，有粉刺者粉刺減輕或完全消退，圖2中其中面 部粉刺受試者使用前后變化圖，A為使用自然殺傷細(xì)胞美容精華液前的圖片，B為自然殺傷 細(xì)胞美容精華液使用14天后的圖片;可以發(fā)現(xiàn)其粉刺得到很好的改善，皮膚變得光滑、變白 和細(xì)潤。
【主權(quán)項】
1. 一種免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的制備方法，其特征在于，所述方法包括通過從 培養(yǎng)人免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液和裂解人免疫細(xì)胞獲得的蛋白懸液，經(jīng)超濃縮后制備成免疫細(xì)胞 精華液;經(jīng)冷凍干燥后制備成凍干粉，可以長期在-80°c超低溫冰箱保存； 其中，免疫細(xì)胞的培養(yǎng)使用無血清培養(yǎng)基，優(yōu)選其含〇. l-200μg/ml氫化可地松、1-500μ g/ml抗壞血酸和l-1000μg/ml人胰島素。 所述免疫細(xì)胞精華液或凍干粉可用作生物美容原料； 所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)液、含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液及其濃縮液富含白介素12 (interleukin 12，IL-12)、白介素8( interleukin 8，IL-8)、白細(xì)胞介素-1 受體詰抗劑 (interleukin 1 receptor antagonist，IL-lRa)、車?；L因子01(transforming growth factor-βΙ，TGF_01)、超氧化歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD)、核因子相關(guān)因子2 (nuclear factor E2_related factor 2，Nrf2)、細(xì)胞間粘附分子-l(ICAM-l)、中性粒細(xì)胞 胞漿因子2(NCF-2); 培養(yǎng)人免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA試劑盒檢測，其中，抗炎癥分子白 介素12含量超過10000pg/ml，白介素8含量超過100000pg/ml和白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑含 量超過5000pg/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子含量超過7000pg/ml和超氧化歧化酶含量超過 2000pg/ml;免疫細(xì)胞表達(dá)抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核因子相關(guān)因子2含量超過 2000pg/ml;以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過1500pg/ml和中性粒細(xì)胞胞漿因子2含量超過 4000pg/ml。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA試劑盒檢測，含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中抗炎癥分子白 介素12含量超過20ng/ml，白介素8含量超過150ng/ml和白細(xì)胞介素-1受體詰抗劑含量超過 15ng/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β?含量超過13ng/ml和超氧化歧化酶含量超過5ng/ml; 抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核因子相關(guān)因子2含量超過5ng/ml;以及細(xì)胞間粘附分子-1 含量超過3ng/ml和中性粒細(xì)胞胞楽:因子2含量超過6ng/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項所述的方法，其特征在于，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA試劑 盒檢測， 培養(yǎng)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液中分泌的抗炎癥分子白介素12含量超過10000pg/ml，白介素8 含量超過l〇〇〇〇〇pg/ml和白細(xì)胞介素-1受體詰抗劑含量超過5000pg/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生 長因子β?含量超過7000pg/ml和超氧化歧化酶含量超過2000pg/ml，以及細(xì)胞間粘附分子-1 含量超過1500pg/ml和中性粒細(xì)胞胞漿因子2含量超過4000pg/ml。 或/和，含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中抗炎癥分子白介素12含量超過20ng/ml，白介素8 含量超過150ng/ml和白細(xì)胞介素-1受體詰抗劑含量超過15ng/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因 子β?含量超過13ng/ml和超氧化歧化酶含量超過5ng/ml;抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核 因子相關(guān)因子2含量超過5ng/ml，以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過3ng/ml和中性粒細(xì)胞胞 衆(zhòng)因子2含量超過6ng/ml。 或/和，濃縮液中抗炎癥分子白介素12含量超過100ng/ml，白介素8含量超過400ng/ml 和白細(xì)胞介素-1受體詰抗劑含量超過60ng/ml;抗氧化因子轉(zhuǎn)化生長因子β?含量超過50ng/ ml和超氧化歧化酶含量超過20ng/ml;抗炎癥和抗氧化雙重作用分子核因子相關(guān)因子2含量 超過20ng/ml，以及細(xì)胞間粘附分子-1含量超過6ng/ml和中性粒細(xì)胞胞楽:因子2含量超過 llng/ml〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞來源人外周血或臍 帶血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后獲得單個核細(xì)胞； 培養(yǎng)方法為： 使用細(xì)胞因子干擾素 γ、抗人CD3單抗、白介素 Ια和白介素2在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培 養(yǎng)20天獲得細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞及其培養(yǎng)液； 或通過細(xì)胞因子白介素15、白介素18和白介素2在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20天獲得 自然殺傷細(xì)胞及其培養(yǎng)液； 或通過細(xì)胞因子白介素15和α-GalCer在無血清培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)20天獲得自然殺傷Τ 淋巴細(xì)胞及其培養(yǎng)液。 所述無血清培養(yǎng)基含〇· l_200μg/ml氫化可地松、l_500μg/ml抗壞血酸和l-1000μg/ml 人膜島素。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 將獲得免疫細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取1〇9細(xì)胞加入l-l〇ml 1 X PBS混勻后并加入0. l-5ug蛋白酶 抑制劑，放置于冰上在超聲破碎儀中破碎3-10分鐘，高速15000轉(zhuǎn)每分種(rpm)離心20min， 取上清加入到1L培養(yǎng)過免疫細(xì)胞的培養(yǎng)液中；再將該免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液通過100-1〇〇〇分子量的透析袋進(jìn)行透析濃縮，或者通過100-1000分子量的醋酸纖維素膜進(jìn)行超濾濃 縮，濃縮1 _1〇彳首，獲得l〇〇ml_500ml濃縮液； 取l-5ml濃縮液加入到西林瓶中，在冷凍干燥儀中冷凍干燥得到凍干粉，壓蓋密封后貼 簽，放置_80°C冰箱保存。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述人免疫細(xì)胞為細(xì)胞因子誘導(dǎo) 殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞;優(yōu)選地，其為細(xì)胞 因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或自然殺傷T淋巴細(xì)胞； 所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)液，優(yōu)選地為含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述凍干粉作為生物美容原料， 添加到面霜、潤膚露或爽膚水中生產(chǎn)成相關(guān)產(chǎn)品；其制備方法為，取1瓶凍干粉加入lml溶媒 或生理鹽水溶解后，加入到50ml面霜、潤膚露或爽膚水中混勻即可。8. -種免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容面膜，其特征在于，其由如下成分組成： 1 )5-50ml權(quán)利要求1-7任一項所述的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液； 2)面膜原材料:無紡布、生物纖維膜、蠶絲膜或水凝膠膜； 其制備方法為:將面膜原材料裝入含濃縮液的錫箱紙袋中，熱縮密封包裝，形成產(chǎn)品； 該面膜產(chǎn)品保存在4°C條件下，保質(zhì)期為1個月； 優(yōu)選地，選擇蠶絲膜或水凝膠膜作面膜原材料。9. 一種免疫細(xì)胞來源的抗炎抗氧化美容精華液，其特征在于，其制備方法為： 取權(quán)利要求1-7任一項所述的含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液的濃縮液10ml，裝入10ml滴 瓶或帶噴嘴瓶中，生產(chǎn)成皮膚抗炎抗氧化美容精華液； 或取1瓶所述凍干粉用l〇ml溶媒進(jìn)行溶解，裝入10ml滴瓶或帶噴嘴瓶中，生產(chǎn)成皮膚抗 炎抗氧化美容精華液； 裝盒包裝后形成產(chǎn)品，保存在4 °C條件下，保質(zhì)期為1個月。10.-種免疫細(xì)胞來源的生物美容原料的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟 步驟一、人免疫細(xì)胞的培養(yǎng) 采集志愿者l〇〇ml外周血，將其用1XPBS稀釋1倍后，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后 獲得單個核細(xì)胞； 所述培養(yǎng)方法為： 使用l〇〇〇IU/ml細(xì)胞因子干擾素 γ、50ng/ml抗人CD3單抗、100IU/ml白介素 Ια和500IU/ ml白介素2在無血清培養(yǎng)基AM-V中連續(xù)培養(yǎng)20天，獲得5.0 X 109細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞， 以及3.0L培養(yǎng)液;其中，所述無血清培養(yǎng)基含50μg/ml氫化可地松、10μg/ml抗壞血酸和50μ g/ml人胰島素； 或者，使用細(xì)胞因子200ng/ml白介素15、100ng/ml白介素18和1000IU/ml白介素2在無 血清培養(yǎng)基A頂-V中連續(xù)培養(yǎng)20天，獲得3.0 X 109自然殺傷細(xì)胞以及2.0L培養(yǎng)液； 或者，使用細(xì)胞因子l〇〇ng/ml白介素15和1000ng/mla-GalCer在無血清培養(yǎng)基A頂-V中 連續(xù)培養(yǎng)20天，獲得3.6 X 109自然殺傷T淋巴細(xì)胞以及2.4L培養(yǎng)液； 其中，所述無血清培養(yǎng)基AIM-V含50μg/ml氫化可地松、10μg/ml抗壞血酸和50μg/ml人 胰島素。 步驟二、人免疫細(xì)胞來源美容原料制備 取步驟一中獲得的免疫細(xì)胞加入l〇ml 1 Xros混勻后并加入lug蛋白酶抑制劑，放置于 冰上在超聲破碎儀中破碎8分鐘，高速15000轉(zhuǎn)rpm離心20min，取上清加入到培養(yǎng)過免疫細(xì) 胞的培養(yǎng)液中； 將含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液加入到500分子量的透析袋中，放置冰箱冷藏中進(jìn)行透 析濃縮，體積濃縮5倍； 或者，將含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液使用500分子量的醋酸纖維素膜進(jìn)行超濾濃縮，體 積濃縮5倍； 細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或自然殺傷T淋巴細(xì)胞濃縮后分別獲得600ml、 400ml和480ml濃縮液，取5ml免疫細(xì)胞濃縮液加入到西林瓶中，在冷凍干燥儀中冷凍干燥得 到凍干粉，壓蓋密封后貼簽，放置-80°C冰箱保存，制備成美容化妝品原料。 步驟三、人免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)與分泌水平檢測 取步驟一中制備的免疫細(xì)胞培養(yǎng)液、含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液及其濃縮液經(jīng)ELISA 試劑盒檢測其中細(xì)胞表達(dá)和分泌水平;其均富含如下細(xì)胞因子:IL-12、IL-8、IL-lRa、TGF-i3 l、S0D、Nrf2、ICAM-GmCF-2; 優(yōu)選，所述免疫細(xì)胞為細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞時，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12、IL-8、 11^-11^、了6卩-01、3〇〇、階€2、1〇厶1-1和％卩-2的含量分別為12.〇6、1〇1.93、7.57、8.42、2.57、 0·02、1·76和4.32; 所述含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中IL-12、IL-8、IL-lRa、TGF-m、S0D、Nrf2、ICAM-l和 從^-2的含量分別為24.51、169.13、17.66、15.9、6.5、5.65、4.46和7.57; 所述濃縮液中11^-12、11^-8、幾-11^、了6?-01、5〇〇、處€2、1〇厶1-1和％?-2的含量分別為 149.81、560.56、78.64、66.42、33.56、45.24、8.76和12.13; 進(jìn)一步優(yōu)選，所述免疫細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞時，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12、IL-8、 11^-11^、了6卩-01、3〇〇、階€2、1〇厶1-1和％卩-2的含量分別為14.43、113.42、5.48、7.56、3.16、 Ο.04、1.65和3.75; 所述含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中IL-12、IL-8、IL-lRa、TGF-m、SOD、Nrf2、ICAM-l和 從^-2的含量分別為21.71、170.21、16.67、14.32、7.01、5.24、5.08和6.69; 所述濃縮液中11^-12、11^-8、幾-11^、了6?-01、5〇〇、處€2、1〇厶1-1和％?-2的含量分別為 149.81、560.56、78.64、66.42、33.56、45.24、8.76和12.13; 進(jìn)一步優(yōu)選，所述免疫細(xì)胞為自然殺傷T淋巴細(xì)胞時，所述免疫細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12、 1卜8、1卜11^、丁6卩-01、5〇〇、處€2、1〇八1-1和％卩-2的含量分別為13.76、132.78、6.23、7.8、 3·09、0·01、2·06和3.98; 所述含免疫細(xì)胞裂解液的培養(yǎng)液中IL-12、IL-8、IL-lRa、TGF-m、SOD、Nrf2、ICAM-l和 從^-2的含量分別為25.81、181.43、18.52、16.45、7.71、6.16、3.84和7.51; 所述濃縮液中11^-12、11^-8、幾-11^、了6?-01、5〇〇、處€2、1〇厶1-1和％?-2的含量分別為 179.34、590.57、78.26、62.41、30.51、47.86、6.80和13.05; 上述因子含量的單位為ng/ml。
【文檔編號】A61P17/10GK105997835SQ201610303513
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】陳建勛, 黃啟明, 廖文敏
【申請人】紫程瑞生會(北京)生物技術(shù)發(fā)展有限公司