專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫應(yīng)答評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及鑒定免疫調(diào)節(jié)肽的方法，更具體地，涉及通過(guò)免疫應(yīng)答的多重分析來(lái)鑒定抗原肽的新方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)提供了對(duì)抗微生物攻擊的保護(hù)。其真實(shí)的本質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，因?yàn)樗仨毮軌蜃R(shí)別并適應(yīng)不斷變化的威脅，同時(shí)限制對(duì)自我組織的附帶損害。這種復(fù)雜性的結(jié)果是免疫機(jī)能障礙，活性過(guò)度或不足，是許多人類(lèi)疾病的根源。獲得性免疫系統(tǒng)(包括B細(xì)胞和T細(xì)胞)識(shí)別分子模型形式的抗原，如肽，糖肽，磷肽和脂質(zhì)，結(jié)合并在分化類(lèi)別的抗原遞呈分子的范圍內(nèi)遞呈。由T細(xì)胞識(shí)別的抗原衍生的片段，例如肽，稱(chēng)為抗原決定部位。廣泛認(rèn)可的是通過(guò)T-細(xì)胞識(shí)別其特異性抗原決定部分是獲得性免疫功能中的關(guān)鍵事件。
這些分化的抗原遞呈分子包括i)典型的人白細(xì)胞抗原(HLA)蛋白，其是高度多形性的并可以分成兩個(gè)主要的類(lèi)別，I類(lèi)和II類(lèi)；ii)由HLA E，F(xiàn)和G亞基因座編碼的非典型群(Braud VM，Curr OpinImmunol.1999年2月；11(1)100-8)，和iii)抗原遞呈分子的CD1家族(Bendelac A，Science 1995年7月14日；269(5221)185-6)。HLA I類(lèi)分子由HLA A，B和C基因座編碼并對(duì)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞遞呈8-10個(gè)氨基酸(AA)肽(Adama EJ，Immunol Rev.2001年10月；18341-64)。HLA II類(lèi)分子對(duì)CD4+輔助T細(xì)胞遞呈12-16個(gè)AA肽并由HLA DR，DP和DQ基因座編碼(Korman AJ，ImmunolRev.1985年7月；8545-86)。T細(xì)胞只在抗原遞呈分子范圍內(nèi)且僅在合適的抗原加工和遞呈后識(shí)別抗原。對(duì)于HLA依賴(lài)性抗原遞呈，抗原加工通常包括蛋白質(zhì)的蛋白水解破裂作用，形成適合HLA分子凹槽的多肽，這種肽/HLA復(fù)合物隨后對(duì)T細(xì)胞在抗原遞呈細(xì)胞的細(xì)胞表面上遞呈(Rock，K，Adv Immunol，2002；801-70，CresswellP，Curr Biol.1994年6月1日；4(6)541-3)。非典型群由HLA E，F(xiàn)和G亞基因座編碼且特征在于低程度的多形性以及結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞并對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞遞呈有限系列肽的能力。已經(jīng)證明通過(guò)非典型HLA分子遞呈的肽的識(shí)別在如母體胎兒接觸和/或腫瘤免疫性方面的誘導(dǎo)免疫耐受性是重要的。這些分化分子中的其他重要群是CD1家族，其涉及脂質(zhì)如細(xì)菌糖脂對(duì)免疫系統(tǒng)中的分化效應(yīng)細(xì)胞的遞呈。
T細(xì)胞免疫性的三個(gè)主要類(lèi)型可以遵循抗原識(shí)別1型(Th-1)，2型(Th-2)和調(diào)節(jié)(T-調(diào)節(jié))。1型免疫性對(duì)于胞內(nèi)病原體的清除和抗腫瘤免疫性是重要的，其主要特征在于IFNγ(IFN-γ)的表達(dá)。2型免疫性對(duì)于胞外病原體的清除是關(guān)鍵的，其主要特征在于細(xì)胞因子如IL-4，IL-5，IL-9和IL-13的表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞因子如IL-10或TGF-β介導(dǎo)的T-調(diào)節(jié)類(lèi)型的免疫性，對(duì)于自我耐受性的產(chǎn)生和維持是必要的。這三種類(lèi)型的應(yīng)答不限于典型的TCR+CD8+T細(xì)胞，還可以通過(guò)γ/δTCR+CD8+T細(xì)胞以及天然殺傷(NK)細(xì)胞和NK T細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)。因此，特定抗原決定部位通過(guò)這些細(xì)拔類(lèi)型任一種識(shí)別導(dǎo)致它們的激活和與眾不同的專(zhuān)門(mén)化應(yīng)答。因此可以通過(guò)觀察細(xì)胞因子模式(1型，2型和T-調(diào)節(jié))的協(xié)調(diào)表達(dá)來(lái)描述免疫應(yīng)答的特性。
免疫反應(yīng)過(guò)程中合適T-細(xì)胞應(yīng)答的激活通常涉及一個(gè)分化應(yīng)答優(yōu)于其他的優(yōu)勢(shì)。這種合適的專(zhuān)門(mén)化T-細(xì)胞應(yīng)答的選擇性激活是疾病結(jié)果的關(guān)鍵決定因素。這是在麻風(fēng)個(gè)體應(yīng)答中證明的驚人實(shí)例，其中對(duì)感染的1型-應(yīng)答的特征在于保護(hù)性的免疫性而2型應(yīng)答通常導(dǎo)致致命的疾病。另一個(gè)關(guān)于腫瘤免疫性的驚人實(shí)例中，已經(jīng)表明導(dǎo)致朝向T-調(diào)節(jié)應(yīng)答的不合適轉(zhuǎn)變的tolerogenic抗原決定部分導(dǎo)致隨后人體中的腫瘤進(jìn)展，而通過(guò)腫瘤抗原決定部位激活1型應(yīng)答與腫瘤生長(zhǎng)的抑制相關(guān)。此外，如果自我抗原得到遞呈，遠(yuǎn)離T-調(diào)節(jié)應(yīng)答的不合適轉(zhuǎn)變可以導(dǎo)致自身免疫性疾病的產(chǎn)生。自身免疫性疾病特異性的臨床實(shí)況將取決于顯性應(yīng)答1型，如在1型糖尿病情況中，或2型，如在過(guò)敏的情況中。
因?yàn)檫@些專(zhuān)門(mén)化T-細(xì)胞應(yīng)答的激活取決于特異性抗原決定部位對(duì)它們的遞呈，因此鑒定這些肽抗原決定部位是有利的。通過(guò)在疾病狀態(tài)早期鑒定這些專(zhuān)門(mén)化的T-細(xì)胞抗原決定部位，提高合適的T-細(xì)胞應(yīng)答或消除不合適的T-細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)會(huì)增加，并因此轉(zhuǎn)變免疫應(yīng)答的平衡來(lái)改善疾病結(jié)果。這些抗原T-細(xì)胞抗原決定部位的定量鑒定和定性表征方法對(duì)于疫苗設(shè)計(jì)以及感染、自體免疫和腫瘤疾病的診斷和治療方法是重要的基礎(chǔ)。
發(fā)明概述本發(fā)明包括鑒定一種或多種來(lái)自個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)肽的組合物和方法，通過(guò)在取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的一種或多種肽的存在下培養(yǎng)個(gè)體的免疫細(xì)胞并同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)如特異性和對(duì)肽上抗原決定部位的細(xì)胞因子應(yīng)答，其中通過(guò)對(duì)個(gè)體HLA類(lèi)型無(wú)關(guān)的肽的免疫反應(yīng)性的存在來(lái)鑒定免疫調(diào)節(jié)肽。例如，反應(yīng)性抗原決定部位可以選自肽集合中的免疫調(diào)劑肽。該方法還包括從特定的個(gè)體分離肽特異性的效應(yīng)細(xì)胞。
另一個(gè)實(shí)例是鑒定一個(gè)或多個(gè)免疫調(diào)節(jié)片段的方法，通過(guò)從個(gè)體分離免疫細(xì)胞；在一個(gè)或多個(gè)來(lái)自處理過(guò)肽文庫(kù)的片段存在下培養(yǎng)免疫細(xì)胞；并同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫特異性參數(shù)和細(xì)胞因子對(duì)片段的應(yīng)答，其中通過(guò)對(duì)片段的免疫反應(yīng)性的存在來(lái)鑒定免疫調(diào)節(jié)片段。使用該方法，可以分離多種肽片段特異性的效應(yīng)細(xì)胞，甚至純化成例如混合物或無(wú)性繁殖群。另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明包括鑒定個(gè)體對(duì)抗原物質(zhì)表達(dá)的免疫反應(yīng)性類(lèi)型的方法，通過(guò)分離并在一個(gè)或多個(gè)抗原片段存在下培養(yǎng)一種或多種個(gè)體的免疫細(xì)胞；鑒定免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子；并基于應(yīng)答抗原物質(zhì)的協(xié)調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)來(lái)測(cè)定免疫反應(yīng)性類(lèi)型?？乖镔|(zhì)可以包括抗原，肽，微生物，細(xì)胞及其組合的混合物?？乖鞍装ň哂幸阎蛭粗被嵝蛄械碾?，來(lái)自已知或未知蛋白和/或肽片段，乃至在用于方法和隨后的表征之前通過(guò)大小分級(jí)取自己知蛋白質(zhì)或肽的重疊肽文庫(kù)。一些實(shí)施方案中，抗原材料包括以不同比例提供的多種抗原物質(zhì)和/或肽來(lái)驅(qū)動(dòng)免疫應(yīng)答的類(lèi)型，例如，Th1v.Th2或Tc1v.Tc2或其混合和組合。
本發(fā)明還包括用于測(cè)定個(gè)體免疫狀態(tài)的診斷方法，通過(guò)從個(gè)體分離免疫細(xì)胞，在取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的系列肽的存在下培養(yǎng)免疫細(xì)胞并同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)來(lái)鑒定至少一種用于個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)分子以基于鑒定所產(chǎn)生的細(xì)胞因子來(lái)測(cè)定對(duì)免疫調(diào)節(jié)分子的免疫反應(yīng)性類(lèi)型，其中免疫反應(yīng)性類(lèi)型表現(xiàn)出個(gè)體的免疫狀態(tài)。例如，該方法可以測(cè)定個(gè)體免疫抑制的程度，個(gè)體免疫系統(tǒng)超活化的程度，個(gè)體的T-細(xì)胞所有組成成分，甚至免疫反應(yīng)性類(lèi)型，其可以表現(xiàn)出個(gè)體免疫相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。使用本發(fā)明可以監(jiān)控的免疫相關(guān)疾病的非限制性實(shí)例包括傳染病，自身免疫性疾病，自體炎癥疾病，癌癥，慢性炎癥和過(guò)敏。
本發(fā)明的另一用途是在預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)治療應(yīng)答的方法中，其中在取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的存在下培養(yǎng)個(gè)體的免疫細(xì)胞，分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)來(lái)鑒定對(duì)于個(gè)體T細(xì)胞和HLA清單的至少一種免疫調(diào)節(jié)分子并分析培養(yǎng)物的細(xì)胞因子產(chǎn)生來(lái)測(cè)定對(duì)免疫調(diào)節(jié)分子的免疫反應(yīng)性類(lèi)型，在治療之前基于所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的鑒定來(lái)測(cè)定個(gè)體抗原決定部位特異性免疫狀態(tài)，作為治療結(jié)果的指示劑。治療可以是免疫治療，如接種疫苗，被動(dòng)免疫治療和過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。另一個(gè)實(shí)例是預(yù)測(cè)個(gè)體疾病進(jìn)程和臨床結(jié)果的方法，通過(guò)在取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的系列肽存在下培養(yǎng)一種或多種個(gè)體的免疫細(xì)胞，并分析培養(yǎng)物的細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生特征來(lái)測(cè)定對(duì)免疫調(diào)節(jié)分子的免疫反應(yīng)性類(lèi)型，其中細(xì)胞因子產(chǎn)生特征是疾病嚴(yán)重程度和疾病進(jìn)展或退化狀態(tài)的標(biāo)志。
另一個(gè)實(shí)例是定制用于個(gè)體的治療干預(yù)的方法，通過(guò)基于多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)的分析包括所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的分析來(lái)鑒定一種或多種個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)分子；并制備含有一種或多種免疫調(diào)節(jié)分子的抗原決定部位特異性免疫疫苗。疫苗包括，例如，一種或多種提高或降低個(gè)體特定類(lèi)型的免疫應(yīng)答的抗原；一種或多種提高或降低個(gè)體抗原決定部位特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生的抗原；一種或多種提高或降低個(gè)體抗原產(chǎn)生或提高細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的抗原。
再一個(gè)免疫調(diào)節(jié)個(gè)體的方法包括用一種或多種從文庫(kù)鑒定的免疫調(diào)節(jié)肽使個(gè)體免疫；測(cè)定個(gè)體的抗原決定部位特異性免疫狀態(tài)，通過(guò)在暴露于一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽后分離個(gè)體的免疫細(xì)胞；并比較免疫之前和之后的免疫應(yīng)答類(lèi)型來(lái)測(cè)定個(gè)體抗原決定部位特異性免疫狀態(tài)的改變。
實(shí)施中，治療需要免疫治療的個(gè)體的方法包括將個(gè)體的免疫細(xì)胞暴露于一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽來(lái)測(cè)定由一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽引發(fā)的免疫應(yīng)答類(lèi)型；用影響免疫應(yīng)答類(lèi)型的免疫調(diào)節(jié)肽來(lái)治療個(gè)體；在用一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽治療個(gè)體后評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答的類(lèi)型，且如果需要，改變一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽來(lái)改變免疫應(yīng)答類(lèi)型。治療效力的測(cè)定可以用來(lái)監(jiān)控疫苗治療，抗癌治療，抗腫瘤治療，器官移植，過(guò)敏，自身免疫性疾病的治療和傳染病的治療。本發(fā)明的另一種方法包括鑒定和表征用于免疫治療的新治療劑，通過(guò)在免疫調(diào)節(jié)劑和一種或多種取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的肽的存在或不存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞；同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)如特異性和對(duì)肽上的抗原決定部位的細(xì)胞因子應(yīng)答；并將免疫調(diào)節(jié)劑存在時(shí)的免疫反應(yīng)性和免疫調(diào)節(jié)劑不存在時(shí)的免疫反應(yīng)性相比較，其中免疫反應(yīng)性的抑制表示為免疫抑制治療劑，其中免疫反應(yīng)性的提高表示為佐劑，甚至可以驅(qū)動(dòng)對(duì)Th1，Th2，Tc1，Tc2或其組合的免疫應(yīng)答類(lèi)型。
通過(guò)以下方法來(lái)鑒定一種或多種治療劑在免疫調(diào)節(jié)劑和一個(gè)或多個(gè)來(lái)自目標(biāo)抗原劑的片段存在和不存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞；同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)如特異性和對(duì)片段的細(xì)胞因子應(yīng)答；并分離免疫反應(yīng)性細(xì)胞?？乖瓌┛梢允莻魅静?，癌癥，腫瘤，自身免疫性疾病，自體炎癥疾病，關(guān)節(jié)炎，糖尿病，過(guò)敏，器官移植和骨髓移植。還可以通過(guò)以下方法來(lái)鑒定疫苗抗原決定部位在一種或多種取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的肽的存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞；分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)和細(xì)胞因子產(chǎn)生以基于所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的鑒定來(lái)測(cè)定對(duì)肽的免疫反應(yīng)性類(lèi)型；并使用一個(gè)或多個(gè)具有相同鑒定序列的肽來(lái)制備疫苗。該方法足夠靈活使得甚至可以在分離后測(cè)定一種或多種肽。還可以通過(guò)以下方法來(lái)鑒定疫苗抗原決定部位在取自抗原劑的重疊肽文庫(kù)的系列肽的存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞并分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)和培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子產(chǎn)生來(lái)測(cè)定對(duì)一種或多種肽的免疫反應(yīng)性類(lèi)型，其中疫苗抗原決定部分的特征在于它們引發(fā)了對(duì)抗原劑的免疫反應(yīng)性?？乖瓌┑膶?shí)例包括病毒，細(xì)菌，真菌，原生生物，寄生物或蠕蟲(chóng)?？乖瓌┛梢允亲晕铱乖?。還可以分析細(xì)胞培養(yǎng)物并測(cè)定一種或多種T細(xì)胞，B細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和紅血球的特征。
本發(fā)明的組合物包括一種或多種從對(duì)于特定個(gè)體鑒定為免疫反應(yīng)性的肽文庫(kù)分離的選擇來(lái)改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的肽，已經(jīng)在該個(gè)體中鑒定了對(duì)于Th1和Th2T細(xì)胞的反應(yīng)性肽。再一個(gè)實(shí)例組合物包括一種或多種從對(duì)于特定個(gè)體鑒定為免疫反應(yīng)性的肽文庫(kù)分離的選擇來(lái)改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的肽，已經(jīng)在該個(gè)體中鑒定了對(duì)于Tc1和Tc2 T細(xì)胞的反應(yīng)性肽?？梢詫⑦@些組合物配制成疫苗，以干的或液體形式等。
附圖簡(jiǎn)述為了更完整地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在參照本發(fā)明的詳述和附圖，其中

圖1是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常捐獻(xiàn)者的免疫應(yīng)答的圖，其中從HLA-A0201+健康志愿者新鮮吸出的血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以2×105細(xì)胞/孔重復(fù)三份接種于圓底96-孔平板中，并用1μl的HLA-A0201限制性肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV)或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)孵育；48h后收集培養(yǎng)物上清液并使用Luminex技術(shù)來(lái)定量評(píng)價(jià)細(xì)胞因子和趨化因子的存在；圖2是描繪了根據(jù)本發(fā)明的正常捐獻(xiàn)者對(duì)HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)的免疫應(yīng)答的另一個(gè)實(shí)例的圖。從另一個(gè)HLA-A0201+健康志愿者新鮮吸出的血液中分離PBMC，以5×105細(xì)胞/孔重復(fù)三份接種于圓底96孔平板中，并用10μl/ml的HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV)或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)孵育；48h后收集培養(yǎng)物上清液并使用Luminex技術(shù)來(lái)定量評(píng)價(jià)細(xì)胞因子和趨化因子的存在；圖3A-3D是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的2名黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖4A-4C是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖5是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常捐獻(xiàn)者免疫應(yīng)答動(dòng)力學(xué)的圖；圖6描繪了根據(jù)本發(fā)明的抗原決定部位聚焦的略圖，其中將重疊肽文庫(kù)分成肽簇(5-10個(gè)肽/簇)，進(jìn)行簇的分析，接著抗原決定部位聚焦；圖7是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖8是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖9是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖10是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖11是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；
圖12A和12B是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其中用15-mer MART-1肽或稀釋劑刺激DC接種前和8次DC接種疫苗后從黑素瘤患者(與圖10的相同)獲得的PBMC；圖13是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖14是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖15是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖16A-D是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖17是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖18是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖19是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖20是描繪了用圖19中所示的鑒定15-mer肽刺激時(shí)CD4+T細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生的圖；圖21A-B是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，使用從圖19所示的相同黑素瘤患者獲得的PBMC。
圖22A-C是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖23是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖24是描繪了用圖23中所示的鑒定15-mer肽刺激時(shí)CD4+T細(xì)胞的IL-5產(chǎn)生的圖。
圖25是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖26是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的三名黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖27描繪了用EPIMAX方法鑒定的4種黑素瘤抗原，即gp100，MART-1，NY-ESO1和TRP-1內(nèi)的CD4+和CD8+T細(xì)胞的新抗原決定部位的概述；圖28描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的三名黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖29A-D是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖30包括描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖31是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖32是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖；圖33包括描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的三名正常健康志愿者的免疫應(yīng)答的圖；圖34包括描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的三名正常健康志愿者的免疫應(yīng)答的圖；
圖35包括描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者的免疫應(yīng)答的圖；圖36是描繪了根據(jù)本發(fā)明從凍融的PBMC評(píng)價(jià)三名正常健康志愿者的免疫應(yīng)答的圖；圖37是描繪了根據(jù)本發(fā)明從凍融的PBMC評(píng)價(jià)三名正常的健康志愿者的免疫應(yīng)答的圖；圖38A和38B是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖；圖39A和39B是描繪了正常健康志愿者對(duì)抗EPIMAX測(cè)試中鑒定的肽的免疫應(yīng)答的圖，并證明了EPIMAX可以鑒定功能Flu-MP特異性CD4+T細(xì)胞的抗原決定部位；圖40是描繪根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖，并顯示了特異性CD4+T細(xì)胞的新抗原決定部位的鑒定；圖41A和B是描繪了正常健康志愿者對(duì)抗EPIMAX測(cè)試中鑒定的肽的免疫應(yīng)答的圖；圖42是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答和個(gè)體的抗原決定部位的圖，兩個(gè)肽都含有氨基酸錯(cuò)配并顯示出在器官移植的環(huán)境中鑒定異源抗原特異性T細(xì)胞的能力；圖43是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的1型糖尿病個(gè)體免疫應(yīng)答的圖；圖44A-44B描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答；圖45是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的五名正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答；圖46包括兩張描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T-細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答；圖47是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T-細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答；圖48包括四張描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T-細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答；和圖49包括兩張描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，并證明了由非T-細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答的鑒定。
發(fā)明詳述盡管以下詳細(xì)討論了本發(fā)明各種實(shí)施方案的形成和使用，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明提供了許多在各種特定內(nèi)容中具體化的可應(yīng)用創(chuàng)造性概念。在此討論的特定實(shí)施方案只是以特定方式來(lái)說(shuō)明形成和使用本發(fā)明并不是限制本發(fā)明的范圍。
為了幫助理解本發(fā)明，以下定義了多個(gè)術(shù)語(yǔ)。在此定義的術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意思。如術(shù)語(yǔ)“a”，“an”和“the”不僅僅用來(lái)指單數(shù)實(shí)體，而是包括總的分類(lèi)，其中的一個(gè)特定實(shí)例可用于說(shuō)明。在此的術(shù)語(yǔ)用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是它們的使用沒(méi)有限定本發(fā)明，除了權(quán)利要求中列出的以外。
本發(fā)明包括能夠測(cè)定抗原特異性免疫應(yīng)答的組合物和方法，不考慮所誘導(dǎo)的應(yīng)答類(lèi)型。如在此所用的，術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類(lèi)型”或“免疫應(yīng)答的類(lèi)型”用于描述通過(guò)Th1，Th2，Tc1，Tc2及其組合的免疫細(xì)胞應(yīng)答或其他與遞呈肽或抗原的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)無(wú)關(guān)的基于T細(xì)胞的獲得性免疫的激活或調(diào)節(jié)，借此T細(xì)胞識(shí)別并應(yīng)答MHC范圍內(nèi)的特定肽或抗原，及其對(duì)相同的細(xì)胞、鄰近的細(xì)胞或影響特定T細(xì)胞的細(xì)胞的作用或其對(duì)遞呈肽或抗原的細(xì)胞的作用。有經(jīng)驗(yàn)的免疫學(xué)者將識(shí)別可能重疊的術(shù)語(yǔ)，即，通常所指的蛋白質(zhì)已經(jīng)通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞加工并裝載成肽、抗原或抗原決定部位，其在特定MHC糖蛋白范圍內(nèi)遞呈，即，I類(lèi)或II類(lèi)。
清楚的是在此范圍內(nèi)所用的術(shù)語(yǔ)“肽”，“抗原”或“抗原決定部位”可關(guān)于抗原遞呈細(xì)胞遞呈后T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)的遞呈來(lái)使用。如在此所用的，術(shù)語(yǔ)“肽”用于描述氨基酸鏈。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”，“免疫原”，“抗原決定部位”和“抗原決定簇”可交替使用來(lái)描述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的那些肽。如在此所用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”用于描述免疫應(yīng)答的激活，調(diào)整，無(wú)反應(yīng)性(anergization)或甚至抑制，例如通過(guò)細(xì)胞的增殖，細(xì)胞因子或免疫因子分泌，細(xì)胞間的相互作用，凋亡等所測(cè)量的。例如，T細(xì)胞應(yīng)答可以是“調(diào)節(jié)”的，其中通過(guò)能夠激活特定類(lèi)型應(yīng)答的T細(xì)胞釋放特定細(xì)胞因子或免疫因子，例如，抗體產(chǎn)生；并同時(shí)降低另一種類(lèi)型的應(yīng)答，例如，細(xì)胞毒性T細(xì)胞或NK細(xì)胞的激活。
如在此所用的術(shù)語(yǔ)，“免疫調(diào)節(jié)”用于描述特定抗原，免疫原，抗原決定部位或抗原決定簇對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的作用，效應(yīng)細(xì)胞即在原位或甚至在效應(yīng)級(jí)聯(lián)下游中激活的細(xì)胞。
本發(fā)明者認(rèn)識(shí)到之前已經(jīng)產(chǎn)生了用于預(yù)測(cè)和表征抗原決定部位的許多工具。例如，主要基于MHC肽復(fù)合體的X-射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的肽-主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相互作用的計(jì)算機(jī)模型化通常用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)潛在的抗原決定部位。盡管該方法極大地得益于引入了新的預(yù)測(cè)算法，然而，這取決于結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)的大小，因此在預(yù)測(cè)該數(shù)據(jù)組未表示的MHC復(fù)合體時(shí)就不太有效。該方法提供了鑒定抗原決定部位的方法，但不可以用于表征由那些抗原決定部位引發(fā)的特定應(yīng)答(Flower DR，Novartis Found Symp.2003；254102-20；討論120-5，216-22，250-2)。
從MHC洗脫肽，接著質(zhì)譜測(cè)序已經(jīng)成功用于鑒定抗原決定部位(Hunt DF，Science.1992年3月6日；255(5049)1261-3)。盡管是鑒定的有效方法，但肽洗脫是昂貴的，緩慢的，并需要大的樣品尺寸，使得在臨床環(huán)境中使用是不切實(shí)際的。該方法還提供了鑒定抗原決定部位的方法，但不可以用于表征由那些抗原決定部位引發(fā)的特定應(yīng)答。
重疊肽文庫(kù)已經(jīng)用于鑒定病原體相關(guān)蛋白中的抗原決定部位(Martin R，Methods.2003年3月；29(3)236-47)。肽文庫(kù)篩選使用生物測(cè)試作為反應(yīng)性的讀出并因此可以用于測(cè)定對(duì)抗原決定部位的應(yīng)答的量級(jí)。通過(guò)使用重疊文庫(kù)，可以鑒定所有潛在的I類(lèi)和II類(lèi)抗原決定部位。迄今為止，使用肽文庫(kù)用于評(píng)價(jià)潛在抗原決定部位的生物測(cè)試包括以下方法細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子，ELISA和細(xì)胞增殖(Martin R，Methods.2003年3月；29(3)236-47)。這些測(cè)試的任一個(gè)中對(duì)文庫(kù)內(nèi)給定肽的反應(yīng)是抗原決定部位存在的表示；然而，關(guān)于對(duì)該抗原決定部位的應(yīng)答性質(zhì)，這些方法中沒(méi)有一個(gè)給出清楚的表示，例如，抗原性、過(guò)敏性、致耐受性或任何其他特定的應(yīng)答。
還報(bào)道了用于預(yù)測(cè)和表征抗原決定部位的已知技術(shù)的組合。以下給出了組合測(cè)試的實(shí)例。
肽文庫(kù)和ELISPOT。ELISPOT技術(shù)使用表面結(jié)合的捕獲抗體來(lái)結(jié)合平板上培養(yǎng)的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。將第二個(gè)標(biāo)記的抗體用于定量分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)用重疊肽文庫(kù)孵育細(xì)胞并通過(guò)ELISPOT測(cè)試細(xì)胞因子產(chǎn)生，分離抗原決定部位(Geginat G，JImmunol.2001年2月1日；166(3)1877-84)。然而，該方法是局限的，因?yàn)閷?duì)于任何給定的樣品，只有少數(shù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以得到測(cè)量。這種測(cè)量應(yīng)答抗原決定部位識(shí)別所產(chǎn)生的所有范圍的細(xì)胞因子和趨化因子的無(wú)能使得免疫應(yīng)答(即，1-型，2-型或T-調(diào)節(jié))的任何表征變得極其困難。
肽文庫(kù)和ELISA。ELISA技術(shù)使用表面結(jié)合的捕獲抗體來(lái)結(jié)合細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子。將第二個(gè)標(biāo)記的抗體用來(lái)與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較時(shí)定量分泌的細(xì)胞因子的濃度。通過(guò)用重疊肽文庫(kù)孵育細(xì)胞并通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生，抗原決定抗原部位得到分離。然而，該方法是局限的，因?yàn)閷?duì)于任何給定的樣品，只有少數(shù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生可以得到測(cè)量。這種測(cè)量應(yīng)答抗原決定部位識(shí)別所產(chǎn)生的所有范圍的細(xì)胞因子和趨化因子的無(wú)能使得免疫應(yīng)答(即，1-型，2-型或T-調(diào)節(jié))的任何表征變得極其困難。此外，通過(guò)ELISA測(cè)定單個(gè)細(xì)胞因子需要相當(dāng)大的至少100微升生物流體和/或培養(yǎng)物上清液的體積。
肽文庫(kù)和細(xì)胞增殖測(cè)試。細(xì)胞增殖測(cè)試使用放射性核素結(jié)合或熒光染料稀釋來(lái)監(jiān)控響應(yīng)刺激的細(xì)胞分裂。通過(guò)用重疊的肽文庫(kù)孵育細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞增殖測(cè)試來(lái)測(cè)定細(xì)胞分裂，抗原決定部位得到分離(Mutch D，J Acquir Immune Defic Syndr.1994年9月；7(9)879-90)。然而，該方法是局限的，因?yàn)楸M管細(xì)胞分裂可以表示抗原應(yīng)答規(guī)模，但關(guān)于應(yīng)答的性質(zhì)(即，1-型，2-型或T-調(diào)節(jié))，該測(cè)試沒(méi)有給出信息抑制。還應(yīng)答注意到一些抗原特異性應(yīng)答與快速細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)如T-調(diào)節(jié)應(yīng)答。
肽文庫(kù)和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞測(cè)試(CTL)。細(xì)胞淋巴細(xì)胞測(cè)試監(jiān)控放射性核素或熒光染料從裝載抗原(包括但不限于cDNA，病毒和噬菌體表達(dá)文庫(kù)，完整蛋白，蛋白片段，肽，修飾的肽和脂質(zhì))的靶細(xì)胞的釋放，作為抗原決定部位識(shí)別和細(xì)胞毒性細(xì)胞功能的測(cè)量。通過(guò)用重疊的肽文庫(kù)孵育細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞測(cè)試來(lái)測(cè)定細(xì)胞的細(xì)胞毒性，抗原決定部位得到分離。盡管細(xì)胞的細(xì)胞毒性可以表示1-型抗原應(yīng)答的規(guī)模，但測(cè)定1-型以外的應(yīng)答(即，2-型和T-調(diào)節(jié))時(shí)，該方法的使用是局限的。由于受體從靶細(xì)胞中釋放出來(lái)，使用CTL測(cè)試的抗原特異性細(xì)胞毒性的表征通常受到低敏感性的困擾。還應(yīng)當(dāng)注意到該方法需要大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)大且因此不能認(rèn)為是高通量的。
肽文庫(kù)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞因子染色。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞因子染色技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光染色程序和抗細(xì)胞因子抗體來(lái)測(cè)量響應(yīng)抗原刺激所產(chǎn)生的胞內(nèi)細(xì)胞因子的水平。然后可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)、顯微鏡或分光光度技術(shù)來(lái)完成細(xì)胞因子產(chǎn)生的測(cè)量和產(chǎn)生細(xì)胞因子細(xì)胞的定量。通過(guò)用重疊肽文庫(kù)孵育細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的染色來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子產(chǎn)生，抗原決定部位得到分離(Karlsson AC，J Immunol Methods.2003年12月；283(1-2)141-53)。然而，該方法是局限的，因?yàn)閷?duì)于任何給定的樣品，只有少數(shù)細(xì)胞因子的產(chǎn)生得到測(cè)量。。這種測(cè)量應(yīng)答抗原決定部位識(shí)別所產(chǎn)生的所有范圍的細(xì)胞因子和趨化因子的無(wú)能使得免疫應(yīng)答(即，1-型，2-型或T-調(diào)節(jié))的任何表征變得極其困難。該方法進(jìn)一步受到限制，因?yàn)樾枰罅考?xì)胞用于分析且對(duì)受分析的細(xì)胞是破壞性的。
肽洗脫和質(zhì)譜測(cè)序。從MHC洗脫肽接著質(zhì)譜測(cè)序已經(jīng)成功用于鑒定抗原決定部位(Hunt DF，Science.1992年3月6日；255(5049)1261-3)。盡管對(duì)于鑒定是有效的方法，但肽洗脫是昂貴，緩慢且需要大的體積大小，使其在臨床環(huán)境中使用是不切實(shí)際的。該方法提供了鑒定抗原決定部位的方法，但不能用于表征由那些抗原決定部位引發(fā)的特定應(yīng)答(即，1-型，2-型，T-調(diào)節(jié))。
肽MHC相互作用的計(jì)算機(jī)模型化。主要基于MHC肽復(fù)合體的X-射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的肽-主要組織相容性復(fù)合體(MHC)相互作用的計(jì)算機(jī)模型化通常用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)潛在的抗原決定部位。盡管該方法極大地得益于引入了新的預(yù)測(cè)算法，然而，這取決于結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)的大小，因此在預(yù)測(cè)該數(shù)據(jù)組未表示的MHC復(fù)合體時(shí)就不太有效(Kuhara S.Pac Symp Biocompt.1999；182-9)。該方法提供了鑒定抗原決定部位的方法，但不能用于表征由那些抗原決定部位引發(fā)的特定應(yīng)答。
通過(guò)重組表達(dá)克隆的抗原血清學(xué)鑒定(SEREX)。SEREX技術(shù)涉及通過(guò)組合表達(dá)文庫(kù)篩選鑒定由血清抗體識(shí)別的抗原決定部位。盡管對(duì)于激素免疫應(yīng)答SEREX技術(shù)給出了鑒定，但對(duì)于細(xì)胞免疫應(yīng)答的規(guī)?；蛐再|(zhì)沒(méi)有給出這樣的鑒定(Tureci O，Mol Med Today.1997年8月；3(8)342-9)。該技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并因此在臨床環(huán)境中是不切實(shí)際的。
用于多重細(xì)胞因子分析的實(shí)時(shí)PCR。實(shí)時(shí)PCR可以用于以定量方式測(cè)量編碼多重細(xì)胞因子的RNA的表達(dá)(Giulietti A.，Methods.2001年12月；25(4)386-401)。然而，該技術(shù)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，需要大量細(xì)胞來(lái)分離足夠量的RNA用于分析，且對(duì)于細(xì)胞是破壞性的。最后，RNA的表達(dá)不表示生物活性細(xì)胞因子的分泌。
如上所述，已經(jīng)報(bào)道了能夠預(yù)測(cè)并表征抗原決定部位的技術(shù)，且在一些情況中，為了最大化有用信息的量，已經(jīng)將各種技術(shù)結(jié)合起來(lái)，如基于熒光的增殖測(cè)試和胞內(nèi)細(xì)胞因子測(cè)試。這些結(jié)合的測(cè)試通常受到其單個(gè)組成測(cè)試的限制，如與上述的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞因子染色相關(guān)的局限性。
存在對(duì)高通量多參數(shù)技術(shù)的迫切且迄今為止未完成的需要，該技術(shù)易于自動(dòng)化，非破壞性的并需要小的樣品大小，使其可應(yīng)用于臨床診斷環(huán)境，使得可以測(cè)定人體內(nèi)的免疫應(yīng)答?？紤]到其中需要提供免疫應(yīng)答的圖像和/或鑒定病原體性質(zhì)的快速測(cè)試的新興和再次新興的病原體以及生物威脅劑，這種需求特別重要。上述的方法中沒(méi)有一個(gè)提供對(duì)抗原決定部位的定性和定量免疫應(yīng)答的清楚表征。除計(jì)算機(jī)模型化以外，這些方法沒(méi)有提供高通量，限制了它們?cè)谠\斷或免疫監(jiān)控立場(chǎng)的實(shí)用性。
本發(fā)明提供了免疫調(diào)節(jié)肽及其衍生物的鑒定，因此允許評(píng)價(jià)健康和患病個(gè)體中誘導(dǎo)的具有診斷、預(yù)后和治療含義的免疫應(yīng)答類(lèi)型。該方法還給出了應(yīng)答的性質(zhì)和規(guī)模的測(cè)量，而同時(shí)鑒定了對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答的抗原決定部位。
一發(fā)明中，本發(fā)明是測(cè)定抗原特異性免疫應(yīng)答的方法，與誘導(dǎo)的應(yīng)答類(lèi)型無(wú)關(guān)，因此允許評(píng)價(jià)健康和患病個(gè)體中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類(lèi)型。該方法同時(shí)給出了免疫應(yīng)答的定性和定量測(cè)量，而同時(shí)鑒定了對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答的抗原決定部位。
本發(fā)明的方法是三種方法的結(jié)合，人或動(dòng)物的免疫細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)，非MHC限制的抗原物質(zhì)的遞呈，并分析細(xì)胞因子和/或趨化因子的存在，其提供了觀察所有類(lèi)型免疫應(yīng)答的能力。一實(shí)施方案中，三種技術(shù)包括人或動(dòng)物的免疫細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)，非MHC限制的重疊肽文庫(kù)，和細(xì)胞因子和/或趨化因子存在的多重分析。優(yōu)選，本發(fā)明是測(cè)定抗原特異性免疫應(yīng)答的多階段方法，其中第一個(gè)階段是高通量篩選(階段I)，和第二個(gè)階段提供特定抗原決定部位的鑒定(階段II)。
本發(fā)明的方法使用細(xì)胞培養(yǎng)物分析，使用呈現(xiàn)能夠不同抗原加工，遞呈和識(shí)別肽和非肽抗原決定部位(例如，糖脂)的多種細(xì)胞類(lèi)型。用于本發(fā)明方法的合適細(xì)胞包括但不限于T細(xì)胞，B細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和紅血球。包括T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞和NK-T細(xì)胞的分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)提供了用于本發(fā)明的多種細(xì)胞類(lèi)型的易獲得來(lái)源。此外，用于培養(yǎng)還支持細(xì)胞因子產(chǎn)生的人或動(dòng)物細(xì)胞的任何本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)化程序適用于本發(fā)明中。
本發(fā)明的方法中，任何抗原物質(zhì)可以用于引發(fā)免疫應(yīng)答。適用于本發(fā)明的抗原物質(zhì)的來(lái)源包括抗原，肽，蛋白質(zhì)，微生物，細(xì)胞，組織，腫瘤或其組合物。合適的抗原物質(zhì)包括但不限于包括肽，糖肽，磷肽，脂質(zhì)，糖脂和磷脂的組合物。
一實(shí)施方案中，在本發(fā)明中使用重疊肽文庫(kù)來(lái)鑒定目標(biāo)蛋白上的抗原決定部位并用來(lái)刺激免疫應(yīng)答。該技術(shù)提供了鑒定給定抗原的所有可能的I類(lèi)和II類(lèi)抗原決定部位并適于CD4和CD8 T-細(xì)胞應(yīng)答。且抗原決定部位的鑒定不受HLA-單套形的限制。
將目標(biāo)蛋白的氨基酸序列分成小的重疊肽，例如，一系列具有3至4個(gè)氨基酸偏移(offset)的8-至15-mer重疊肽。根據(jù)本發(fā)明，可以制得或從商業(yè)可獲得來(lái)源購(gòu)買(mǎi)重疊肽文庫(kù)。例如，從含有296個(gè)氨基酸的流感基質(zhì)蛋白質(zhì)，可以制得60個(gè)重疊15-mer肽(具有4個(gè)氨基酸偏移)的重疊肽文庫(kù)。
從重疊肽文庫(kù)，用一種或多種粘附培養(yǎng)容器的肽來(lái)準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)容器。在一個(gè)多階段方法中，將多孔的階段-I培養(yǎng)平板用于篩選目的，其中每個(gè)孔含有幾個(gè)重疊肽的簇。篩選需要的每簇重疊肽的數(shù)量和簇的數(shù)量取決于蛋白質(zhì)自身的大小。優(yōu)選，每個(gè)簇含有約5-10個(gè)重疊肽；對(duì)于較小的蛋白質(zhì)，約3-7個(gè)重疊肽。在一個(gè)多階段實(shí)施方法中，將目標(biāo)蛋白的重疊肽文庫(kù)通過(guò)簇分配至編號(hào)的預(yù)先處理的96孔階段I培養(yǎng)平板中，每孔每簇5-10個(gè)肽。對(duì)于階段II，以每個(gè)孔單個(gè)肽來(lái)分配反應(yīng)性簇內(nèi)的重疊肽。為了最大化通量和最小化測(cè)試與測(cè)試之間的變化，預(yù)先制備階段I的培養(yǎng)平板。預(yù)先制備并存儲(chǔ)于-80℃的平板具有最少一年的貨架期。且一定程度上發(fā)現(xiàn)特異性階段I簇是重復(fù)抗原性的，也可以預(yù)先制備階段-II的培養(yǎng)平板。
為了開(kāi)始本發(fā)明的免疫應(yīng)答測(cè)試，將目標(biāo)免疫細(xì)胞加入上述的培養(yǎng)容器中并在支持響應(yīng)粘附于培養(yǎng)容器的抗原肽的細(xì)胞因子產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間。使用該方法可以測(cè)定的免疫細(xì)胞包括但不限于PBMC，淋巴細(xì)胞，T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，NK細(xì)胞，NKT細(xì)胞，TCR T細(xì)胞，B細(xì)胞，單核細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞和粒細(xì)胞。在一種方法中，使用外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在多階段方法中，例如，將PBMC以2×105每孔接種于一個(gè)或多個(gè)上述含有目標(biāo)抗原重疊肽文庫(kù)的編號(hào)的預(yù)先處理的96孔階段-I培養(yǎng)平板中，每孔每簇5-10個(gè)肽。然后在支持細(xì)胞因子產(chǎn)生的條件下孵育免疫細(xì)胞，使用對(duì)于特定細(xì)胞類(lèi)型選定的培養(yǎng)基、溫度和孵育條件。例如，如實(shí)施例1中所述的，優(yōu)選將PBMC在完全培養(yǎng)基中37℃孵育18-48小時(shí)。孵育后，將細(xì)胞沉淀并從每個(gè)孔中分離出上清液并分析多種細(xì)胞因子和趨化因子的存在。對(duì)于在此所述的本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”用來(lái)表示細(xì)胞因子和趨化因子兩者。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于相同樣品中幾種細(xì)胞因子的存在，優(yōu)選20或更多種細(xì)胞因子，本領(lǐng)域中已知的能夠同時(shí)分析上清液的任何方法可用于本發(fā)明中。這樣的方法包括質(zhì)譜，基于抗體的矩陣，和多元分析珠子技術(shù)。使用細(xì)胞因子多元分析，因?yàn)閕)可以同時(shí)測(cè)量多個(gè)免疫參數(shù)，ii)需要小體積的樣品，iii)提供不破壞樣品的靈敏測(cè)試；iv)支持專(zhuān)門(mén)化免疫應(yīng)答的特征性特定細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)表達(dá)，和v)提供免疫效應(yīng)的直接測(cè)量。合適的可購(gòu)得的細(xì)胞因子多元分析儀是Luminex100細(xì)胞因子多元工作臺(tái)(Luminex Corp.，Austin，Texas)，其能夠同時(shí)測(cè)量高達(dá)100個(gè)分析物，需要小體積的樣品，并快速檢測(cè)每微升1-32,000微微克動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的細(xì)胞因子的存在。細(xì)胞因子多元矩陣技術(shù)(Luminex)允許同時(shí)定量小體積中的多種細(xì)胞因子和趨化因子(Earley MC，Cytometry，2002年10月15日；50(5)239-42)。該測(cè)試本質(zhì)上是高通量的，并可以應(yīng)用于多種生物樣品的分析。通過(guò)分析響應(yīng)刺激或病原損害的協(xié)調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，可以描述對(duì)應(yīng)于特異性免疫應(yīng)答的所述特異性生物性質(zhì)。
在一種方法中，將50微升上清液以96孔形式轉(zhuǎn)移至Luminex100細(xì)胞因子多元工作臺(tái)中(Luminex Corp.，Austin，Texas)并根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)分析?？焖俸Y選重復(fù)兩份的上清液中多種細(xì)胞因子的存在，使用預(yù)先制備并使之有效的珠子和試劑的總混合物。
在多階段的方法中，將通過(guò)階段-I細(xì)胞因子分析證明反應(yīng)陽(yáng)性的抗原簇分解成它們構(gòu)成的肽組成部分，用于如上所述的抗原決定部位聚焦階段-II培養(yǎng)平板上的抗原肽的鑒定。在一種方法中，階段-II培養(yǎng)平板包括編號(hào)的預(yù)先處理的孔-條帶，孔-條帶含有每個(gè)簇的各個(gè)成分肽，重復(fù)兩份。將目標(biāo)免疫細(xì)胞加入孔-條帶中并在支持響應(yīng)粘附孔-條帶的抗原肽的細(xì)胞因子產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間。例如，將融化的PBMC以2×105細(xì)胞每孔加入孔-條帶中并在37℃培養(yǎng)18-48小時(shí)。培養(yǎng)后將細(xì)胞沉淀，分離上清液并分析細(xì)胞因子產(chǎn)生。在一種方法中，將50微升上清液轉(zhuǎn)移至Luminex工作臺(tái)中用于分析。對(duì)于給定肽條帶的階段-II中的多元篩選包括響應(yīng)階段-I分析過(guò)程中的親本簇所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。階段II篩選中鑒定的肽表示由該個(gè)體識(shí)別的抗原決定部位。響應(yīng)鑒定的肽而產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子的特征模式是該抗原決定部位引發(fā)的特定應(yīng)答類(lèi)型的表示。
本發(fā)明的方法是高通量的方法，用于快速鑒定和表征肽特異性的T-細(xì)胞抗原決定部位。如在此所示的，測(cè)試的產(chǎn)生和證實(shí)已經(jīng)引起選定組細(xì)胞因子和趨化因子的鑒定，其允許鑒定-1型，2-型和T-細(xì)胞調(diào)節(jié)表型。
本發(fā)明的這種方法具有優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括a)高靈敏度對(duì)于所有測(cè)試的細(xì)胞因子，在每微升微微克檢測(cè)；b)高通量可以在48小時(shí)內(nèi)完成測(cè)試；c)小體積生物流體中多種分析物的分析，例如測(cè)定50微升體積中至少30種細(xì)胞因子和趨化因子；d)非破壞性允許增加基于細(xì)胞的測(cè)試用于多個(gè)參數(shù)的分析；和e)以HLA單套形無(wú)關(guān)的方式來(lái)鑒定抗原決定部位。本發(fā)明的方法使用細(xì)胞因子多元化來(lái)監(jiān)控多個(gè)免疫參數(shù)并因此能夠表征免疫應(yīng)答的性質(zhì)，包括但不限于抗原性、過(guò)敏性和致耐受性應(yīng)答。通過(guò)監(jiān)控多種細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)應(yīng)答，抗原決定部位的鑒定和表征也比本領(lǐng)域技術(shù)的現(xiàn)有狀態(tài)更靈敏?，F(xiàn)有本領(lǐng)域技術(shù)中沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)或結(jié)合能夠提供細(xì)胞因子的多參數(shù)測(cè)定，而本發(fā)明方法的抗原決定部位的鑒定和表征可以提供。此外，本發(fā)明的方法包括高通量技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。還應(yīng)當(dāng)注意到相對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)的現(xiàn)有狀態(tài)，本發(fā)明的方法對(duì)測(cè)試的細(xì)胞不是破壞性的；因此其可以結(jié)合許多標(biāo)準(zhǔn)或定制免疫測(cè)試，包括但不限于增殖，胞內(nèi)細(xì)胞因子和表面受體染色，CTL活性和ELISPOT。最后，本發(fā)明的方法需要比任何其他目前可用技術(shù)更小體積的生物流體和/或培養(yǎng)物上清液和更少數(shù)量的細(xì)胞用于測(cè)試。因此，本發(fā)明的方法是高通量的，低體積的，非破壞性的技術(shù)，易于自動(dòng)化，并因此對(duì)于診斷、預(yù)后和治療用途是實(shí)用的。
一方面中，本發(fā)明是允許鑒定免疫調(diào)節(jié)肽及其衍生物的方法，具有診斷、預(yù)后和治療應(yīng)用。(a)診斷該技術(shù)可以用于測(cè)定個(gè)體先前存在的免疫狀態(tài)。通過(guò)鑒定和表征多種抗原的抗原決定部位，可以測(cè)定個(gè)體完整T-細(xì)胞組成部分的完整圖。該技術(shù)是高通量的，易于自動(dòng)化，非破壞性的和需要小的樣品大小，使其可應(yīng)用于臨床診斷環(huán)境中。因此，可以用作多種自體反應(yīng)性疾病和超免疫應(yīng)答診斷中的工具，包括但不限于過(guò)敏癥、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、狼瘡和多發(fā)性硬化。(b)預(yù)后通過(guò)該技術(shù)測(cè)定治療前個(gè)體的抗原決定部位特異性免疫狀態(tài)可以作為治療結(jié)果的預(yù)后指示。因此，可以調(diào)整治療干預(yù)的過(guò)程來(lái)提高或消除這種免疫狀態(tài)。該技術(shù)可以用于抗腫瘤免疫治療、氣管移植、過(guò)敏癥和自身免疫性疾病治療的預(yù)后測(cè)定。(c)治療本發(fā)明的方法可以用作治療過(guò)程中的免疫調(diào)控工具。治療過(guò)程中的抗原決定部位特異性免疫應(yīng)答的特異性、規(guī)模和性質(zhì)的完整圖可以用來(lái)測(cè)定正在進(jìn)行的治療的效用?；谠摲椒ǖ臄?shù)據(jù)，可以調(diào)整治療來(lái)提高、調(diào)節(jié)或抑制特定的免疫應(yīng)答。因此，該技術(shù)可以用于指導(dǎo)疫苗研發(fā)、抗腫瘤免疫治療、器官移植、過(guò)敏癥和自身免疫性疾病領(lǐng)域中正在進(jìn)行的治療。
另一方面中，本發(fā)明可用于設(shè)計(jì)新的藥物，包括但不限于疫苗、生物活性肽和靶向試劑。(a)疫苗本發(fā)明的方法極大地有助于有效疫苗的研發(fā)。使用該技術(shù)鑒定的抗原決定部位本身可以作為有效的疫苗來(lái)提高對(duì)抗傳染病或癌癥的免疫應(yīng)答，或使對(duì)抗用于自身免疫性疾病、過(guò)敏癥或器官移植治療的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答變成無(wú)反應(yīng)性(tolerize)。(b)生物活性肽已經(jīng)描述了通過(guò)較大蛋白質(zhì)的蛋白水解產(chǎn)生的生物活性肽具有意義深遠(yuǎn)的神經(jīng)調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)功能。使用該技術(shù)，可以快速鑒定具有這些特定的蛋白質(zhì)。(c)靶向試劑使用該技術(shù)鑒定的與細(xì)胞上特定受體相互作用的生物活性肽可以用作靶向試劑，將藥物傳送至特定的細(xì)胞群。
本發(fā)明的方法適用于數(shù)種醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，包括但不限于慢性感染、過(guò)敏癥、腫瘤疾病、自身免疫性疾病、阿爾海默氏病、急性傳染病、器官移植和動(dòng)脈血管粥樣硬化。可以理解這些應(yīng)用意味著是代表性的，且本領(lǐng)域已知的其他應(yīng)用作為本發(fā)明的一部分來(lái)考慮。
慢性感染。驚人數(shù)量和種類(lèi)的人類(lèi)疾病是由慢性致病感染而引起的。盡管這些疾病的進(jìn)程不同，它們?nèi)靠梢酝ㄟ^(guò)無(wú)力引發(fā)并有效應(yīng)答病原體來(lái)表征，不管是1-型或2-型。一旦應(yīng)答得到引發(fā)，蛋白質(zhì)相關(guān)病原體中的自我抗原決定部位擬態(tài)也可以誘導(dǎo)自體免疫應(yīng)答，其在清除感染后還能持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，如Lyme關(guān)節(jié)炎和Herpes相關(guān)的脫髓鞘疾病。病原體免疫識(shí)別后的自體免疫反應(yīng)的出現(xiàn)使得可以選擇對(duì)安全而有效的治療關(guān)鍵的特異性抗原決定部位。研究已經(jīng)涉及一些慢性感染中調(diào)節(jié)應(yīng)答的不適當(dāng)激活。本發(fā)明的方法適用于關(guān)于慢性感染的診斷、預(yù)后和治療應(yīng)用。(a)診斷用于一些慢性感染劑的非入侵診斷測(cè)試，如用于HBV的基于PCR的測(cè)試，證明在臨床環(huán)境中非常有效。通過(guò)對(duì)病原體相關(guān)肽的特異性應(yīng)答的快速檢測(cè)和表征，本發(fā)明的方法可應(yīng)用于慢性感染的診斷。通過(guò)使用該技術(shù)也有助于病原體相關(guān)自體免疫并發(fā)癥的診斷。(b)預(yù)后本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)和表征對(duì)特定病原體相關(guān)抗原決定部位的反應(yīng)，1-型，2-型或T-調(diào)節(jié)，隨后其可作為疾病結(jié)果的預(yù)后指示，因此指導(dǎo)抗生素治療。本發(fā)明的方法適用于檢測(cè)和表征對(duì)特定病原體相關(guān)抗原決定部位的反應(yīng)，其對(duì)于感染相關(guān)的自身免疫性疾病的發(fā)作，也可以作為預(yù)后指示。(c)治療通過(guò)本發(fā)明的病原體相關(guān)蛋白的抗原決定部位的鑒定和表征可以有助于安全有效的預(yù)防和治療疫苗的研發(fā)。這些包括實(shí)現(xiàn)避免自我抗原決定部位擬態(tài)的疫苗。疫苗還將包括全部變體抗原決定部位的鑒定，靶向病原體蛋白組內(nèi)的不變抗原決定部位，因此提供對(duì)抗相同病原體的多個(gè)菌株以及每種病原體的常見(jiàn)突變體的保護(hù)，如在HIV和瘧疾的情況中。通過(guò)這種技術(shù)的應(yīng)用鑒定和消除T-調(diào)節(jié)抗原決定部位和響應(yīng)細(xì)胞在啟動(dòng)保護(hù)性抗病原體應(yīng)答中起作用。
過(guò)敏癥。過(guò)敏癥是對(duì)通常無(wú)害物質(zhì)的超免疫應(yīng)答。已經(jīng)報(bào)到不恰當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)變成2-型應(yīng)答在引發(fā)過(guò)敏性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。已經(jīng)鑒定出許多過(guò)敏原，包括吸入過(guò)敏原，如屋塵螨蟲(chóng)，花粉和霉菌；食品過(guò)敏原如蛋，小麥，大豆和堅(jiān)果；或一些藥物如青霉素?？梢詫?dǎo)致嚴(yán)重的通常為致命的反應(yīng)，稱(chēng)為過(guò)敏性反應(yīng)。因此過(guò)敏癥范圍內(nèi)的T-調(diào)節(jié)應(yīng)答的激活是有利的。(a)診斷皮膚測(cè)試和血液測(cè)試，如過(guò)敏原特異性IgE水平，通常用于鑒定過(guò)敏原。然而，皮膚測(cè)試對(duì)于一些經(jīng)受過(guò)敏性反應(yīng)的個(gè)體是危險(xiǎn)的。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用作為鑒定個(gè)體特異性抗原決定部位的安全診斷工具。(b)預(yù)后本發(fā)明的方法允許鑒定個(gè)體過(guò)敏癥個(gè)體的過(guò)敏原抗原決定部位。這對(duì)于監(jiān)控治療過(guò)程中的免疫應(yīng)答或?qū)τ诤罄m(xù)是有用的。還可以在治療后鑒定致耐受性T-調(diào)節(jié)刺激抗原決定部位并可以作為成功治療的預(yù)后指示。(c)治療抗原決定部位的鑒定可以形成基于肽的新疫苗，其可以用于將免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換成T-調(diào)節(jié)或選擇性地消除或抑制不恰當(dāng)?shù)?-型細(xì)胞。
腫瘤疾病。將腫瘤疾病定義為從正常組織突變的異常細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)。這些包括癌癥，實(shí)體腫瘤和淋巴/造血系統(tǒng)的惡化，將所有這些總稱(chēng)為腫瘤。已經(jīng)報(bào)道腫瘤環(huán)境通過(guò)幾種不同的機(jī)理誘導(dǎo)對(duì)抗腫瘤抗原的免疫耐受性。盡管對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的1-型T細(xì)胞的產(chǎn)生涉及腫瘤生長(zhǎng)的壓抑或抑制，對(duì)耐受性轉(zhuǎn)變的免疫應(yīng)答抑制癌癥特異性1-型T細(xì)胞的產(chǎn)生。然而，在一些癌癥中，腫瘤抗原特異性1-型T應(yīng)答通過(guò)過(guò)敏性擬態(tài)誘導(dǎo)自身免疫性疾病。例如，已經(jīng)報(bào)道CDR2(乳房和卵巢腫瘤抗原)特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，誘導(dǎo)一些個(gè)體中的腫瘤性側(cè)小腦惡化(PCD)。
抗腫瘤免疫性過(guò)程中自體反應(yīng)的出現(xiàn)使得可以選擇對(duì)安全有效治療關(guān)鍵的特異性抗原決定部位。(a)診斷通過(guò)使用本發(fā)明的方法有助于腫瘤相關(guān)自體免疫并發(fā)癥的診斷。(b)預(yù)后使用該技術(shù)對(duì)特異性腫瘤相關(guān)抗原決定部位反應(yīng)(1-型，2-型或T-調(diào)節(jié))的檢測(cè)和表征，可以作為疾病結(jié)果的預(yù)后指示。通過(guò)比較接種疫苗前和接種疫苗后之間的腫瘤特異性免疫應(yīng)答的性質(zhì)和規(guī)模，本發(fā)明的方法允許評(píng)價(jià)任何種類(lèi)的疫苗治療。對(duì)于腫瘤相關(guān)自身免疫性疾病的發(fā)作，使用該技術(shù)對(duì)特定腫瘤相關(guān)抗原決定部位反應(yīng)的檢測(cè)和表征可以作為預(yù)后指示。(c)治療通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)腫瘤相關(guān)蛋白的抗原決定部位的鑒定和表征有助于安全有效治療疫苗的研發(fā)。這將包括實(shí)現(xiàn)避免自我抗原決定部位擬態(tài)的疫苗。
自體疾病。將自體疾病定義為由對(duì)抗身體自身組織的免疫應(yīng)答引起的失調(diào)。認(rèn)為自我抗原遞呈范圍中遠(yuǎn)離T-調(diào)節(jié)功能的不恰當(dāng)轉(zhuǎn)變是自身免疫性疾病的發(fā)作和進(jìn)展中的關(guān)鍵因素。所得到疾病的特定性質(zhì)取決于顯性應(yīng)答。例如，在1-型糖尿病的情況中，已經(jīng)分離了個(gè)體體內(nèi)識(shí)別胰島的1-型細(xì)胞(Arif S，J Clin Invest.2004 113451)。此外，在多發(fā)性硬化個(gè)體中，存在表明髓磷脂堿性蛋白(MBP)-反應(yīng)性1-型極化T-細(xì)胞經(jīng)受體內(nèi)激活和無(wú)性繁殖擴(kuò)大的證據(jù)，已經(jīng)報(bào)道其在發(fā)病機(jī)制中起主要作用。(a)診斷本發(fā)明的方法允許鑒定引起給定類(lèi)型的自體反應(yīng)性免疫細(xì)胞擴(kuò)大的顯性自我抗原決定部位。(b)預(yù)后本發(fā)明的方法允許鑒定個(gè)體自體免疫個(gè)體的自我抗原決定部位。這對(duì)于監(jiān)控治療過(guò)程中的免疫應(yīng)答或用于繼續(xù)是有用的。還可以在治療后鑒定致耐受性T-調(diào)節(jié)刺激抗原決定部位并作為成功治療的預(yù)后指示。(c)治療抗原決定部位的鑒定可以形成基于肽的新疫苗，其可以將免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變成T-調(diào)節(jié)或選擇性地消除或抑制不當(dāng)1-型或2-型細(xì)胞。
阿爾海默氏病。阿爾海默氏病(AD)是緩慢進(jìn)展形式的癡呆，其是智力功能功能漸進(jìn)性或獲得性的削弱。AD的特征在于大腦區(qū)域中42-殘基淀粉狀蛋白(Abeta)的漸進(jìn)性沉積。報(bào)道表明與年齡相當(dāng)?shù)某扇讼啾容^時(shí)，相當(dāng)高比例的健康老年對(duì)象和AD個(gè)體具有強(qiáng)烈的1-型和2-型特征的Abeta-反應(yīng)性T-細(xì)胞應(yīng)答。(a)診斷許多情況中，阿爾海默氏病和老年癡呆之間的不同診斷只有在mortem后才能得到確鑿的確定。本發(fā)明的方法可用于鑒定Abeta反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答，因此其可以作為AD的診斷指示。(b)預(yù)后通過(guò)本發(fā)明方法的特定免疫應(yīng)答的鑒定可以允許預(yù)測(cè)疾病的臨床過(guò)程。
急性感染。對(duì)抗病原體的1-型應(yīng)答的誘導(dǎo)對(duì)于從胞內(nèi)微生物如細(xì)菌和病毒的恢復(fù)是關(guān)鍵的。相反，胞外病原體如蠕蟲(chóng)誘導(dǎo)2-型細(xì)胞的產(chǎn)生，其細(xì)胞因子指引IgE和嗜曙紅細(xì)胞介導(dǎo)的病原體破壞。一些病毒，如埃博拉病毒或登革熱病毒，導(dǎo)致具有高死亡率的嚴(yán)重疾病，對(duì)于這兩種病毒還沒(méi)有建立得到許可的疫苗。在小鼠模型中，已經(jīng)證明使用源自埃博拉病毒糖蛋白(GP)和基質(zhì)蛋白(VP40)的病毒樣顆粒(VLP)的疫苗激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，并保護(hù)不受病毒激發(fā)的影響。(a)診斷本發(fā)明的方法適用于鑒定診斷新興和再次新興病原體和生物威脅劑存在的新抗原決定部位。(b)治療本發(fā)明的方法通過(guò)篩選從這些疾病恢復(fù)的個(gè)體可以鑒定病毒抗原的T細(xì)胞抗原決定部位。因此，可以制得對(duì)抗急性致命感染的基于肽的新疫苗。
器官移植。器官移植的排異通常是由對(duì)抗移植器官或在移植對(duì)宿主疾病的情況中(GVHD)對(duì)抗接收者的顯性1-型應(yīng)答引起的超免疫應(yīng)答。調(diào)節(jié)功能在產(chǎn)生耐受性和長(zhǎng)期移植接受中起關(guān)鍵作用。因此器官移植范圍內(nèi)的T-調(diào)節(jié)激活或顯性1-型應(yīng)答的選擇性消除是有利的。(a)診斷本發(fā)明的方法適用于測(cè)定免疫反應(yīng)的模式，其可以是急性GVHD和最特別是慢性GVHD產(chǎn)生的預(yù)示。(b)預(yù)后在移植之前或出現(xiàn)之后，捐獻(xiàn)者或接收者樣品中存在的顯性1-型抗原決定部位可以是移植排斥的預(yù)后指示，本發(fā)明適用于測(cè)定顯性1-型抗原決定部位的存在。還可以在治療后通過(guò)本發(fā)明鑒定致耐受性T-調(diào)節(jié)刺激抗原決定部位并可以作為移植耐受性的預(yù)后指示。(c)治療通過(guò)本發(fā)明鑒定的抗原決定部位可以形成基于肽的新疫苗，其可以將免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換成T-調(diào)節(jié)，或選擇性地消除或抑制不當(dāng)1-型細(xì)胞。
動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化是常見(jiàn)的動(dòng)脈疾病。脂肪、膽固醇和其他物質(zhì)累積在動(dòng)脈壁中并形成“粉瘤”或斑點(diǎn)。通常認(rèn)識(shí)到慢性炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答涉及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。報(bào)道了動(dòng)脈粥樣硬化斑中的T-細(xì)胞激活是由斑產(chǎn)生的抗原如氧化的LDL(oxLDL)啟動(dòng)的。其他報(bào)道了人頸動(dòng)脈粥樣硬化斑中的衣原體肺炎-反應(yīng)性T細(xì)胞的檢測(cè)。(a)診斷本發(fā)明的方法適用于免疫反應(yīng)性早期模式的鑒定。(b)預(yù)后本發(fā)明的方法允許定量測(cè)量涉及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的抗原如oxLDL或交叉反應(yīng)性衣原體抗原的抗原決定部位，其由T細(xì)胞識(shí)別。(c)治療本發(fā)明的方法適用于測(cè)定特異性的抗原決定部位，其可以用于產(chǎn)生基于肽的新疫苗來(lái)防止動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。
可以理解以下給出的實(shí)施例是本發(fā)明的表示并且是本發(fā)明的說(shuō)明，但并不解釋為以任何方式來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的方法特征中可以形成改變而沒(méi)有脫離本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是也可以使用可替換的方法而沒(méi)有脫離本發(fā)明的范圍。特別地，實(shí)施例中呈現(xiàn)的測(cè)量細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法只是代表性的且本領(lǐng)域中用于測(cè)量細(xì)胞因子濃度的任何已知方法可用于本發(fā)明中。
實(shí)施例1早在48小時(shí)時(shí)通過(guò)用病毒肽簡(jiǎn)單孵育正常捐獻(xiàn)者的PBMC細(xì)胞來(lái)檢測(cè)抗原特異性免疫應(yīng)答。為了檢測(cè)通過(guò)本發(fā)明的方法使用PBMC和單種肽是否可以檢測(cè)抗原特異性免疫應(yīng)答，用HLA-A0201限制肽孵育HLA-A0201+正常志愿者的新鮮制備PBMC。通過(guò)其他方法已知捐獻(xiàn)者具有Flu-MP-特異性CD8+T細(xì)胞但沒(méi)有Mage 3-特異性CD8+細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。
通過(guò)Ficoll-Paque密度梯度離心從HLA-A0201+健康志愿者新鮮吸出的血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將PBMC以1×106細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于補(bǔ)充10％熱滅活的人AB血清(Gemini Bio-Products)、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(200UI/ml)、鏈霉素(200μg/ml)、丙酮酸鈉(1mM)、1％非必需氨基酸、2-β-巰基乙醇(50μM，Sigma)和HEPES pH7.4(25mM，Gibco)的RPMI培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基CM)中。將2×105細(xì)胞/孔重復(fù)三份接種于圓底96孔平板中，并用1μl HLA-A0201限制肽(儲(chǔ)備濃度1mg/ml，培養(yǎng)濃度10μg/ml)；Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV，MuitiPeptide System，San Diego，CA)，或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)孵育。在48小時(shí)后收集培養(yǎng)物上清液，并用Luminex來(lái)測(cè)量細(xì)胞因子和趨化因子。
用F1u-MP刺激的PBMC在48小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)了大量的細(xì)胞因子，包括IFN-γ(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果證明正常捐獻(xiàn)者的新鮮PBMC響應(yīng)Flu-MP肽并產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子且早在48小時(shí)時(shí)可以通過(guò)用肽簡(jiǎn)單孵育PBMC來(lái)檢測(cè)抗原特異性免疫響應(yīng)。
實(shí)施例2為了PBMC中肽反應(yīng)性細(xì)胞寬泛的所有組成部分，早在48小時(shí)時(shí)檢測(cè)抗原特異性免疫應(yīng)答，包括腫瘤抗原。病毒性抗原通常能夠誘導(dǎo)比腫瘤抗原更強(qiáng)烈的恢復(fù)應(yīng)答。為了測(cè)定通過(guò)本發(fā)明的方法是否可以檢測(cè)腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答，用冷的PBS融化液氮中低溫保存的來(lái)自2名接受至少8次DC疫苗(自體CD34+造血前體細(xì)胞產(chǎn)生的DC，裝載4個(gè)黑素瘤相關(guān)抗原的HLA-A2肽)注射的黑素瘤患者的PBMC。用PBS第二次洗滌后，將PBMC在CM中37℃孵育15分鐘，并用尼龍細(xì)胞濾器除去細(xì)胞碎片。用CM將細(xì)胞再次洗滌，并以1×106/ml重懸浮于CM中。然后，以2×105細(xì)胞/孔重復(fù)三份接種于圓底96-孔平板中，并用各自1μl的HLA-A0201限制肽(儲(chǔ)備濃度1mg/ml，培養(yǎng)濃度10μg/ml)；Flu-MP 58-66；CMV PP65(NLVPMVATV，Biosynthesis，Lewisville，TX)，MAGE-3 271-279，MART-1 27-35(AAGIGILTV)，gp100g209-2M(IMDQVPFSV)，酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV，NCI)，或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)來(lái)孵育。48小時(shí)后收集培養(yǎng)物上清液，并用Luminex技術(shù)測(cè)量所產(chǎn)生的細(xì)胞因子。此外，根據(jù)制造商(Mabtech)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行ELISPOT測(cè)試來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生抗原特異性IFN-γ的T細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，在10μg/ml肽的存在或不存在下，將PBMC(2×105細(xì)胞/孔)加入預(yù)先覆蓋10μg/ml主要抗-IFN-γ單克隆抗體(Mabtech，Stockholm，Sweden)的平板中。
患者1，通過(guò)直接IFN-γELISPOT已知對(duì)于Flu-MP和CMV具有CD8+T細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)，證明了響應(yīng)Flu-MP或CMV肽的IL-1α，IFN-γ，TNF-α和IP-10的誘導(dǎo)，但是不具有4個(gè)黑素瘤肽(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明黑素瘤肽沒(méi)有非特異性地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。患者2，證明其具有MART-1特異性CD8+T細(xì)胞以及Flu-MP或CMV(數(shù)據(jù)未顯示)，呈現(xiàn)了響應(yīng)MART-1肽的IL-1α輕微提高和IP-10顯著提高，但不具有其他黑素瘤肽(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果表明正常捐獻(xiàn)者的新鮮PBMC響應(yīng)Flu-MP肽并產(chǎn)生IL-1α和IP-10。兩個(gè)不同的正常捐獻(xiàn)者之間的細(xì)胞因子/趨化因子產(chǎn)生特征是不同的，表明使用EPIMAX測(cè)試可以鑒定識(shí)別相同F(xiàn)lu-MP肽的不同類(lèi)型的CD8+T細(xì)胞?；陧憫?yīng)IFN可以上調(diào)IP-10的事實(shí)，DC-T相互作用可以誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，其導(dǎo)致從DC產(chǎn)生IP-10。因此，IP-10對(duì)于1-型T細(xì)胞應(yīng)答是有用的標(biāo)記物。
實(shí)施例3響應(yīng)接種裝載肽的CD34-DC的黑素瘤患者中的Mart-1肽的IP-10誘導(dǎo)依賴(lài)于IFN-γ。為了檢測(cè)IP-10產(chǎn)生是否依賴(lài)于IFN-γ，在阻斷抗-IFN-γR1 mAb存在下用MART-1肽#6(10μM)或Flu-MP HLA-A2肽(10μg/ml)刺激從黑素瘤患者獲得的PBMC，該個(gè)體接種自體裝載HLA-A2黑素瘤肽的CD34-DC。通過(guò)IFN-γR1的阻斷完全消除了IP-10產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，IP-10產(chǎn)生依賴(lài)于IFN-γ產(chǎn)生，表明IP-10是IFN-γ產(chǎn)生的替代標(biāo)記物。
將融化的液氮中低溫保存的來(lái)自2名接受至少8次DC疫苗(自體CD34+造血前體細(xì)胞產(chǎn)生的DC，裝載四個(gè)(4)黑素瘤相關(guān)抗原的HLA-A2肽)注射的黑素瘤患者的PBMC重復(fù)三份播種于圓底96孔平板中，并用各自10μg/ml的HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66，CMV PP65(NLVPMVATV)，MAGE-3271-279(FLWGPRALV)，MART-127-35(AAGIGILTV)，gp100g209-2M(IMDQVPFSV)，酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV)，或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)孵育；并在48h后收集培養(yǎng)物上清液并使用Luminex技術(shù)定量評(píng)價(jià)細(xì)胞因子和趨化因子的存在。為了檢測(cè)產(chǎn)生抗原特異性IFN-γ的T細(xì)胞進(jìn)行ELISPOT測(cè)試，其中在10μg/ml肽的存在或不存在下，將PBMC(2×105細(xì)胞/孔)加入預(yù)先覆蓋10μg/ml主要抗IFN-γ單克隆抗體的平板中。
結(jié)果證明通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定了PBMC中肽反應(yīng)性細(xì)胞的寬泛清單。
實(shí)施例4本發(fā)明的方法允許鑒定T細(xì)胞識(shí)別的特異性肽序列。為了測(cè)定抗原決定部位是否由T細(xì)胞識(shí)別和使用本發(fā)明的方法是否可以鑒定該抗原決定部位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，用接受CD34-DC疫苗的HLA-A0201+黑素瘤患者獲得的PBMC孵育5簇由4-7個(gè)來(lái)自15-merMART-1肽文庫(kù)的肽構(gòu)成的肽。設(shè)計(jì)具有四個(gè)(4)氨基酸偏移的15-mer重疊肽來(lái)覆蓋整個(gè)MART-1(Mimotopes，San Diego，CA)的氨基酸序列。每個(gè)肽用2mM的50％乙腈來(lái)重建，并保存于-80℃直至使用。從接受DC疫苗的黑素瘤患者獲得PBMC。將4-6個(gè)成簇的肽(每個(gè)肽1μl)，或單個(gè)肽(1μl)重復(fù)三份接種于96孔平板中，并在室溫干燥。然后，將200μl CM中的2×105個(gè)PBMC加入每個(gè)孔中并在潮濕的5％CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育48小時(shí)。用Luminex測(cè)量培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子或趨化因子水平。
發(fā)現(xiàn)在簇#1培養(yǎng)物中檢測(cè)到顯著較高含量的IP-10。接著用MART-1文庫(kù)的單個(gè)肽制得PBMC的第二個(gè)培養(yǎng)物來(lái)鑒定簇#1內(nèi)負(fù)責(zé)的肽。肽#6誘導(dǎo)顯著的IP-10，表明這種肽是黑素瘤患者T細(xì)胞的抗原決定部位。令人感興趣的，這種肽含有HLA-A0201顯性抗原決定部位序列(MART-127-35；AAGIGILTV)。從接受DC疫苗的黑素瘤患者獲得PBMC。該個(gè)體是HLA-A*0201pos，并使用四聚物結(jié)合測(cè)試表明具有識(shí)別HLA-A*0201-限制的顯性抗原決定部位(MART-126-35)的MART-1特異性CD8+T細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。用這種HLA-A*0201顯性MART-1肽來(lái)培養(yǎng)PBMC時(shí)，顯著誘導(dǎo)了兩種細(xì)胞因子，IL-1α和IP-10，但注意到?jīng)]有IFN-γ的上調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。已知IP-10響應(yīng)I型或II型干擾素而由許多細(xì)胞類(lèi)型分泌，我們猜測(cè)IP-10響應(yīng)MART-1特異性T細(xì)胞分泌的IFN-γ而產(chǎn)生。因此，通過(guò)阻斷IFN-γ的功能完全阻止了IP-10產(chǎn)生(圖4C)。結(jié)果表明IP-10響應(yīng)接種裝載肽的CD34-DC的黑素瘤患者的MART-1肽的誘導(dǎo)依賴(lài)于IFN-γ。
為了檢測(cè)該個(gè)體的PBMC是否含有識(shí)別這種顯性抗原決定部位的CD8+T細(xì)胞，用裝載MART-127-35或其他HLA-0201肽(例如，Mage-3，酪氨酸酶和Flu-MP)的自體單核細(xì)胞衍生的DC來(lái)培養(yǎng)PBMC，并用特定的四聚物來(lái)檢測(cè)抗原特異性CD8+T細(xì)胞群的誘導(dǎo)。如圖4B-4E中所示的，在7天內(nèi)MART-1特異性CD8+T細(xì)胞容易擴(kuò)大，表明該個(gè)體對(duì)于MART-1具有記憶或效應(yīng)CD8+T細(xì)胞，且根據(jù)本發(fā)明的方法用MART-1文庫(kù)來(lái)識(shí)別這種CD8+T細(xì)胞群。
實(shí)施例5本發(fā)明的方法允許鑒定各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的方法允許同時(shí)鑒定用于免疫應(yīng)答的抗原決定部位以及所誘導(dǎo)的應(yīng)答類(lèi)型。根據(jù)實(shí)施例4中給出的一般方法，用5-6個(gè)MART-1或NY-ESO1肽文庫(kù)的肽簇孵育來(lái)自接種疫苗前或接種疫苗后的黑素瘤患者的PBMC 48小時(shí)(MART-15個(gè)簇；NY-ESO18個(gè)簇)。顯示典型的結(jié)果來(lái)表示對(duì)應(yīng)于不同免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子特征的信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。展示每種免疫應(yīng)答模式的肽簇以灰色條顯示。在1-型應(yīng)答中，抑制了IL-10產(chǎn)生，而誘導(dǎo)了IP-10。相反，在T-調(diào)節(jié)應(yīng)答中，誘導(dǎo)了更多的IL-10，由于1-型應(yīng)答的抑制而阻止了IP-10產(chǎn)生。在2-型應(yīng)答中檢測(cè)到IL-13和嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子，而沒(méi)有影響IP-10的含量。因此，本發(fā)明早在48小時(shí)內(nèi)鑒定了由任一種抗原誘導(dǎo)的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。用HLA-A0201限制的Flu-MP58-66，Mage3271-279或稀釋劑重復(fù)三份來(lái)刺激HLA-A0201+捐獻(xiàn)者的2×105個(gè)新鮮PBMC。用基于珠子的多元細(xì)胞因子測(cè)試來(lái)測(cè)量培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子。從重復(fù)三份的數(shù)據(jù)顯示平均±SD。該結(jié)果顯示了在肽刺激48h時(shí)，IL-1α和IP-10的肽特異性產(chǎn)生達(dá)到平臺(tái)期。
實(shí)施例6本發(fā)明的方法允許鑒定由非T-細(xì)胞誘導(dǎo)的其他類(lèi)型的免疫應(yīng)答。已知15-mer肽由其他免疫細(xì)胞如B細(xì)胞，NK細(xì)胞或NK-T細(xì)胞來(lái)識(shí)別，且一些肽結(jié)合未鑒定的受體，導(dǎo)致免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例用于鑒定由非T-細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，使用在MNC-非限制中呈現(xiàn)調(diào)節(jié)信號(hào)的肽。用survivin文庫(kù)的肽簇孵育黑素瘤患者的PBMC。如圖6A-6H中所示的，survivin簇#3的肽#15誘導(dǎo)了細(xì)胞因子產(chǎn)生的強(qiáng)烈調(diào)節(jié)模式。即，強(qiáng)烈誘導(dǎo)了IL-10和IL-1β，且作為1-型應(yīng)答標(biāo)記的IL-1α和IP-10得到嚴(yán)重阻止。
為了測(cè)定這種應(yīng)答是否限于特定類(lèi)型的MHC-分子，用survivin肽#15孵育取自5名正常健康志愿者新鮮血液的PBMC 48小時(shí)，并根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)測(cè)量細(xì)胞因子濃度。肽#15抑制了全部五名正常志愿者的IP-10產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)，表明這種肽不限于特定的HLA亞型。表明survivin肽#15具有改變免疫應(yīng)答的強(qiáng)烈能力，因?yàn)樵陔?15存在下用活的流感病毒刺激黑素瘤患者的PBMC呈現(xiàn)了IP-10誘導(dǎo)的強(qiáng)烈阻止，顯然是由于IL-10產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，肽#15部分地抑制了TSST-1誘導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。耗盡研究表明CD56+細(xì)胞引起IL-10產(chǎn)生和IP-10阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)，表明survivin肽#15作用于NK，NK-T細(xì)胞或γ/δT細(xì)胞群。還表明肽#15維持CD3-CD56+NK細(xì)胞的存活(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，本發(fā)明的方法可用于鑒定任何種類(lèi)由特定類(lèi)型肽誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)。
實(shí)施例7本發(fā)明的方法可用于接種疫苗過(guò)程中黑素瘤患者的免疫調(diào)節(jié)。將細(xì)胞以2×105每孔接種于編號(hào)的，預(yù)先處理的96孔階段-I培養(yǎng)平板中。階段-I培養(yǎng)平板含有腫瘤抗原GP100，MAGE3，NY-ESO和MART-1各自的5個(gè)肽簇，重復(fù)四份，使用每個(gè)簇12個(gè)重疊肽，每個(gè)15個(gè)氨基酸長(zhǎng)，以及KLH和殺滅的Colo細(xì)胞對(duì)照。預(yù)先制備平板來(lái)最大化通量和最小化測(cè)試與測(cè)試之間的變化。將細(xì)胞在37℃孵育5天。平行地，在裝載全譜抗原肽簇的自體成熟DC存在下，將指定用于再次刺激的細(xì)胞孵育7天，PBMC與DC的比例為30∶1。在第七天，將這些細(xì)胞大范圍洗滌并轉(zhuǎn)移至階段-I培養(yǎng)平板24小時(shí)。孵育后，將這些再次刺激的細(xì)胞沉淀，并將各自150微升的上清液以96-孔形式轉(zhuǎn)移至裝有TECAN Genesis RPS機(jī)械樣品處理器的全自動(dòng)化Luminex100細(xì)胞因子多元工作臺(tái)中(TECAN)。
可以結(jié)合條形碼識(shí)別和隨機(jī)微平板分析來(lái)使用能夠運(yùn)行獨(dú)立樣品處理的工作臺(tái)。將重復(fù)兩份的上清液快速篩選INF-γ，TNF-α，IL-13，IL-10和顆粒酶-B的存在，使用預(yù)先制備的且使之生效的多元珠子和試劑的總混合物。將剩余的上清液樣品冷凍用于之后的分析。預(yù)期共同培養(yǎng)的DC可以在階段-I平板的24小時(shí)孵育過(guò)程中引起背景細(xì)胞因子產(chǎn)生。因此，將成熟DC的上清液用作細(xì)胞因子多元分析中的對(duì)照。將最初刺激測(cè)試的細(xì)胞沉淀并重懸浮于含有H3胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基中并在37℃孵育。5天后，通過(guò)胸腺嘧啶核苷結(jié)合測(cè)試重復(fù)四份測(cè)定抗原特異性增殖。將最初刺激測(cè)試的上清液冷凍于-80℃用于稍后的分析。篩選那些再次刺激后細(xì)胞因子產(chǎn)生陽(yáng)性的肽簇在最初刺激過(guò)程中的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
將通過(guò)階段-I細(xì)胞因子多元測(cè)試證明反應(yīng)陽(yáng)性的腫瘤抗原簇分解成它們的組成部分，用于階段-II培養(yǎng)平板上的抗原肽鑒定。階段-II培養(yǎng)平板包括孔-條帶，孔-條帶含有各自簇的12個(gè)成份肽，重復(fù)兩份。預(yù)先制備階段-II肽孔-條帶并置于條形碼標(biāo)記的框中。將融化的PBMC在37℃用裝載階段-I鑒定的特定肽簇的自體成熟DC孵育7天，洗滌并以2×105每孔轉(zhuǎn)移至階段-II培養(yǎng)平板24小時(shí)。孵育后，將細(xì)胞沉淀，并將150微升上清液轉(zhuǎn)移至Luminex工作臺(tái)用于分析。對(duì)于給定肽條帶的階段-II的多元篩選包括在階段-I分析過(guò)程中響應(yīng)其親本簇產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子。成熟DC單獨(dú)作用階段-II分析的背景對(duì)照。一旦給定簇的抗原肽得到鑒定，將它們用于分離抗原特異性效應(yīng)物群。
階段III監(jiān)控包括特異性效應(yīng)細(xì)胞的鑒定和表征肽。該程序中，融化2×106個(gè)PBMC并用載有階段-II中各自分離的抗原肽的自體成熟DC在37℃孵育7天。然后將細(xì)胞洗滌并接受24小時(shí)的再次刺激。再次刺激后，將細(xì)胞進(jìn)行布雷菲德菌素A處理，固定，滲透并用一組抗體染色來(lái)表征表面標(biāo)記和胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)。使用能夠9色分析和分選的FACSaria流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器/分選器(Becton-Dickinson)通過(guò)多色流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來(lái)完成抗原特異性效應(yīng)群的鑒定。通過(guò)Cr51釋放測(cè)試來(lái)體外測(cè)定刺激的T細(xì)胞的CTL功能，使用裝載肽的、EBV轉(zhuǎn)化的自體B-LCL作為目標(biāo)。鑒定后，用裝載自體成熟抗原肽的DC在IL-2和IL-6存在下將抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞群培養(yǎng)7天來(lái)亞克隆，接著在IL-2和IL-7存在下用裝載肽的成熟DC每周再刺激。一旦建立克隆的效應(yīng)細(xì)胞群，進(jìn)行基因表達(dá)模式和細(xì)胞毒性功能的大范圍表征。
實(shí)施例8本發(fā)明的方法允許選擇癌癥中的疫苗抗原決定部位。使用該技術(shù)對(duì)特異性腫瘤相關(guān)抗原決定部位反應(yīng)(1型，2-型或T-調(diào)節(jié))的檢測(cè)和表征可以作為鑒定和表征用于疫苗接種時(shí)引發(fā)所需類(lèi)型免疫應(yīng)答的腫瘤相關(guān)蛋白的抗原決定部位的工具。
為了選擇疫苗抗原決定部位，將個(gè)體的PBMC暴露于表示腫瘤相關(guān)蛋白的抗原決定部位的系列肽文庫(kù)。48小時(shí)培養(yǎng)后，收集上清液，并根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)來(lái)分析所分泌的細(xì)胞因子。鑒定誘導(dǎo)1-型T細(xì)胞應(yīng)答的肽簇，例如，產(chǎn)生IFN-γ但不產(chǎn)生IL-10(T-調(diào)節(jié)應(yīng)答)或2-型細(xì)胞因子。接下來(lái)的步驟中，可以進(jìn)一步選擇對(duì)應(yīng)于給定個(gè)體HLA型的肽并用于該特定個(gè)體的疫苗接種。因此，使用本發(fā)明可以測(cè)定用于特定的疫苗接種以在個(gè)體中產(chǎn)生所需免疫應(yīng)答類(lèi)型的藥劑。
實(shí)施例9本發(fā)明的方法允許選擇傳染病中的疫苗抗原決定部位。已知許多目前可用的對(duì)抗微生物劑的疫苗沒(méi)有給予保護(hù)性免疫力，例如登革熱病毒疫苗。保護(hù)性免疫力的缺乏可能是由于不當(dāng)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)而引起的，例如，一些目前的疫苗抗原決定部位可以誘導(dǎo)2-型，或調(diào)節(jié)T細(xì)胞而不是1-型T細(xì)胞，因此偏移和/或抑制免疫應(yīng)答朝向非保護(hù)性。該實(shí)施例中，本發(fā)明的技術(shù)可以作為鑒定和表征用于接種疫苗時(shí)引發(fā)所需類(lèi)型免疫應(yīng)答的微生物相關(guān)抗原的抗原決定部位的工具。
為了選擇疫苗抗原決定部位，將個(gè)體的PBMC暴露于表示來(lái)自微生物例如登革熱病毒的抗原決定部位的系列肽文庫(kù)。48小時(shí)培養(yǎng)后，收集上清液，并根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)分析所分泌的細(xì)胞因子。鑒定誘導(dǎo)1-型T細(xì)胞應(yīng)答的肽簇，例如，產(chǎn)生IFN-γ但不產(chǎn)生IL-10(T-調(diào)節(jié)應(yīng)答)或2-型細(xì)胞因子。接下來(lái)的步驟中，可以進(jìn)一步選擇并用于疫苗接種的肽。因此，本發(fā)明的方法可以選擇允許在接種疫苗時(shí)誘導(dǎo)保護(hù)性抗微生物免疫性的抗原決定部位。
圖1是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常捐獻(xiàn)者免疫應(yīng)答的圖，其中從HLA-A0201+健康志愿者新鮮吸出的血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以2×105細(xì)胞/孔重復(fù)三份接種于圓底96孔平板中，并用1μl HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MAGE-3271-279(FLWGPRALV)，或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)來(lái)孵育；并在48h后收集培養(yǎng)物上清液并使用Luminex技術(shù)定量評(píng)價(jià)細(xì)胞因子和趨化因子的存在。結(jié)果表明正常捐獻(xiàn)者的新鮮PBMC響應(yīng)Flu-MP肽并產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子。
圖2是描繪了根據(jù)本發(fā)明的對(duì)正常捐獻(xiàn)者中HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)的免疫應(yīng)答的另一個(gè)實(shí)施例。從另一名HLA-A0201+健康志愿者新鮮吸出的血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以5×105細(xì)胞/孔重復(fù)三份接種于圓底96孔平板中，并用10μg/ml HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66(GILGFVFTL)或MART-127-35(AAGIGILTV)，或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)孵育；并在48h后收集培養(yǎng)物上清液并使用Luminex技術(shù)來(lái)定量評(píng)價(jià)細(xì)胞因子和趨化因子的存在。結(jié)果表明正常捐獻(xiàn)者的新鮮PBMC響應(yīng)Flu-MP肽并產(chǎn)生IL-1α和IP-10。兩個(gè)不同正常捐獻(xiàn)者之間的細(xì)胞因子/趨化因子特征是不同的，表明用EPIMAX測(cè)試可以鑒定識(shí)別相同F(xiàn)lu-MP肽的不同類(lèi)型的CD8+T細(xì)胞。
圖3A-3D是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的2名黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。圖3A和3C中，各自對(duì)應(yīng)于患者1和2，將融化的低溫保存于液氮中的來(lái)自2名接受至少8次DC疫苗(自體CD34+造血前體細(xì)胞衍生的裝載四個(gè)(4)黑素瘤相關(guān)抗原的HLA-A2肽的DC)注射的黑素瘤患者的PBMC重復(fù)三份接種于圓底96-孔平板中，并用各自10μg/ml的HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66，CMV PP65(NLVPMVATV)，MAGE-3271-279(FLWGPRALV)，MART-127-35(AAGIGILTV)，gp100g209-2M(IMDQVPFSV)，酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV)，或肽稀釋劑(H2O中的5％DMSO)孵育；并在48h后收集培養(yǎng)物上清液并使用Luminex技術(shù)來(lái)定量評(píng)價(jià)細(xì)胞因子和趨化因子的存在。在各自對(duì)應(yīng)于患者1和2的圖3B和3D中，為了檢測(cè)產(chǎn)生抗原特異性IFN-γ的T細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT測(cè)試，其中在10μg/ml肽的存在或不存在下，將PBMC(2×105細(xì)胞/孔)加入預(yù)先覆蓋10μg/ml主要抗IFN-γ單克隆抗體的平板中。結(jié)果表明通過(guò)本發(fā)明的方法鑒定了寬的PBMC中肽反應(yīng)性細(xì)胞的所有組成部分。
圖4A-4C是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。對(duì)于圖4A，從接受DC疫苗的HLA-A*0201pos黑素瘤患者獲得PBMC，并用裝載HLA-A*0201-限制的顯性MART-1肽(MART-126-35)的自體DC來(lái)刺激。使用四聚物測(cè)試表明個(gè)體具有識(shí)別HLA-A*0201-限制的顯性抗原決定部位(MART-126-35)的MART-1特異性CD8+T細(xì)胞(圖4A)。用該HLA-A*0201顯性MART-1肽直接培養(yǎng)PBMC時(shí)，特異性地誘導(dǎo)了兩種細(xì)胞因子，IL-1α和IP-10，但是注意到?jīng)]有IFN-γ的上調(diào)(圖4B)。已知由許多細(xì)胞類(lèi)型響應(yīng)I型或II型干擾素而產(chǎn)生IP-10，我們推測(cè)IP-10響應(yīng)MART-1特異性T細(xì)胞分泌的IFN-γ而產(chǎn)生。因此，通過(guò)使用IFN-γR阻斷mAb來(lái)阻斷IFN-γ的功能而完全阻止了IP-10的產(chǎn)生(圖4C)。結(jié)果表明響應(yīng)接種裝載肽的CD34-DC的黑素瘤患者中的MART-1肽的IP-10誘導(dǎo)依賴(lài)于IFN-γ。
圖5是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常捐獻(xiàn)者免疫應(yīng)答動(dòng)力學(xué)的圖。用HLA-A0201限制肽Flu-MP58-66，或Mage3271-279，或稀釋劑重復(fù)三份刺激HLA-A0201*捐獻(xiàn)者的2×105個(gè)新鮮PBMC所示的時(shí)間段。用基于珠子的多元細(xì)胞因子測(cè)試來(lái)測(cè)量培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子。從重復(fù)三份的數(shù)據(jù)中顯示平均SD。這些結(jié)果表明在肽刺激48h時(shí)，EPIMAX測(cè)試中的IL-1a和IP-10的肽特異性產(chǎn)生到達(dá)平臺(tái)期。
圖6描繪了根據(jù)本發(fā)明的抗原決定部位聚焦的略圖。首先，將編碼抗原蛋白的15-mer重疊肽文庫(kù)重復(fù)兩份分成肽簇(5-10個(gè)肽/簇)。首先用每個(gè)簇肽刺激5×105PBMC(簇分析)。用基于珠子的多元細(xì)胞因子測(cè)試來(lái)測(cè)量培養(yǎng)物上清液中的多種細(xì)胞因子，并測(cè)定了“碰撞(hit)”簇。第二個(gè)培養(yǎng)物中，抗原決定部位聚焦，用“碰撞”簇的單個(gè)肽培養(yǎng)PBMC 48h，隨后用多重細(xì)胞因子分析來(lái)測(cè)定抗原肽。
圖7是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由特異性T細(xì)胞識(shí)別的抗原決定部位。從接受DC疫苗的黑素瘤患者獲得PBMC。該個(gè)體是HLA-A*0201pos，并使用四聚物結(jié)合測(cè)試表明具有識(shí)別HLA-A*0201-限制性顯性抗原決定部位(MART-126-35)的MART-1特異性CD8+T細(xì)胞(圖4A)。將覆蓋整個(gè)MART-1氨基酸序列的具有4個(gè)氨基酸偏移的15-mer重疊肽以4-6個(gè)成簇的肽(10μM每個(gè)肽)或單個(gè)肽(10μM)重復(fù)三份接種于96-孔平板中；并將200μl CM中的2×105細(xì)胞PBMC加入每個(gè)孔中并在潮濕的5％CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育48小時(shí)；并用Luminex測(cè)量培養(yǎng)物上清液中的化學(xué)因子或趨化因子水平。如圖7中所示的，MART-1#6肽誘導(dǎo)了從接種疫苗的黑素瘤患者獲得的PBMC中IP-10的強(qiáng)烈產(chǎn)生。MART-1肽#6含有10-mer HLA-A2顯性抗原決定部位，如圖4A中所繪的。因此，本發(fā)明的方法可以鑒定肽特異性的T細(xì)胞應(yīng)答。
圖8是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。從接受DC疫苗的黑素瘤患者獲得PBMC。該個(gè)體是HLA-A*0201pos，且使用四聚物結(jié)合測(cè)試表明具有識(shí)別HLA-A*0201限制性顯性抗原決定部位(MART-126-35)的MART-1特異性CD8+T細(xì)胞(圖4A)。在阻斷IFNγR mAb(20μg/m1)或?qū)φ誱Ab存在下，用A2-MART-1肽或15-mer MART-1肽#6刺激PBMC 48h。將A2-HIVpol肽和15-merMART-1肽#15用作對(duì)照肽。顯示了培養(yǎng)物上清液中的IL-1a和IP-10水平。該結(jié)果表明了IL-1a和IP-10的產(chǎn)生都依賴(lài)于肽特異性T細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生，證明了IL-1a和IP-10是1型T細(xì)胞應(yīng)答的替代標(biāo)記，即Th1和Tc1細(xì)胞。
圖9是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。用編碼黑素瘤抗原的重疊肽簇或單個(gè)肽刺激從黑素瘤患者獲得的PBMC48h。用Luminex測(cè)量培養(yǎng)48小時(shí)的培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子/趨化因子水平。該結(jié)果表明抗原決定部位聚焦的概念可以應(yīng)用于本發(fā)明方法中的任何抗原和任何細(xì)胞因子。
圖10描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用編碼MART-1(黑素瘤分化抗原)的重疊肽簇或單個(gè)肽來(lái)刺激從接受DC疫苗的黑素瘤患者獲得的PBMC。顯示了培養(yǎng)48h時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-1a和IP-10水平。使用簇分析(上圖)，簇#2和#3誘導(dǎo)了IL-1a和IP-10的上調(diào)。使用抗原決定部位聚焦(下圖)，簇#2的肽#6和簇#3的肽#13鑒定為特異性T細(xì)胞的抗原決定部位。該結(jié)果表明本發(fā)明的方法可以鑒定能夠產(chǎn)生IFNγ的特異性T細(xì)胞的抗原決定部位。
圖11描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用白細(xì)胞清除術(shù)從圖10相同的個(gè)體獲得PBMC，在凍存管中制得等份試樣，并保存于液氮中直至使用。用MART-1 15-mer肽#6，肽#13或稀釋劑刺激融化的PBMC。將該實(shí)驗(yàn)分開(kāi)重復(fù)三次。顯示了培養(yǎng)48h時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-1a和IP-10水平。3個(gè)實(shí)驗(yàn)中的三個(gè)都表明了用肽#6或#13刺激時(shí)IL-1a和IP-10的上調(diào)，證明了該EPIMAX測(cè)試的高度再現(xiàn)性。
圖12A是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。用單個(gè)15-mer MART-1肽或稀釋劑刺激從DC接種前和8次DC接種后的黑素瘤患者(與圖10的相同)獲得的PBMC。顯示了培養(yǎng)48h時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-1a和IP-10水平。盡管后-PBMC顯示了響應(yīng)鑒定的兩種(2)15-mer肽(肽#6和#13)的IL-1a和IP-10上調(diào)，前-PBMC對(duì)于響應(yīng)肽#13的IL-1a和IP-10上調(diào)失敗。前-PBMC響應(yīng)肽#6的IL-1a和IP-10產(chǎn)生比后-PBMC的低。這些結(jié)果表明DC接種誘導(dǎo)了肽#13特異性T細(xì)胞應(yīng)答并提高了肽#6-特異性T細(xì)胞應(yīng)答。為了檢測(cè)這種假設(shè)，我們使用了一種不同的充分確定的方法，胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)測(cè)試。在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素的存在下，用MART-1 15-mer單個(gè)肽刺激相同的PBMC 8h。細(xì)胞膜滲透后，用抗IFN-γ mAb將細(xì)胞染色并用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)分析IFN-γ+群(圖12B)。盡管在后-PBMC中約0.15％的CD8+T細(xì)胞響應(yīng)肽#6或#13而產(chǎn)生IFN-g，在前-PBMC中沒(méi)有檢測(cè)到IFN-g產(chǎn)生。這些結(jié)果證明EPIMAX可以用于監(jiān)控癌癥個(gè)體中的抗原特異性T細(xì)胞，并表明通過(guò)檢測(cè)EPIMAX中的細(xì)胞因子/趨化因子的調(diào)節(jié)規(guī)模來(lái)預(yù)測(cè)每個(gè)特異性T細(xì)胞應(yīng)答的規(guī)模。
圖13描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。CFSE(56-羧基熒光素二醋酸丁二酰亞胺酯)是允許用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器鑒定細(xì)胞分裂數(shù)量的痕量染料。因?yàn)镋PIMAX是非破壞性測(cè)試，我們將EPNMAX結(jié)合CFSE技術(shù)來(lái)測(cè)定抗原特異性T細(xì)胞的增殖能力。證實(shí)CFSE染色沒(méi)有改變EPIMAX中的細(xì)胞因子產(chǎn)生。首先用1μMCFSE將從相同黑素瘤患者(與圖10的相同)獲得的PBMC染色，并用編碼MART-1的重疊肽簇或單個(gè)肽刺激。在培養(yǎng)的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC將細(xì)胞染色，并分析響應(yīng)肽刺激的T細(xì)胞增殖。圖顯示了CD8+T細(xì)胞增殖的分析。MART-1簇#2和#3，以及肽#6和#13誘導(dǎo)了一些CD8+T細(xì)胞群中CFSE強(qiáng)度的稀釋?zhuān)C明肽刺激誘導(dǎo)了抗原特異性CD8+T細(xì)胞的增殖。該結(jié)果表明結(jié)合其他方法可以獲得抗原特異性T細(xì)胞的更多表型和/或功能表證。
圖14描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。首先用1μM CFSE將從相同黑素瘤患者(與圖10中的相同)獲得的PBMC染色，用編碼MART-1的單個(gè)肽重復(fù)三份來(lái)刺激。在培養(yǎng)的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC將細(xì)胞染色，并分析響應(yīng)肽刺激的T細(xì)胞增殖。圖顯示了CD8+T細(xì)胞群內(nèi)CFSE稀釋的CD8+T細(xì)胞群的％。MART-1肽#6和#13誘導(dǎo)了一些CD8+T細(xì)胞群中CFSE強(qiáng)度的稀釋?zhuān)C明肽刺激誘導(dǎo)了抗原特異性CD8+T細(xì)胞的增殖。
圖15描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。CD8+T細(xì)胞識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞上表達(dá)的MHC-I類(lèi)分子范圍內(nèi)的8-10mer肽。為了檢測(cè)鑒定的CD8+T細(xì)胞的準(zhǔn)確抗原決定部位，用15mer MART-1肽#13內(nèi)的1個(gè)氨基酸延遲來(lái)產(chǎn)生10mer重疊肽，并用于刺激相同個(gè)體的PBMC。顯示了48h時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-1a和IP-10水平，和培養(yǎng)8天時(shí)的CFSE稀釋試驗(yàn)。這些結(jié)果證明MART-154-62是CD8+T細(xì)胞的抗原決定部位，其允許IFN-γ的產(chǎn)生和特異性CD8+T細(xì)胞的增殖。因此，EPIMAX允許鑒定CD8+T細(xì)胞的準(zhǔn)確抗原決定部位。
圖16A-D描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用編碼NY-ESO1(在大部分黑素瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)的睪丸癌抗原)的重疊肽簇或單個(gè)肽刺激從HLA-A2neg黑素瘤患者獲得的PBMC。簇#5內(nèi)的NY-ESO1肽#24在48h時(shí)誘導(dǎo)了IP-10的上調(diào)(圖16A)。這些結(jié)果表明NY-ESO193-107是作為抗原決定部位由特異性T細(xì)胞識(shí)別的。為了檢測(cè)是哪個(gè)T細(xì)胞子集識(shí)別該抗原決定部位，在抗MHC I類(lèi)阻斷mAb(W6/32)或同型對(duì)照mAb存在下，用NY-ESO1肽#24刺激個(gè)體的PBMC。如圖16B中所示的，通過(guò)W6/32完全阻止了響應(yīng)肽#24的IP-10產(chǎn)生，表明IP-10的產(chǎn)生依賴(lài)于MHC I類(lèi)分子，因此CD8+T細(xì)胞識(shí)別肽#24。
為了鑒定CD8+T細(xì)胞的準(zhǔn)確抗原決定部位，產(chǎn)生肽#24內(nèi)的9mer重疊肽，并用于刺激個(gè)體的PBMC。如圖16C所示的，NY-ESO194-102誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的IP-10上調(diào)，表明這是CD8+T細(xì)胞的抗原決定部位。
為了鑒定HLA-限制性組成部分，用NY-ESO1肽#24脈沖的自體單核細(xì)胞衍生的DC在IL-2(10IU/ml)存在下刺激PBMC。在培養(yǎng)的第9天，用編碼各種HLA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的缺乏MHC I類(lèi)分子的LCL再次刺激細(xì)胞，用NY-ESO194-102肽脈沖或未脈沖。用ELISA測(cè)量8h刺激過(guò)程中的IFN-γ分泌。如圖16D所示的，用NY-ESO194-102肽脈沖的HLA-B*3501轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)了T細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)生，表明這種新的肽是通過(guò)HLA-B*3501分子遞呈的，這些結(jié)果表明EPIMAX允許鑒定HLA-A2neg個(gè)體中CD8+T細(xì)胞的新抗原決定部位，結(jié)合其他方法允許我們鑒定它們的HLA限制性組成部分。
圖17描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用MART-1 15-mer肽#6和#13內(nèi)的10mer重疊肽刺激從黑素瘤患者(與圖10的相同)獲得的PBMC 48h。圖17顯示了48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IP-10水平。MART-126-35(已知抗原決定部位)和MART-153-62(新抗原決定部位)是抗原決定部位。
圖18描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用MART-1 15-mer肽#6內(nèi)的10mer重疊肽刺激從兩名HLA-A2neg黑素瘤患者獲得的PBMC 48小時(shí)。顯示了48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IP-10水平。MART-126-35(已知抗原決定部位)是兩名個(gè)體的抗原決定部位。已知該抗原決定部位限于HLA-A2。因?yàn)檫@些個(gè)體是HLA-A2neg，且這兩名個(gè)體之間的HLA-I類(lèi)亞型完全不同，通過(guò)至少三種不同的MHC I類(lèi)分子來(lái)遞呈該抗原決定部位。這是用EPIMAX鑒定CD8+T細(xì)胞的抗原決定部位的另一個(gè)實(shí)例。
圖19描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用#6至#15的單獨(dú)MART-1 15-mer肽重復(fù)三份刺激從黑素瘤患者(與圖10的相同)獲得的PBMC 48h。顯示了48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-2水平。MART-1肽#10和#11誘導(dǎo)了IL-2的上調(diào)。該結(jié)果證明了用EPIMAX鑒定抗原決定部位的另一個(gè)實(shí)例。
圖20描繪了用圖19中所示的鑒定的15-mer肽刺激時(shí)CD4+T細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生。在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素存在下用MART-1 15-mer肽#10刺激相同個(gè)體的PBMC 8小時(shí)。通過(guò)特定mAb的染色來(lái)分析IL-2的產(chǎn)生。該圖證明了CD4+T細(xì)胞群響應(yīng)MART-1肽#10而產(chǎn)生IL-2。這些結(jié)果表明EPIMAX還可以鑒定CD4+T細(xì)胞的抗原決定部位。
圖21A-B描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。首先用1μM CFSE將從相同黑素瘤患者(與圖10的相同)獲得的PBMC染色，并用編碼MART-1的單個(gè)肽重復(fù)三份來(lái)刺激。在培養(yǎng)的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC將細(xì)胞染色，并分析響應(yīng)肽刺激的T細(xì)胞增殖。圖21A顯示了CD4+T細(xì)胞群內(nèi)CFSE稀釋的CD4+T細(xì)胞群的％。MART-1肽#10和#11比沒(méi)有肽誘導(dǎo)了更多CFSE稀釋的CD4+T細(xì)胞群，證明了這些肽誘導(dǎo)了抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增殖。圖21B描繪了CD4+T細(xì)胞群內(nèi)響應(yīng)各個(gè)MART-1 15-mer肽的CFSE稀釋的CD4+T細(xì)胞群。MART-1肽#10和#11誘導(dǎo)了比其他15-mer肽顯著多的CD4+T細(xì)胞增殖。這些結(jié)果強(qiáng)烈地表明了EPIMAX允許鑒定CD4+T細(xì)胞的抗原決定部位，并通過(guò)結(jié)合CFSE技術(shù)允許測(cè)定特異性CD4+T細(xì)胞的增殖能力。
圖22 A-C描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。首先用1μM CFSE將從接受DC接種的HLA-A2neg黑素瘤患者獲得的PBMC染色，并用編碼NY-ESO1的肽簇刺激。在培養(yǎng)的第8天，用CD8-PE，CD3-PerCP和CD4-APC將細(xì)胞染色，并分析響應(yīng)肽刺激的T細(xì)胞增殖，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器基于CFSE稀釋來(lái)分析。圖22A顯示了CD4+T細(xì)胞群內(nèi)CFSE稀釋的CD4+T細(xì)胞群的百分比(％)。NY-ESO1簇#8比其他簇誘導(dǎo)了更多的CFSE稀釋的CD4+T細(xì)胞群，證明了這些肽誘導(dǎo)了抗原特異性CD4+T細(xì)胞的增殖。圖22B描繪了培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-2水平。在含有NY-ESO1簇#8的培養(yǎng)物中產(chǎn)生了IL-2。為了鑒定CD4+T細(xì)胞的抗原決定部位，用NY-ESO1簇#8內(nèi)的單個(gè)肽刺激CFSE染色的PBMC。在第8天使用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器基于CFSE稀釋來(lái)分析CD4+T細(xì)胞增殖。如圖22C所示的，NY-ESO1149-167和NY-ESO1165-180誘導(dǎo)了更多的CD4+T細(xì)胞增殖，證明了這些是抗原決定部位。該結(jié)果表明鑒定黑素瘤抗原中CD4+T細(xì)胞抗原決定部位的另一個(gè)實(shí)例。
圖23描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用#6至#15的單個(gè)MART-1 15-mer肽重復(fù)三份刺激從相同個(gè)體(與圖10的相同)獲得的PBMC。顯示了48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-5水平。MART-1肽#10和#11誘導(dǎo)了IL-5的上調(diào)。該結(jié)果證明了用EPIMAX鑒定抗原決定部位的另一個(gè)實(shí)例。
圖24描繪了用圖23所示的鑒定的15-mer肽刺激時(shí)CD4+T細(xì)胞的IL-5產(chǎn)生。在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素的存在下，用MART-115-mer肽#11刺激相同個(gè)體的PBMC 8小時(shí)。通過(guò)特定的mAb染色來(lái)分析IL-5的產(chǎn)生。該圖證明了CD4+T細(xì)胞群響應(yīng)MART-1肽#11而產(chǎn)生IL-5。這些結(jié)果表明EPIMAX可以鑒定抗原決定部位以及特異性CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子類(lèi)型。
圖25描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。用TRP-1簇#25或gp100簇#15的單個(gè)15-mer肽刺激從兩名黑素瘤患者獲得的CFSE染色的PBMC。在48h時(shí)測(cè)量培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子，并在培養(yǎng)的第8天基于CFSE稀釋測(cè)試來(lái)分析T細(xì)胞的增殖。結(jié)果表明TRP-1肽#124和gp100肽#152是CD4+T細(xì)胞的抗原決定部位，兩個(gè)都是CD4+T細(xì)胞的新抗原決定部位。肽刺激誘導(dǎo)了各種效應(yīng)物細(xì)胞因子產(chǎn)生，如IL-2，IL-5，IL-13和IP-10(IFN-γ)，和特異性CD4+T細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果表明鑒定黑素瘤抗原中CD4+T細(xì)胞抗原決定部位的另一個(gè)實(shí)例，并表明EPIMAX可以用于鑒定不同類(lèi)型的T細(xì)胞應(yīng)答。
圖26描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的三名黑素瘤患者的免疫應(yīng)答。EPIMAX允許鑒定不同的T細(xì)胞子集，如1型(Th1和Tc1)，2型(Th2和Tc2)細(xì)胞。用新鑒定的黑素瘤肽(15-mer)刺激從轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者獲得的PBMC 48h，并用基于珠子的多元測(cè)試來(lái)測(cè)量培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子。有色柱表示使用所示肽的細(xì)胞因子水平(下圖)，和空心柱表示使用稀釋劑的那些。顯示了三種不同T細(xì)胞子集，1型，2型和IL-10型的代表性細(xì)胞因子產(chǎn)生。通過(guò)IL-1a和IP-10的上調(diào)來(lái)鑒定1型應(yīng)答，而通過(guò)2型細(xì)胞因子如IL-4，IL-5和IL-13的上調(diào)而沒(méi)有IP-10的上調(diào)來(lái)鑒定2型應(yīng)答。將EPIMAX用于鑒定特征在于IL-10上調(diào)(IL-10型)的新T細(xì)胞應(yīng)答。
圖27描繪了使用EPIMAX方法鑒定的4個(gè)黑素瘤抗原，即gp100，MART-1，NY-ESO1和TRP-1內(nèi)的CD4+和CD8+T細(xì)胞的新抗原決定部位的概述。通過(guò)用EPIMAX篩選13名個(gè)體的PBMC來(lái)鑒定這些新的抗原決定部位。
表1描述了用EPIMAX鑒定的CD8+T細(xì)胞的抗原決定部位的概述。顯示了鑒定的15-mer肽及其氨基酸序列編號(hào)。一些15-mer肽用9-mer或10-mer重疊肽來(lái)集中，并顯示于表中。

表2描繪了用EPIMAX鑒定的Th0，Th1和Th2細(xì)胞的抗原決定部位的概述。顯示了鑒定的15-mer肽及其氨基酸序列編號(hào)。

表3描繪了用EPIMAX鑒定的IL-10型CD4+T細(xì)胞的抗原決定部位的概述。顯示了鑒定的15-mer肽及其氨基酸序列編號(hào)。

圖28是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的三名黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。用MART-1，gp100，NY-ESO1和TRP-1重疊肽的轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者(13名個(gè)體)獲得的PBMC的EPIMAX分析產(chǎn)生了16個(gè)誘導(dǎo)1型應(yīng)答的肽，15個(gè)誘導(dǎo)0/2型應(yīng)答的肽和9個(gè)誘導(dǎo)IL-10型的肽。在培養(yǎng)的第2天測(cè)量細(xì)胞因子。各自顯示了各個(gè)T細(xì)胞子集中的IL-1α和IP-10水平。每個(gè)點(diǎn)表示用鑒定的單個(gè)肽刺激這些個(gè)體PBMC培養(yǎng)物的各個(gè)分開(kāi)孔中的細(xì)胞因子水平。該結(jié)果清楚地表明了IL-1α和IP-10在1型應(yīng)答中完全相關(guān)。
圖29A-D是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。用編碼NY-ESO1的肽簇或單個(gè)肽刺激從黑素瘤患者獲得的PBMC。顯示了培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)培養(yǎng)物上清液中的IL-10水平(圖29A)。NY-ESO1肽#39和#40是抗原決定部位。為了研究IL-10產(chǎn)生的來(lái)源，在抗CD28/CD49d mAb和莫能菌素存在下用肽#39刺激PBMC 8小時(shí)，并用IL-10特異性mAb染色。如圖29B中所示的，約0.11％的CD4+T細(xì)胞響應(yīng)NY-ESO1肽#39而產(chǎn)生了IL-10。該結(jié)果表明了EPIMAX允許在黑素瘤患者中產(chǎn)生IL-10的黑素瘤抗原特異性CD4+T細(xì)胞。接著，為了評(píng)價(jià)該產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞是否具有調(diào)節(jié)特性，將transwell中的肽#39或無(wú)關(guān)15-mer肽刺激的PBMC加入“第三方”MLR中來(lái)測(cè)試通過(guò)這些可溶性介質(zhì)的釋放對(duì)T細(xì)胞擴(kuò)展的抑制。為了避免肽特異性T細(xì)胞應(yīng)答的影響，MLR使用CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞和異源成熟DC，這兩種細(xì)胞都來(lái)自健康志愿者。用NY-ESO1肽#39但沒(méi)用對(duì)照肽刺激的個(gè)體PBMC顯著抑制了MLR中的增殖(圖29C，29D)。這些結(jié)果表明EPIMAX方法可以鑒定腫瘤抗原特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞。
圖30是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。用編碼NY-ESO1的單個(gè)肽刺激兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)即DC接種前和8次DC接種后的與圖29A-D中相同黑素瘤患者獲得的PBMC。顯示了培養(yǎng)48h時(shí)培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子/趨化因子水平。該結(jié)果證明了在接種疫苗后IL-10型信號(hào)消失，表明在接種疫苗后CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的功能丟失。這些結(jié)果證明了用EPIMAX測(cè)試通過(guò)DC疫苗調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答的另一個(gè)實(shí)例。
圖31是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。我們已經(jīng)在7名黑素瘤患者中鑒定了黑素瘤抗原中9個(gè)誘導(dǎo)IL-10型應(yīng)答的不同抗原決定部位。用各個(gè)個(gè)體特異性鑒定的15-mer肽孵育從黑素瘤患者獲得的PBMC 48h。該圖顯示了通過(guò)用鑒定的IL-10型肽孵育抑制了自發(fā)IP-10的產(chǎn)生。這是用EPIMAX鑒定產(chǎn)生IL-10的CD4+T細(xì)胞抑制功能的另一個(gè)證明。
圖32是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。顯示了用鑒定的誘導(dǎo)IL-10的15-mer肽的各個(gè)PBMC培養(yǎng)物中的IL-1β和IP-10水平。每個(gè)點(diǎn)表示用鑒定的唯一單個(gè)15-mer肽的PBMC培養(yǎng)物中各個(gè)分開(kāi)孔中的細(xì)胞因子水平。該結(jié)果顯示了在鑒定的IL-10型應(yīng)答中IL-1β和IL-10相關(guān)，因此兩種細(xì)胞因子在EPIMAX中是鑒定IL-10型細(xì)胞的良好標(biāo)記。
圖33是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖。將從三名正常健康志愿者獲得的新鮮PBMC分成3批。用編碼流感病毒基質(zhì)蛋白質(zhì)(Flu-MP)的15-mer重疊肽簇刺激各批的PBMC，重復(fù)兩份(2×105細(xì)胞/孔，每個(gè)肽10μM)，因此形成6褶樣品。顯示了培養(yǎng)48h時(shí)的IP-10水平。黑條和陰影表示沒(méi)有用肽的培養(yǎng)物中的IP-10平均±3SD值。測(cè)定IP-10水平超過(guò)該背景的平均+3SD對(duì)響應(yīng)肽簇誘導(dǎo)IP-10是陽(yáng)性的。正常捐獻(xiàn)者#1中，12個(gè)肽簇中的9個(gè)評(píng)價(jià)為陽(yáng)性，高于6褶樣品中的4個(gè)，表明該捐獻(xiàn)者具有非常廣泛的Flu-MP特異性T細(xì)胞所有組成部分。相反，正常捐獻(xiàn)者#3，沒(méi)有簇誘導(dǎo)IP-10的上調(diào)。EPIMAX允許鑒定對(duì)抗給定抗原蛋白的全部寬度T細(xì)胞應(yīng)答。此外，該研究顯示了EPIMAX是高度可再現(xiàn)的測(cè)試。
圖34是根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖。顯示了圖33中所示相同研究中的IL-6和IP-10水平。驚人地，在正常捐獻(xiàn)者#3中，沒(méi)有鑒定出IP-10產(chǎn)生，但許多肽簇對(duì)于IL-6產(chǎn)生評(píng)分為陽(yáng)性。該結(jié)果證明了顯示在EPIMAX中不同系列細(xì)胞因子的測(cè)量可以鑒定不同T細(xì)胞子集的實(shí)例。
圖35是根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康捐獻(xiàn)者免疫應(yīng)答的圖。顯示了圖33中所示研究中的IL-1a和IP-10水平。每個(gè)點(diǎn)表示用肽簇的PBMC培養(yǎng)物中各個(gè)分開(kāi)孔中的細(xì)胞因子水平。在所有捐獻(xiàn)者中，EPIMAX中的IL-1a和IP-10水平非常相關(guān)，證實(shí)了這些兩個(gè)標(biāo)記在1型應(yīng)答中完全相關(guān)。
圖36是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖。將從捐獻(xiàn)者#1獲得的冷凍PBMC融化，并用編碼Flu-MP的15-mer肽簇或單個(gè)肽刺激。顯示了IL-1a和IP-10的水平。每個(gè)點(diǎn)表示用肽簇或單個(gè)肽的PBMC培養(yǎng)物中各個(gè)分開(kāi)孔中的細(xì)胞因子水平。即使用冷凍的PBMC，IL-1a和IP-10的水平非常相關(guān)(P＜0.0001，r＝0.9121)，表明這兩個(gè)標(biāo)記可以用于鑒定EPIMAX中的1型應(yīng)答，不管PBMC是新鮮或冷凍獲得的。
圖37是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖。用編碼Flu-MP的15-mer肽簇刺激從捐獻(xiàn)者#1獲得的新鮮或冷凍PBMC。顯示了IL-1a和IP-10的水平。如圖37中所示的，簇#6和#12都誘導(dǎo)了新鮮和冷凍PBMC中IL-1a和IP-10的上調(diào)。該研究證明了冷凍PBMC可以用于使用EPIMAX來(lái)監(jiān)控抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
圖38A，38B是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖。將從捐獻(xiàn)者#1獲得的冷凍PBMC融化并用編碼Flu-MP的肽簇或單個(gè)肽在6-褶中刺激(2×105細(xì)胞/孔，10μM每個(gè)肽)。顯示了培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)的IP-10水平(圖37A)。另一個(gè)研究中，用相同濃度的15-mer肽刺激較高數(shù)量的PBMC(2×106細(xì)胞/孔)，重復(fù)三份。如圖37B中所示的，盡管在兩個(gè)研究中，肽#58和#59啟動(dòng)了IP-10產(chǎn)生，樣品和對(duì)照培養(yǎng)物之間的反差更高，其中EPIMAX中使用了更高的PBMC/孔。因此，每孔較高數(shù)量的PBMC有助于降低EPIMAX測(cè)試中的可變性和敏感性。鑒于PBMC中抗原特異性T細(xì)胞的低頻率(通常105PBMC中1個(gè))，似乎合理的是當(dāng)少數(shù)細(xì)胞響應(yīng)肽刺激時(shí)，用EPIMAX(或?qū)嶋H上任何種類(lèi)的測(cè)試)不可以檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)答。因此，常規(guī)EPIMAX測(cè)試中，我們使用5×105PBMC/孔。
圖39A和39B是描繪了正常健康志愿者對(duì)抗EPIMAX測(cè)試中鑒定的肽的免疫應(yīng)答的圖。將PBMC以1×106細(xì)胞/ml重懸浮于CM中，并將1ml細(xì)胞懸浮液放入培養(yǎng)管中，并用Flu-MP文庫(kù)的所示單個(gè)肽刺激7天。收集培養(yǎng)的PBMC并用所示肽脈沖的DC在莫能霉素的存在下再次刺激5h。細(xì)胞滲透后，用特異性mAb檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞因子。顯示了CD3+CD4+T細(xì)胞群中產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞百分比(圖39A)。用顯性肽的刺激誘導(dǎo)了特異性CD4+T細(xì)胞的增殖。首先用1mMCFSE將捐獻(xiàn)者的PBMC染色。將PBMC以1×106細(xì)胞/ml重懸浮于CM中，并將1ml細(xì)胞懸浮液放入培養(yǎng)管中，用Flu-MP文庫(kù)的所示單個(gè)肽刺激6天。用抗CD3和CD4 mAb將刺激的細(xì)胞染色，并用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器基于CFSE稀釋來(lái)分析CD4+T細(xì)胞增殖。顯示了CD3+CD4+T細(xì)胞群中的CFSE-細(xì)胞百分比(圖39B)。這些結(jié)果證明了EPIMAX允許鑒定功能Flu-MP特異性CD4+T細(xì)胞的抗原決定部位的證據(jù)。
圖40是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖。從圖33中的捐獻(xiàn)者#2獲得PBMC。將冷凍的PBMC融化并用Flu-MP簇#11或簇#11內(nèi)的單個(gè)15-mer肽刺激(5×105細(xì)胞/孔，20μM每個(gè)肽)。顯示了培養(yǎng)48h時(shí)細(xì)胞因子的含量。這些結(jié)果表明肽#52和#53是Flu-MP特異性T細(xì)胞的抗原決定部位，顯示了鑒定特異性CD4+T細(xì)胞的新抗原決定部位的另一個(gè)實(shí)例。
圖41A，41B是描繪了正常健康個(gè)體對(duì)抗EPIMAX測(cè)試中鑒定的肽的免疫應(yīng)答的圖。用CFSE標(biāo)記圖40研究中所用的PBMC，并用Flu-Mp簇#11內(nèi)的單個(gè)肽刺激。在培養(yǎng)第8天分析CFSE稀釋的CD4+T細(xì)胞(圖41A)。另一個(gè)研究中，在培養(yǎng)第6，7，8和10天分析CFSE-稀釋的CD4+T細(xì)胞群(圖41B)。這些研究證明了用EPIMAX鑒定的肽(Flu-MP肽#52和#53)誘導(dǎo)了肽特異性CD4+T細(xì)胞的增殖，且增殖的CD4+T細(xì)胞群在肽刺激的第7或8天達(dá)到峰值。該研究顯示了鑒定特異性CD4+T細(xì)胞新抗原決定部位的另一個(gè)實(shí)例，并驗(yàn)證了在培養(yǎng)的第8天進(jìn)行增殖CD4+T細(xì)胞群的分析是有效的。
圖42是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖。從未經(jīng)受DC接種的黑素瘤患者獲得PBMC。個(gè)體接受裝載殺滅的異源黑素瘤細(xì)胞系的自源DC疫苗?？赡艿氖荄C疫苗誘導(dǎo)了該個(gè)體中在用于DC疫苗的異源黑素瘤細(xì)胞系上表達(dá)的異源抗原特異性的T細(xì)胞。為了檢測(cè)這種可能性，用編碼HLA-B*4001的15-mer重疊肽刺激個(gè)體的PBMC，HLA-B*4001在黑素瘤細(xì)胞系上表達(dá)，但不在個(gè)體細(xì)胞上表達(dá)。如圖42中所示的，簇#1內(nèi)的肽#5和肽#7誘導(dǎo)了PBMC培養(yǎng)物中的IP-10產(chǎn)生。如所期待的，這兩個(gè)抗原決定部位對(duì)于個(gè)體是抗原決定部位，因?yàn)閮蓚€(gè)肽都含有氨基酸錯(cuò)配。這些結(jié)果證明EPIMAX可以鑒定異源抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。因此該方法可以用于鑒定器官移植環(huán)境中的異源抗原特異性T細(xì)胞。
圖43是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的1-型糖尿病個(gè)體免疫應(yīng)答的圖。從服用免疫抑制藥物如驍悉(cellcept)和潑尼松龍(Predonisolone)的1型糖尿病個(gè)體獲得PBMC。用編碼IA-2的單個(gè)15-mer肽刺激新鮮的PBMC(5×105細(xì)胞/孔)，IA-2十一種在β-胰島細(xì)胞上特異性表達(dá)的自體抗原。顯示了培養(yǎng)48h時(shí)的IP-10水平。15-mer肽#47，60，61，62，64和66誘導(dǎo)了PBMC培養(yǎng)物中IP-10產(chǎn)生的上調(diào)。
該研究證明了該個(gè)體具有寬的IA-2特異性1型細(xì)胞的所有組成部分。此外，6個(gè)中的5個(gè)(肽#47，60，61，62和66，序列顯示于表4中)是T細(xì)胞的新抗原決定部位。因此，該研究表明EPIMAX允許我們鑒定自身免疫性疾病模型中的抗原決定部位和T細(xì)胞應(yīng)答類(lèi)型，甚至在免疫抑制藥物的藥物治療下。

圖44A和44B是描繪根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。用survivin肽文庫(kù)的5個(gè)肽簇(7-8個(gè)肽/簇)孵育接種疫苗前黑素瘤患者獲得的PBMC。Survivin簇#3誘導(dǎo)IP-10的下調(diào)和IL-10的上調(diào)。然后用簇#3的單個(gè)肽孵育PBMC來(lái)鑒定該負(fù)責(zé)的肽，肽#15。IL-10的上調(diào)與IL-1b相關(guān)。圖44A和44C顯示了關(guān)于IP-10的數(shù)據(jù)，圖44B和44D顯示了關(guān)于IL-10的數(shù)據(jù)，圖44E和44G顯示了關(guān)于IL-1α的數(shù)據(jù)，和圖44F和44H顯示了關(guān)于IL-1β的數(shù)據(jù)。
圖45是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的正常健康志愿者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。從5名健康志愿者新鮮血液中分離PBMC，用survivin肽#15孵育48小時(shí)并根據(jù)本發(fā)明的方法來(lái)評(píng)價(jià)。測(cè)量培養(yǎng)物上清液中產(chǎn)生的IP-10，并以相對(duì)于其中沒(méi)有加入肽的培養(yǎng)物的值(％)給出了圖45中的數(shù)據(jù)。Survivin肽#15顯示出在全部五名志愿者中以非MHC限制方式抑制IP-10產(chǎn)生。
圖46A和46B是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。在survivin肽#15和/或活流感病毒(Charles River Laboratories，CT)存在或不存在下將黑素瘤患者的PBMC培養(yǎng)18小時(shí)。用Luminex測(cè)量IP-10(圖46A)和IL-10(圖46B)的濃度。顯示出Survinin肽#15抑制活流感病毒刺激的PBMC的IP-10產(chǎn)生。
圖47是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。在survivin肽#15或肽#16(11個(gè)氨基酸與肽#15相同)的存在下用滴定濃度的TSST-1刺激黑素瘤患者的PBMC 5天。5天后，加入滴定的胸腺嘧啶核苷(1μCi/孔)。16小時(shí)后收集平板，并通過(guò)Wallac閃爍計(jì)數(shù)器來(lái)測(cè)量結(jié)合的放射性。顯示出survivin肽#15抑制TSST-1刺激的T細(xì)胞增殖。
圖48A-48D是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。使用綴合各自mAb(Miltenyi)的微珠子來(lái)耗盡黑素瘤患者PBMC中的CD4+，CD8+，CD14+，CD56+，BDCA-4+，或BDCA-1或3+細(xì)胞。作為陰性對(duì)照，將PBMC通過(guò)沒(méi)有任何珠子的柱子(沒(méi)有消耗)。將耗盡的細(xì)胞以1M/ml重懸浮于CM中，并在survivin肽#15存在或不存在下用活流感病毒刺激。在48小時(shí)收集上清液，并用Luminex分析IL-10和IP-10水平。數(shù)據(jù)表明CD14+或CD56+細(xì)胞是肽#15誘導(dǎo)IL-10分泌必需的。
圖49A和49B是描繪了根據(jù)本發(fā)明評(píng)價(jià)的黑素瘤患者免疫應(yīng)答的圖，其允許鑒定由非T細(xì)胞引起的各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。用5μM CFSE將黑素瘤患者的PBMC染色，并用10μM survivin肽#15(圖49B)或?qū)φ针?6(圖49A)培養(yǎng)4天。用FACS分析NK群。那些CD56+細(xì)胞沒(méi)有降低CFSE的強(qiáng)度，表明它們沒(méi)有增殖(未顯示)。因此，表明肽#15維持了CD3-CD56+NK細(xì)胞的存活。
可以理解通過(guò)說(shuō)明而非限制本發(fā)明的方式顯示了在此所述的特定實(shí)施方案。本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方案中而沒(méi)有脫離本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用不多于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)將認(rèn)識(shí)到或能夠確定在此所述特定方法的各種等價(jià)物。認(rèn)為這樣的等價(jià)物在本發(fā)明范圍內(nèi)并由權(quán)利要求來(lái)涵蓋。
說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛閰⒖迹_(dá)到好像各個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)匾夂蛦为?dú)表明來(lái)引入作為參考的相同程度。
根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)就可以形成和實(shí)施在此所公開(kāi)和要求的所有組合物和/或方法。盡管根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明的組合物和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚可以將改變應(yīng)用于組合物和/或方法以及在此所述方法的步驟或連續(xù)步驟中而沒(méi)有脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體地，清楚的是化學(xué)和生理學(xué)都相關(guān)的特定試劑可以取代在此所述的試劑，同時(shí)可以獲得相同或相似的結(jié)果。認(rèn)為所有這樣本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的相似替代物和改變?cè)谒綑?quán)利要求限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
權(quán)利要求
1.鑒定個(gè)體的一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽的方法，所述方法包括下列步驟在取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的一種或多種肽的存在下培養(yǎng)個(gè)體的免疫細(xì)胞；和同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)，如特異性和對(duì)肽上抗原決定部位的細(xì)胞因子應(yīng)答，其中通過(guò)與個(gè)體HLA類(lèi)型無(wú)關(guān)的肽的免疫反應(yīng)性的存在來(lái)鑒定免疫調(diào)節(jié)肽。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括鑒定免疫調(diào)節(jié)肽的反應(yīng)性抗原決定部位。
3.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括鑒定肽特異性效應(yīng)細(xì)胞。
4.鑒定一種或多種免疫調(diào)節(jié)片段的方法，所述方法包括下列步驟從個(gè)體分離免疫細(xì)胞；在處理過(guò)的肽文庫(kù)的一個(gè)或多個(gè)片段存在下培養(yǎng)免疫細(xì)胞；和同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫特異性參數(shù)和對(duì)片段的細(xì)胞因子應(yīng)答，其中通過(guò)片段的免疫反應(yīng)性的存在來(lái)鑒定免疫調(diào)節(jié)片段。
5.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括鑒定多個(gè)肽片段特異性的效應(yīng)細(xì)胞。
6.鑒定個(gè)體對(duì)抗原物質(zhì)表達(dá)的免疫反應(yīng)性類(lèi)型的方法，包括步驟在一個(gè)或多個(gè)抗原片段的存在下分離并培養(yǎng)一種或多種個(gè)體的免疫細(xì)胞；鑒定免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子；和基于響應(yīng)抗原物質(zhì)的協(xié)同細(xì)胞因子表達(dá)來(lái)測(cè)定免疫反應(yīng)性的類(lèi)型。
7.權(quán)利要求6的方法，其中抗原物質(zhì)包括抗原、肽、微生物、細(xì)胞及其組合的混合物。
8.權(quán)利要求6的方法，其中抗原物質(zhì)包括抗原蛋白，為此蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以是已知或未知的，以及片段取自蛋白重疊肽文庫(kù)。
9.權(quán)利要求6的方法，其中抗原物質(zhì)包括多種抗原物質(zhì)。
10.測(cè)定個(gè)體免疫狀態(tài)的診斷方法，所述方法包括下列步驟從個(gè)體中分離免疫細(xì)胞，在取自目標(biāo)抗原蛋白重疊肽文庫(kù)的系列肽存在下培養(yǎng)免疫細(xì)胞，同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)來(lái)鑒定至少一種個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)分子以基于所產(chǎn)生細(xì)胞因子的鑒定來(lái)測(cè)定免疫調(diào)節(jié)分子的免疫反應(yīng)性類(lèi)型，其中免疫反應(yīng)性類(lèi)型顯示出個(gè)體的免疫狀態(tài)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中該方法測(cè)定個(gè)體免疫抑制的程度。
12.權(quán)利要求10的方法，其中該方法測(cè)定個(gè)體免疫系統(tǒng)超反應(yīng)的程度。
13.權(quán)利要求10的方法，其中對(duì)于多種免疫調(diào)節(jié)分子測(cè)定個(gè)體的免疫狀態(tài)來(lái)提供個(gè)體完整的T細(xì)胞所有組成部分。
14.權(quán)利要求10的方法，其中免疫調(diào)節(jié)分子和免疫反應(yīng)性類(lèi)型表現(xiàn)出個(gè)體免疫相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中免疫相關(guān)疾病選自傳染病、自身免疫性疾病、自體炎癥疾病、癌癥、慢性炎癥和過(guò)敏癥。
16.預(yù)測(cè)個(gè)體治療應(yīng)答的方法，所述方法包括下列步驟在取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的存在下培養(yǎng)個(gè)體的免疫細(xì)胞；分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)來(lái)鑒定至少一種個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)分子；和分析培養(yǎng)物的細(xì)胞因子產(chǎn)生以基于所產(chǎn)生細(xì)胞因子的鑒定來(lái)測(cè)定免疫調(diào)節(jié)分子的免疫反應(yīng)性類(lèi)型以測(cè)定個(gè)體在治療之前的抗原決定部位特異性的免疫狀態(tài)，作為治療結(jié)果的指示。
17.權(quán)利要求16的方法，其中治療是免疫治療如接種疫苗、被動(dòng)免疫治療和過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
18.預(yù)測(cè)個(gè)體疾病過(guò)程和臨床結(jié)果的方法，所述方法包括下列步驟在取自目標(biāo)抗原蛋白的重疊肽文庫(kù)的一系列肽存在下培養(yǎng)一種或多種個(gè)體的免疫細(xì)胞；同時(shí)分析培養(yǎng)物的細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生特征來(lái)測(cè)定免疫調(diào)節(jié)分子的免疫反應(yīng)性類(lèi)型；其中細(xì)胞因子產(chǎn)生特征是疾病嚴(yán)重程度和疾病進(jìn)展或退化狀態(tài)的標(biāo)記。
19.權(quán)利要求18的方法，其中疾病選自癌癥、腫瘤、自身免疫性疾病、自體炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、過(guò)敏癥、器官移植和骨髓移植。
20.制定個(gè)體治療干預(yù)的方法，所述方法包括下列步驟基于免疫反應(yīng)多個(gè)參數(shù)的分析來(lái)鑒定一種或多種個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)分子，包括鑒定所產(chǎn)生的細(xì)胞因子；和制備含有一種或多種免疫調(diào)節(jié)分子的抗原決定部位特異性免疫疫苗。
21.權(quán)利要求20的方法，其中疫苗包括一種或多種提高個(gè)體特定類(lèi)型免疫應(yīng)答的抗原。
22.權(quán)利要求20的方法，其中疫苗包括給藥一種或多種降低個(gè)體抗原決定部位特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生的抗原。
23.權(quán)利要求20的方法，其中疫苗包括給藥一種或多種提高個(gè)體抗原決定部位特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生的抗原。
24.權(quán)利要求20的方法，其中疫苗包括給藥一種或多種提高個(gè)體抗體產(chǎn)生的抗原。
25.權(quán)利要求20的方法，其中疫苗包括給藥一種或多種提高個(gè)體中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的抗原。
26.免疫調(diào)節(jié)個(gè)體的方法，所述方法包括下列步驟通過(guò)從個(gè)體分離免疫細(xì)胞并將它們暴露于一種或多種從肽文庫(kù)鑒定的免疫調(diào)節(jié)肽來(lái)測(cè)定個(gè)體的抗原決定部位特異性免疫狀態(tài)；用一種或多種從文庫(kù)鑒定的免疫調(diào)節(jié)肽使個(gè)體免疫；通過(guò)在暴露于一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽后從個(gè)體分離免疫細(xì)胞來(lái)測(cè)定個(gè)體的抗原決定部位特異性免疫狀態(tài)；和比較免疫之前和之后的免疫應(yīng)答類(lèi)型來(lái)測(cè)定個(gè)體抗原決定部位特異性免疫狀態(tài)的改變。
27.治療需要免疫治療的個(gè)體的方法，所述方法包括下列步驟將個(gè)體的免疫細(xì)胞暴露于一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽來(lái)測(cè)定由這一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽引發(fā)的免疫應(yīng)答類(lèi)型；用影響免疫應(yīng)答類(lèi)型的免疫調(diào)節(jié)肽來(lái)治療個(gè)體；和評(píng)價(jià)用一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽治療個(gè)體后的免疫應(yīng)答類(lèi)型，如果需要，改變一種或多種免疫調(diào)節(jié)肽來(lái)改變免疫應(yīng)答的類(lèi)型。
28.權(quán)利要求27的方法，其中治療效力的測(cè)定用于監(jiān)控疫苗治療、抗癌治療、抗腫瘤治療、器官移植、過(guò)敏癥、自身免疫性疾病的治療和傳染病的治療。
29.鑒定和表征用于免疫治療的新治療劑的方法，所述方法包括下列步驟在免疫調(diào)節(jié)劑和一種或多種取自目標(biāo)抗原蛋白重疊肽文庫(kù)的肽的存在和不存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞；同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)，如特異性和對(duì)肽上抗原決定部位的細(xì)胞因子應(yīng)答；和將免疫調(diào)節(jié)劑存在時(shí)的免疫反應(yīng)性和免疫調(diào)節(jié)劑不存在時(shí)的免疫反應(yīng)性進(jìn)行比較，其中免疫反應(yīng)性的抑制表示是免疫抑制治療劑和其中免疫反應(yīng)性的提高表示是佐劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其中治療劑是驅(qū)動(dòng)對(duì)Th1、Th2、Tc1、Tc2及其組合的免疫應(yīng)答類(lèi)型的免疫調(diào)節(jié)肽的組合。
31.通過(guò)以下方法鑒定的治療劑，該方法包括下列步驟在免疫調(diào)節(jié)劑和一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)抗原劑的片段的存在和不存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞；同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)如特異性和對(duì)片段的細(xì)胞因子應(yīng)答；和分離免疫反應(yīng)性細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中抗原劑選自傳染病、癌癥、腫瘤、自身免疫性疾病、自體炎癥疾病、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、過(guò)敏癥、器官移植和骨髓移植。
33.鑒定疫苗抗原決定部位的方法，所述方法包括下列步驟在一種或多種取自目標(biāo)抗原蛋白重疊肽文庫(kù)的肽存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞；分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)和細(xì)胞因子產(chǎn)生以基于所產(chǎn)生細(xì)胞因子的鑒定來(lái)測(cè)定對(duì)肽的免疫反應(yīng)性類(lèi)型；和用一種或多種具有相同識(shí)別序列的肽來(lái)制備疫苗。
34.權(quán)利要求33的方法，其中在分離后測(cè)定一種或多種肽的序列。
35.表征疫苗抗原決定部位的方法，所述方法包括下列步驟在一系列取自抗原劑的重疊肽文庫(kù)的肽存在下培養(yǎng)分離的免疫細(xì)胞；分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)和培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子產(chǎn)生來(lái)測(cè)定對(duì)一種或多種肽的免疫反應(yīng)性類(lèi)型，其中通過(guò)對(duì)抗原劑引發(fā)的免疫反應(yīng)來(lái)表征疫苗抗原決定部位。
36.權(quán)利要求35的方法，其中抗原劑包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物或蠕蟲(chóng)。
37.權(quán)利要求35的方法，其中抗原劑是自體抗原。
38.權(quán)利要求35的方法，其中分析細(xì)胞培養(yǎng)物并測(cè)定一種或多種T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和紅血球的特征。
39.組合物，其中含有一種或多種從對(duì)于特定個(gè)體鑒定為免疫反應(yīng)性的肽文庫(kù)分離的選擇來(lái)改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的肽，在該特定個(gè)體中已經(jīng)鑒定了對(duì)于Th1和Th2 T細(xì)胞都是反應(yīng)性的肽。
40.組合物，其中含有一種或多種從對(duì)于特定個(gè)體鑒定為免疫反應(yīng)性的肽文庫(kù)分離的選擇來(lái)改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的肽，在該特定個(gè)體中已經(jīng)鑒定了對(duì)于Tc1和Tc2 T細(xì)胞都是反應(yīng)性的肽。
全文摘要
本發(fā)明包括用于鑒定與個(gè)體HLS類(lèi)型無(wú)關(guān)的T細(xì)胞抗原決定部位的組合物和方法，通過(guò)同時(shí)分析培養(yǎng)物的多個(gè)免疫反應(yīng)性參數(shù)來(lái)鑒定至少一種抗原決定部位，其中在子集中引發(fā)目標(biāo)免疫反應(yīng)性的抗原決定部位被鑒定為關(guān)于該子集的靶向劑。
文檔編號(hào)C40B30/04GK1989410SQ200580025001
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月24日
發(fā)明者J·邦舍羅, J·E·康諾利, A·K·帕盧卡, H·厄諾 申請(qǐng)人:貝勒研究院