專利名稱：制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因。
背景技術(shù)：
多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)是通過聯(lián)苯直接氯代反應(yīng)，形成的最多帶有十個(gè)氯元素的復(fù)雜化合物Furukawa，J Gen Appl Microbiol. 2000,46 觀3-四6。通過這樣的過程，理論上可以制造出209種同分異構(gòu)體。PCBs的熱化學(xué)穩(wěn)定性，抗氧化性和耐低壓等性質(zhì)使得它們被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，包括火焰阻化劑，石油冷凝器，絕緣體，可塑劑，熱交換器，以及液壓油等。一些研究主要是利用了單個(gè)的PCBs化合物，它們簡寫為 CBp、DCBp, TCBp, TeCBp, PeCBp, HCBp, HeCBp 和 OCBp，分別代表了一氯聯(lián)苯到八氯聯(lián)苯Jim 和 Field，Environmental Pollution，2008，155 :1_12。1930 年，PCBs 第一次生產(chǎn)了 1000噸，但是隨著用途的廣泛擴(kuò)大，制造量也在1975年以指數(shù)方式達(dá)到了 20萬噸的頂峰Abraham等，Curr Opin Microbiol，2002，5 :246_253。隨著工業(yè)的生產(chǎn)和應(yīng)用，多氯聯(lián)苯被持續(xù)排放到環(huán)境中。由于它們的疏水性，PCBs非常容易被土壤、沉淀物和淤泥中的有機(jī)物質(zhì)所吸收，PCBs主要被排放到水生環(huán)境中Wiegel和脅，2000，F(xiàn)EMS MicrobiologyEcology 32 1-15 ；Jim 禾口 Field, Environmental Pollution,2008,155 1-12。另外，各種PCBs化合物的辛醇/水分離系數(shù)很高，這就導(dǎo)致了他們很容易被脂肪組織所吸收。因此，PCBs對(duì)自然環(huán)境和人類健康都存在著較大的威脅，降解和修復(fù)PCBs污染迫在眉睫。生物降解是指從微生物到植物，或者它們的衍生物通過自身有機(jī)體降解污染物的過程。生物降解主要分為微生物降解、植物修復(fù)、微生物-植物共同修復(fù)三個(gè)方面。微生物降解與傳統(tǒng)的污染降解技術(shù)(例如焚燒)相比，它的主要優(yōu)點(diǎn)是降低了大量的費(fèi)用。不僅如此，微生物降解對(duì)污染物是永久的降解，而不像非生物降解一樣，有時(shí)污染物會(huì)由一種形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N形態(tài)，即二次污染Kuiper等，Mol Plant-Microbe Interact, 2004,17 6-15。因此，利用微生物降解法來解決多氯聯(lián)苯的污染問題即經(jīng)濟(jì)又實(shí)效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株的的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因，以進(jìn)一步分析該基因在制備降解有機(jī)污染物多氯聯(lián)苯工程微生物中的作用與功能。本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因，采用兩步連續(xù)延伸 PCR方法合成，其堿基序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因?yàn)镽RBPHCI基因。
所述RRBPHCI基因其編碼閱讀框由888bp組成，編碼成一個(gè)含295個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。所述的基因用于制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株，以及用于降解有機(jī)污染物多氯聯(lián)苯工程微生物。本發(fā)明所述的二羥基聯(lián)苯，可以為任意位次的二羥基聯(lián)苯，例如2，2_ 二羥基聯(lián)苯，2，3- 二羥基聯(lián)苯，2,4- 二羥基聯(lián)苯，或者4，4- 二羥基聯(lián)苯等。本發(fā)明有益效果本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了一種制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因RRBPHCI，它能在大腸桿菌中成功表達(dá)，可用于制備降解多氯聯(lián)苯微生物。


圖1為本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因的合成示意圖。圖2為本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中A為 RRBPHCI基因擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因在大腸桿菌中的表達(dá)電泳圖， 其中A為二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因。圖4為本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的最適反應(yīng)溫度圖。圖5為本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的最適反應(yīng) PH圖。圖6為本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性圖。圖7為金屬離子對(duì)本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的影響圖。圖8為過氧化氫對(duì)本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的影響圖。圖9為為十二烷基磺酸鈉對(duì)本發(fā)明的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的影響圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限于本發(fā)明所列舉的實(shí)施例。下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源包括大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所植物基因工程研究室保存。克隆載體pMD-18-Simple T、各類限制性內(nèi)切酶、連接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑公司購買。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA測序試劑盒購自美國應(yīng)用系統(tǒng)公司。下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻(xiàn)進(jìn)行Sambook J, FretsE F， Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed.Cold Spring HarborLaboratoryCN 102373227 A
說明書
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Press,1989。實(shí)施例1二羥基聯(lián)苯雙加氧酶RRBPHCI基因的引物設(shè)計(jì)和合成(一 )試驗(yàn)方法本發(fā)明基因合成采取PTDS 方法Xiong，aisheng 等，2004，Nucl Acids Res32, e98，共設(shè)計(jì)22根引物用于基因的合成，每個(gè)引物的長度為60bp。參見表1。引物兩端分別引入Bam H I和Mc I的酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成(http:// www. sanRon, com/)。表 1
權(quán)利要求
1.一種制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因，其特征在于，所述基因采用兩步連續(xù)延伸PCR方法合成，其堿基序列如SEQ ID No 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQID No 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因是RRBPHCI基因。
4.權(quán)利要求1所述的基因在大腸桿菌表達(dá)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的基因用于制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株。
6.權(quán)利要求1所述的基因用于降解有機(jī)污染物多氯聯(lián)苯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備降解多氯聯(lián)苯工程菌株的二羥基聯(lián)苯雙加氧酶基因，采用兩步連續(xù)延伸PCR方法合成，其堿基序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述基因是RRBPHCI基因，其編碼閱讀框由888bp組成，編碼成一個(gè)含295個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因在大腸桿菌中可以成功表達(dá)，可用于制備降解多氯聯(lián)苯微生物。
文檔編號(hào)A62D3/02GK102373227SQ20101025219
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 帥建軍, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 許晶, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院