本發(fā)明涉及碳材料技術(shù)領(lǐng)域，及其在固定化上應(yīng)用。

背景技術(shù)：

碳纖維是指經(jīng)高溫碳化，含碳量超過(guò)85%以上的纖維材料，包括碳素纖維和石墨纖維。碳素纖維是有機(jī)纖維經(jīng)1000~2300℃處理后，含碳量為85~95%的纖維;石墨纖維是有機(jī)纖維經(jīng)2300℃以上處理，含碳量在98%以上的纖維。

碳纖維是一種高強(qiáng)度、高模量的新型纖維材料，具有生物相容性好、化學(xué)性能穩(wěn)定，高比表面積等優(yōu)良性能，這些特點(diǎn)決定碳纖維及活性炭纖維具備成為良好的固定化載體的特點(diǎn)。但是碳纖維出廠時(shí)表而一般涂有一層有機(jī)膠，其使碳纖維表面惰性增大、表面能變低，并缺乏有化學(xué)活性的官能團(tuán)，從而導(dǎo)致碳纖維表面反應(yīng)活性低，與基體的粘結(jié)性差，直接影響了碳纖維材料在固定化方向上的應(yīng)用。因此需要對(duì)碳纖維表面進(jìn)行改性處理，以提高其對(duì)基體的親和性和粘結(jié)性。傳統(tǒng)的碳纖維表面改性多采用強(qiáng)酸，強(qiáng)堿或者高溫來(lái)對(duì)碳纖維表面進(jìn)行表面改性，不僅耗時(shí)較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，而且還易導(dǎo)致環(huán)境污染，本發(fā)明欲提供一種新型的碳纖維表面改性方法來(lái)表面改性碳纖維，不僅耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，而且對(duì)環(huán)境污染較小。這對(duì)碳纖維應(yīng)用在固定化細(xì)胞領(lǐng)域有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種新型改性碳纖維表面的方法，來(lái)制備固定化載體材料,具有操作簡(jiǎn)單，制備污染小，耗時(shí)短，反應(yīng)效率高，易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)固定化載體材料在固定化木聚糖酶重復(fù)使用6次后，測(cè)得反應(yīng)酶活仍保持在60~80%左右；在固定化黑曲霉時(shí)，改性碳纖維制備的固定化載體材料的固定化細(xì)胞效率為90～100%，且其固定化細(xì)胞可連續(xù)使用6~8次，且降解AFB1效率可達(dá)到85~95%。

實(shí)驗(yàn)改性碳纖維反應(yīng)機(jī)理大致為：

Fe²⁺+H₂O₂==Fe³⁺+OH^-+HO·

Fe³⁺+H₂O₂+OH^-==Fe²⁺+H₂O+HO·

Fe³⁺+H₂O₂==Fe²⁺+H⁺ +HO₂

HO₂+H₂O₂==H₂O+O₂↑+HO·

HO·使這個(gè)體系具有強(qiáng)氧化能力，可以氧化一些難以被一般氧化劑氧化的物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)用其氧化能力來(lái)刻蝕碳纖維表面從而制備固定化材料。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

發(fā)明之碳纖維改性制備固定化材料，可采用以下方法制成，包括以下步驟：

a. 碳纖維預(yù)處理：將碳纖維切成長(zhǎng)度為0.5～1cm短切碳纖維

b.改性碳纖維：

1）在室溫條件下取適量的碳纖維加入到一定體積的30%過(guò)氧化氫中，加入量大致為1g:（50~100ml）

2）在室溫條件下，分批次少量加入含F(xiàn)e²⁺的金屬鹽，加入量為：摩爾濃度Fe²⁺：H₂O₂=1:（1~10）

3）待其反應(yīng)結(jié)束后再向其分批次多次加入30%過(guò)氧化氫10~50ml，反應(yīng)40~60min后停止加入過(guò)氧化氫。

4）將以上溶液離心分離，用5%的鹽酸和蒸餾水分別洗滌碳纖維3次，得到改性后的碳纖維。

5)干燥后，作為固定化載體進(jìn)一步用于固定化。

6)以上過(guò)程中加入方式在攪拌轉(zhuǎn)速180~250rpm，室溫條件下進(jìn)行。

進(jìn)一步，所述制備方法的步驟（b）中,在室溫條件下，加入30%過(guò)氧化氫中，加入量大致為1g:100ml。

進(jìn)一步，所述制備方法的步驟（b）中,在室溫條件下，分批次少量加入含F(xiàn)e²⁺試劑，總加入量為：摩爾濃度Fe²⁺：H₂O₂=1:3。

進(jìn)一步，所述制備方法的步驟（b）中,在室溫條件下，分批次少量加入的含F(xiàn)e²⁺試劑一般為FeSO₄和FeCl₂。

進(jìn)一步，所述制備方法的步驟（b）中，待其反應(yīng)結(jié)束后再向其分10次加入30%過(guò)氧化氫30ml，用時(shí)40min后停止加入過(guò)氧化氫。

有益效果

]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是利用碳纖維表面可修飾的特性，通過(guò)對(duì)碳纖維表面進(jìn)一步氧化處理，很大程度上增加其表面的親水性、粗糙度等來(lái)增加其固定化細(xì)胞或酶的能力。實(shí)驗(yàn)制備改性碳纖維固定化載體具有操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。

采用本發(fā)明制備方法獲得的碳纖維具有比表面積高、表面粗糙度大、親水性好等特點(diǎn)，比表面積高、表面粗糙度大能夠?yàn)榧?xì)胞或酶提供更多的吸附位點(diǎn)，親水性增加，進(jìn)一步增強(qiáng)了碳纖維表面與細(xì)胞或酶之間的吸引力。

碳纖維材料，無(wú)論是活性炭纖維還是改性后的碳纖維，其在固定化應(yīng)用中所使用的固定方法多通過(guò)自身物理吸附性對(duì)細(xì)胞或酶進(jìn)行固定。其優(yōu)勢(shì)在于，可通過(guò)改性碳纖維表面特征，來(lái)調(diào)節(jié)其固定化效率。

附圖說(shuō)明

圖1為改性碳纖維固定化細(xì)胞SEM圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體的實(shí)施方式進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例是用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，而不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本發(fā)明所涉及的相關(guān)內(nèi)容及所做的修改，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。

實(shí)施例1改性碳纖維固定化載體的制備：

將碳纖維切成長(zhǎng)度為1cm短切碳纖維。

]在室溫條件下取2g的碳纖維加入到200ml的30%過(guò)氧化氫中。

在室溫條件下，分批次少量加入硫酸亞鐵91.2g。

待其反應(yīng)結(jié)束后再向其10次加入30%過(guò)氧化氫30ml用時(shí)40min后停止加入過(guò)氧化氫。

將以上溶液離心分離，用5%的鹽酸和蒸餾水分別洗滌處理后碳纖維3次，得到改性后的碳纖維，

干燥后，作為固定化載體進(jìn)一步用于固定化。

以上過(guò)程中加入方式在攪拌轉(zhuǎn)速220rpm，室溫條件下進(jìn)行。

實(shí)施例2

]本實(shí)施方式與實(shí)施例1不同的是：在室溫條件下，分批次少量加入氯化亞鐵76.2g。其他與具體實(shí)施方式1相同。

實(shí)施例3

改性碳纖維固定化載體用于固定化酶

取上述干燥后的碳纖維1g投入到100mlpH5.0的磷酸緩沖液所配制的10g/l的木聚糖酶溶液中，室溫下?lián)u床180rpm搖動(dòng)24h，之后用無(wú)水乙醇和純凈水洗去游離酶，即可得到固定化木聚糖酶。

固定化酶活力的測(cè)定

酶活定義：1g酶在55℃、pH5.0條件下，每分鐘催化分解木聚糖產(chǎn)生1mg木糖的量為一個(gè)酶活力單位，以IU/mg表示。

固定化酶活力的測(cè)定：將50ml木聚糖溶液加入至250ml錐形瓶中并水浴加熱至55℃，之后加入0.5g固定化酶，準(zhǔn)確反應(yīng)20min.

木糖含量的測(cè)定：配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用DNS法測(cè)定其木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活計(jì)算：將所測(cè)得的吸光度值帶入木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中得到木糖含量。

酶活力=（木糖含量*5)*1000

固定化酶多批次酶活力測(cè)定

將固定化酶投入到催化反應(yīng)中，第一批發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其固定化酶活力，每批催化反應(yīng)后將固定化酶從反應(yīng)液取出，用pH5.0的磷酸緩沖液沖洗后重新加入到新的反應(yīng)液中，重新檢測(cè)酶活，在重復(fù)使用6次后，反應(yīng)酶活仍保持在60~80%左右。

實(shí)施例4

改性碳纖維固定化載體用于固定化黑曲霉

（1）固定化細(xì)胞的制備

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯300g、葡萄糖20g、蒸餾水1L、自然pH、121℃高壓滅菌15min。

種子培養(yǎng):將0.3g改性后碳纖維投入到種子培養(yǎng)基，裝液量為50/250m1，pH 6.5，115℃滅菌30min。冷卻后接種斜面種子，160rpm,30℃培養(yǎng)48h。

發(fā)酵液：將種子液(接種量3%體積比)接入250ml三角瓶中，裝液量：50/250m1。160rpm,30℃下震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，得發(fā)酵液。

（2）固定化細(xì)胞的應(yīng)用

每批次發(fā)酵結(jié)束后，將種子培養(yǎng)基中的菌懸液倒出（大約40ml)，只保留碳纖維，補(bǔ)加新發(fā)酵液40ml發(fā)酵液并加入AFB1（0.05ppm）,24h后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行AFB1提取與測(cè)定。依次類推，進(jìn)行多批次發(fā)酵降解實(shí)驗(yàn)。

每次所得產(chǎn)物的固定化效果及降解率通過(guò)以下方法測(cè)定：

1）固定化效率=吸附細(xì)胞重量/總細(xì)胞重量

2）AFB1的提取與測(cè)定

吸取1mL發(fā)酵液，用3 倍體積的氯仿提取濾液中AFB1，靜置分層，收集氯仿層，氮?dú)獯蹈?，加?00μL 正己烷，混勻后于40℃避光反應(yīng)15 min，再次氮?dú)獯蹈桑?mL 流動(dòng)相（乙腈:水=20:80）溶解AFB1 的衍生物，0.22μm 膜過(guò)濾，保存于棕色瓶。

液相采用柱前衍生 HPLC 熒光檢測(cè)方法對(duì)發(fā)酵液中 AFB1的含量進(jìn)行測(cè)定，色譜柱: C18柱，size:New Column 25*4.6mm, 流動(dòng)相：乙腈:水=20:80（v/v）；柱溫：30℃；流速：1mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)：360nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440nm；進(jìn)樣量：20μL

3）通過(guò)AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出其未降解AFB1的含量，從而計(jì)算其降解率。

本實(shí)施例中測(cè)得連續(xù)發(fā)酵降解過(guò)程中，改性碳纖維固定化載體的固定化細(xì)胞效率為90～100%，且其固定化細(xì)胞可連續(xù)使用6~8次，且降解率可達(dá)到85~95%。