專利名稱：含硼酸的試劑和寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸固定化化、純化和檢測(cè)領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及將硼酸導(dǎo)入修飾的寡核苷酸和多核苷酸的試劑。
背景技術(shù)：
已知芳基硼酸(如苯基硼酸)與大范圍的具有某種必需官能度的極性分子反應(yīng)。已知存在與中性的苯基硼酸或者苯基硼酸陰離子形成的穩(wěn)定性不同的復(fù)合物(涉及1，2-二醇、1，3-醇、1，2-羥基酸、1，3-羥基酸、1，2-羥基胺、1，3-羥基胺、1，2-二酮和1，3-二酮)。固定化化的苯基硼酸已被用層析載體從不同生物樣品中選擇性地吸留那些具有必需官能度的分子種類。許多重要的生物分子包括但不限于碳水化合物、鄰苯二酚胺、前列腺素、核糖核苷和類固醇含有這些必需的官能度，并已通過這種方式被分析或純化。用苯基硼酸層析介質(zhì)來離析和分離生物分子已在一些文獻(xiàn)中討論到(見Singhal，R.P.和DeSilva，S.S.M.(1992)Adv.Chromatog.，31，293-335；Mazzeo，J.R.和Krull，I.S.(1989)Biochromatog.，4.124-130；以及Bergold，A.和Scouten，W.H.(1983)在Solid Phase Biochemistry(Scouten，W.H.ed.)pp.149-187，John Wiley和Sons，New York)。
已知在堿性水溶液中，具有順式或同軸的1，2-二醇和1，3-二醇官能度的分子種類(特別是碳水化合物)與具有苯基硼酸離子的固定化化合物絡(luò)合，形成環(huán)酯(見Lorand，J.P.和Edwards，J.O.(1959)J.Org.Chem.，24，769)。另外，已知與芳基硼酸分子結(jié)合的碳水化合物通過提高芳基硼酸與該酸中含有胺官能度的電子相互作用而引起熒光變化(見T.D.James等人，(1994)J.Chem.Soc.Comm.，477-478)。
從它們與生物分子(如生物大分子)的絡(luò)合能力來看，從芳基硼酸衍生得到的試劑能用于多種生物偶聯(lián)，包括固定化、純化和檢測(cè)。生物偶聯(lián)是一個(gè)說明性的術(shù)語，用于說明通過化學(xué)或生物的方法將兩個(gè)或多個(gè)不同的分子種類結(jié)合起來，在這些分子種類中，至少有一個(gè)種分子是生物大分子。生物偶聯(lián)包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、多糖、激素、核酸、脂質(zhì)體與細(xì)胞相互之間的結(jié)合，或者與任何其他添加有用性質(zhì)的分子種類的結(jié)合。生物大分子的固定化還被認(rèn)為是生物偶聯(lián)的一種特例，在這種情況下，大分子被可逆的或不可逆的結(jié)合到不溶的載體上。生物偶聯(lián)被廣泛地應(yīng)用在生物化學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)研究中。生物偶聯(lián)的主要應(yīng)用包括但不限于基因探針的檢測(cè)、酶聯(lián)免疫固相檢測(cè)(ELISA)、單克隆抗體藥物導(dǎo)向和醫(yī)學(xué)成像(imaging)。
在大多數(shù)例子中，生物偶聯(lián)是基于將兩種結(jié)合配偶體(partner)結(jié)合成對(duì)的已知反應(yīng)。生物偶聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)例子涉及第一結(jié)合配偶體(如鄰位取代的乙酰氨基苯基硼酸)和第二配偶體(如與糖蛋白質(zhì)連接的碳水化合物殘基的鄰位二醇部分)的反應(yīng)(見Cai，S.X.和Keana，J.F.W.(1991)Bioconjugate Chem.，2，317-322)。
另外，由3-異硫氰酸基苯基硼酸衍生得到的苯基硼酸生物偶聯(lián)物已被成功地用來將放射性的二肟锝復(fù)合物掛接到用于醫(yī)學(xué)成像的單克隆抗體中(見Linder，K.E.，Wen，M.D.，Nowotnik，D.P.，Malley，M.F.，Gougoutas，J.Z.，Nunn，A.D.和Eckelman，W.C.(1991)Bioconjugate Chem.，2，160-170；Linder，K.E.、，Wen，M.D.，Nowotnik，D.P.，Ramalingam，K.，Sharkey，R.M.，Yost，F(xiàn).，Narra，R.K.和Echelman，W.C.(1991)Bioconjugate Chem.，2，407-414)。
而且，當(dāng)用來與最新發(fā)展的從水楊基異羥肟酸(SHA)和2，6-二羥基苯基異羥肟酸(DHBHA)衍生得到的硼酸絡(luò)合試劑結(jié)合使用時(shí)，硼酸試劑作為生物結(jié)合試劑具有廣泛的應(yīng)用。硼酸試劑、硼酸絡(luò)合試劑、它們的結(jié)合物與生物偶聯(lián)物，以及它們的制備和使用方法已在美國(guó)專利第5594111、5623055、5668258、5648470、5594151、5668257、5677431、5688928、5744627、5777148、5831045和5831046號(hào)中公開了。
從芳基硼酸在生物偶聯(lián)反應(yīng)中的使用看，在本領(lǐng)域中所需要的是能夠摻入合成的寡核苷酸中的硼酸化合物，如在自動(dòng)固相合成過程中那樣。由此得到的硼酸修飾的寡核苷酸將能用于生物偶聯(lián)反應(yīng)，如生物大分子的固定化、純化和檢測(cè)。本發(fā)明能滿足這些和其他的要求。

發(fā)明內(nèi)容
從芳基硼酸衍生得到的試劑由于它們能與生物大分子結(jié)合而能用于多種生物偶聯(lián)應(yīng)用。本發(fā)明擴(kuò)展了能得到的硼酸試劑的應(yīng)用，并包括用于制備硼酸修飾的合成寡核苷酸的試劑。這樣，一方面，本發(fā)明涉及具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物 式I中，R1是官能基團(tuán)，它包括但不限于芳基硼酸酯部分，如苯基硼酸酯。式I中的Y是官能基團(tuán)，它包括但不限于O(CH2)m、S(CH2)m和C-C單鍵，其中m大約為1-5的整數(shù)。如本文所用，當(dāng)Y是C-C單鍵時(shí)，R1直接與羰基連接。式I中的Z是官能基團(tuán)，它包括但不限于具有1-16個(gè)碳原子的亞烷基、亞烷基酰氨基、亞烷基酰氨基亞烷基和亞烷基酰氨基亞烷基酰氨基。式I中的X是官能基團(tuán)，它包括但不限于亞甲基基團(tuán)和C-C單鍵。當(dāng)X是C-C單鍵時(shí)，式I的次甲基碳直接與OR3連接。式I中的R2是官能基團(tuán)，它包括但不限于氫、三苯甲基、單甲氧三苯甲基和二甲氧三苯甲基。式I中的R3是官能基團(tuán)，它包括但不限于氫或活化的含磷基團(tuán)。
式I的芳基硼酸化合物在自動(dòng)固相合成過程中可用于寡核苷酸的合成。由此得到的寡核苷酸能用在許多的生物偶聯(lián)反應(yīng)中，如用來固定化、純化和檢測(cè)核酸。能夠合成將式I化合物掛接到寡核苷酸或多核苷酸的3′或5′端的寡核苷酸。
這樣，另一方面本發(fā)明提供了具有5′端修飾的寡核苷酸，該寡核苷酸具有下列通式 在式II中，R是官能基團(tuán)，它包括但不限于芳基硼酸部分，如苯基硼酸。式II中的Y是官能基團(tuán)，它包括但不限于O(CH2)m、S(CH2)m和C-C單鍵，其中m大約為1-5的整數(shù)。式II中的Z是官能基團(tuán)，它包括但不限于具有1-16個(gè)碳原子的亞烷基、亞烷基酰氨基、亞烷基酰氨基亞烷基和亞烷基酰氨基亞烷基酰氨基。式II中的X是官能基團(tuán)，它包括但不限于亞甲基和C-C單鍵。式II中的R6是官能基團(tuán)，它包括但不限于氫和羥基。式II中的R7是官能基團(tuán)，它包括但不限于羥基和單磷酸酯。式II中的指數(shù)n是大約0-10的整數(shù)。式II中的指數(shù)n′是大約10-10000的整數(shù)。式II中的Nu′和Nu″分別選自核苷堿，它包括但不限于腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸類似物。對(duì)任何給定的單體值n，可變量R、Y和X可以是相同的或不同的。任何給定的單體值n′，可變量R6和Nu′可以是相同或不同的。
另一方面，本發(fā)明提供具有3′端修飾并具有下面通式的寡核苷酸 式III中，R是官能基團(tuán)，它包括但不限于芳基硼酸部分，如苯基硼酸。式III中的Y是官能基團(tuán)，它包括但不限于O(CH2)m、S(CH2)m和C-C單鍵，其中m是大約1-5的整數(shù)。式III中的Z是官能基團(tuán)，它包括但不限于具有1-16個(gè)碳原子的亞烷基、亞烷基酰氨基、亞烷基酰氨基亞烷基和亞烷基酰氨基亞烷基酰氨基。式III中的X是官能基團(tuán)，它包括但不限于亞甲基基團(tuán)和C-C單鍵。式III中的R6是官能基團(tuán)，它包括但不限于氫和羥基。式III中的R7是官能基團(tuán)，它包括但不限于羥基和單磷酸酯。式III中的指數(shù)n是大約0-10的整數(shù)。式III中的指數(shù)n′是大約10-10000的整數(shù)。式III中的Nu′和Nu″分別選自核苷堿，它包括但不限于腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸類似物。對(duì)于任何給定的單體值n，可變量R、Y和X可以是相同的或不同的。對(duì)于任何給定的單體值n′，可變量R6和Nu′可以是相同或不同的。
當(dāng)閱讀下面詳細(xì)的描述時(shí)，本發(fā)明的這些與其他方面將更易于理解。
附圖的簡(jiǎn)短說明

圖1總結(jié)了制備本發(fā)明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-(β-丙氨?；?氨基-1，2-丙二醇的合成方法。
圖2總結(jié)了制備本發(fā)明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-N-[(4-二羥基-硼烷基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨?；鵠氨基-1，2-丙二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的合成方法。
圖3總結(jié)了制備本發(fā)明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-β-丙氨酰絲氨醇的合成方法。
圖4總結(jié)了制備本發(fā)明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基-硼烷基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨?；鵠絲氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的合成方法。
圖5總結(jié)了制備本發(fā)明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(3，5-二-二羥基硼基(四甲基乙二醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙酰氨基]絲氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的合成方法。
圖6總結(jié)了制備本發(fā)明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-氨基-1，3-辛二醇的合成方法。
圖7總結(jié)了制備本發(fā)明化合物1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[(4-二羥基-硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酰基]氨基-1，3-辛二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的合成方法。
圖8闡述了自動(dòng)合成的在5′端有1，2，3和4個(gè)芳基硼酸部分的四個(gè)硼酸修飾的寡核苷酸的高效液相層析純化。
本發(fā)明的詳細(xì)描述和最佳實(shí)施例I.術(shù)語表本文所用的“烷基”是指直鏈或支鏈的烴鏈，如甲基、乙基、異丙基、n-丙基、n-丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、十八烷基和2-甲基戊基。這些基團(tuán)可任選地被一個(gè)或多個(gè)通常與這些烷基連接的官能基團(tuán)所取代，如被羥基、溴、氟、氯、碘、巰基或含硫基、氰基、烷硫基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、羧基、烷酯基、烷基、鏈烯基、硝基、氨基、烷氧基、酰氨基等取代，形成烷基基團(tuán)如三氟甲基、3-羥己基、2-羧基丙基、2-氟乙基、羧甲基、氰丁基等等。
“亞烷基”指上述具有1-20個(gè)碳原子的二價(jià)烷基基團(tuán)，如亞甲基(-CH2-)、亞丙基(-CH2CH2CH2-)、氯亞乙基(-CHClCH2-)、2-巰基亞丁基(-CH2CH(SH)CH2CH2-)、1-溴-3-羥基-4-甲基亞戊基(-CHBrCH2CH(OH)CH(CH3)CH2-)，較佳的是具有1-16個(gè)碳原子。
“亞烷基酰氨基”指-(CH2)nNC(O)基團(tuán)或-(CH2)nC(O)N基團(tuán)，其中n大約是1-20，較佳是大約1-16。
“亞烷基酰氨基亞烷基”指-(CH2)nNC(O)(CH2)n基團(tuán)或-(CH2)nC(O)N(CH2)n基團(tuán)，其中n大約是1-20，較佳是大約1-16。
“亞烷基酰氨基亞烷基酰氨基”指(CH2)nNC(O)(CH2)nNC(O)基團(tuán)或-(CH2)nC(O)N(CH2)nC(O)N基團(tuán)或(CH2)nNC(O)(CH2)nC(O)N基團(tuán)或-(CH2)nC(O)N(CH2)nNC(O)基團(tuán)，其中，n大約是1-20，較佳大約是1-16。
“芳基”指形成至少一個(gè)芳香環(huán)的碳原子鏈，較佳的是具有大約6-14個(gè)碳原子，如苯基、萘基等等；它們可能被一個(gè)或多個(gè)通常與其連接的官能基團(tuán)取代，如被羥基、溴、氟、氯、碘、巰基或含硫基、氰基、-氰基酰氨基、烷硫基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、羧基、烷酯基、烷基、鏈烯基、硝基、氨基、烷氧基、酰氧基等取代，形成如聯(lián)苯基、碘代聯(lián)苯基、甲氧基聯(lián)苯基、蒽基、溴苯基、碘苯基、氯苯基、羥基苯基、甲氧基苯基、甲?；交?、乙?；交?、三氟甲硫基苯基、三氟甲氧基苯基、烷硫基苯基、三烷基銨基苯基、酰氨基苯基、噻唑基苯基、噁唑基苯基、咪唑基苯基、咪唑基甲基苯基等的基團(tuán)。
“?；敝?C(OR)基團(tuán)，其中，R是上述的烷基或芳基，如甲酰基、乙?；?、丙?；蚨□；?。
“烷氧基”指-OR，其中，R是烷基。
“酰氨基”指酰胺鍵-C(O)NR-，其中，R是氫或烷基。
“氨基”指胺鍵-NR-，其中，R是氫或烷基。
本文所用的“核苷酸單體”是指“標(biāo)準(zhǔn)”的核苷酸，即腺苷、鳥苷、胞啶、胸苷和尿嘧啶以及這些核苷酸的衍生物。這些衍生物包括但不限于次黃苷、5-溴脫氧胞嘧啶、5-溴-脫氧尿苷、N6-甲基-脫氧腺苷、5-甲基-脫氧胞嘧啶等。
本文所用的“保護(hù)基團(tuán)”是指被聯(lián)到分子上或者取代分子上活性基團(tuán)(如羥基或胺)的基團(tuán)。選用保護(hù)基團(tuán)來防止化學(xué)反應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)步驟期間特殊的原子團(tuán)的反應(yīng)。一般情況下，選用特殊的保護(hù)基團(tuán)，以便可以進(jìn)行稍后的去除以恢復(fù)活性基團(tuán)，且不改變分子中的其他活性基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)的選擇由被保護(hù)基團(tuán)和將與該保護(hù)基團(tuán)接觸的化合物決定。保護(hù)性基團(tuán)的選擇在本領(lǐng)域那些技術(shù)中是熟知的(見，如Greene等人，Protective Groups in OrganicSynthesis，2nd ed，John Wiley & Sons，Inc.Somerset，N.J.(1991))。II.化合物在某些方面，本發(fā)明提供了新穎的芳基硼酸衍生物，它能作為試劑用于多核苷酸和寡核苷酸的合成，后者又能用于生物偶聯(lián)反應(yīng)。將這些芳基硼酸試劑摻入寡核苷酸，將使該寡核苷酸能參與生物偶聯(lián)反應(yīng)，該生物偶聯(lián)反應(yīng)包括但不限于生物分子如蛋白質(zhì)、肽、多糖、激素、核酸、脂質(zhì)體和細(xì)胞的結(jié)合。
這樣，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有式I通式的化合物 其中，R1、Y、Z、X、R2和R3如前所述。
式I化合物是能用如在高重復(fù)率(repetitive efficiency)的自動(dòng)固相寡核苷酸合成中。在某些較佳實(shí)施例中，使用高反應(yīng)性的活化的含磷部分和易于被去除的保護(hù)基團(tuán)。在某些較佳實(shí)施例中，R1是苯基硼酸酯。某些較佳的苯基硼酸酯基團(tuán)包括但不限于下列基團(tuán) 其中，R4和R5是官能基團(tuán)，它們包括但不限于氫、甲基和苯基。Q是官能基團(tuán)，它包括但不限于亞甲基基團(tuán)和C-C單鍵。本文所用的Q是C-C單鍵，Q兩邊的碳原子直接相互連接。
R3是官能基團(tuán)，它包括但不限于氫；以及R3是活化的含磷基團(tuán)，它包括但不限于氨基亞磷酸酯、H-膦酸酯、甲基膦酸酯、硫代磷酯(phosphorothioate)、半琥珀酸酯、與固相載體共價(jià)連接的半琥珀酸酯、環(huán)己基碳二亞胺和與固相載體共價(jià)連接的環(huán)己基碳二亞胺。R3較佳是氨基亞磷酸酯。
Z是具有大約1-16個(gè)碳原子任選被酰氨基任意打斷的碳的間隔基。另外，Z能以酰氨基的開始或結(jié)尾出現(xiàn)。較佳的是，Z是C1-C5亞烷基基團(tuán)或C1-C5亞烷基酰氨基基團(tuán)。
在某些較佳實(shí)施例中，X是亞甲基，R2是二甲氧基三苯甲基，如如O-(4，4′二甲氧基三苯甲基)。R3較佳是氨基亞磷酸酯基團(tuán)，如O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯基團(tuán)。式I較佳的化合物是1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基-硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨?；鵠絲氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯。
本發(fā)明化合物能在脫氧核苷酸和核苷酸合成中在合成的寡核苷酸的任何位置導(dǎo)入芳基硼酸基團(tuán)(如苯基硼酸或苯基二硼酸基團(tuán))。在較佳實(shí)施例中，寡核苷酸或多核苷酸的5′端或3′端被修飾。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，式I化合物被用來將苯基硼酸或苯基二硼酸基團(tuán)導(dǎo)入合成的寡核苷酸的5′末端。
這樣，在另外一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有通式II結(jié)構(gòu)的化合物 其中，R、Y、Z、X、R6、R7、n、n′、Nu′和Nu″如前所述。而且，對(duì)于任何給定的單體值n，可變量R、Y和X可以是相同或不同的。另外，對(duì)于任何給定的單體值n′，可變量R6和Nu′可以是相同或不同的。
在某些較佳的實(shí)施例中，式II中的R是苯基硼酸基團(tuán)。合適的苯基硼酸基團(tuán)包括但不限于 在其他某些方面，式I化合物被用來將芳基硼酸(如苯基硼酸或苯基二硼酸基團(tuán))導(dǎo)入合成的寡核苷酸或多核苷酸的3′末端。這樣，在另一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有通式III的化合物 其中，R、Y、Z、X、R6、R7、n、n′、Nu′和Nu″如前所述。而且，對(duì)于任何給定的單體值n，可變量R、Y和X可以是相同或不同的。另外，對(duì)于任何給定的單體值n′，可變量R6和Nu′可以是相同或不同的。式III中的R較佳的是苯基硼酸基團(tuán)。較佳的苯基硼酸基團(tuán)在上面有關(guān)式II的說明中已提出。III.合成關(guān)于式I的各種化合物的描述在圖1-7中闡明，另外，在下面的實(shí)施例1-3中也作了詳細(xì)的描述。一般的合成策略如下。結(jié)合圖1-2或3-5，被保護(hù)的包含脂肪族氨基的1，2-或1，3二醇各自與保護(hù)的芳基硼酸(如苯基硼酸)的羧酸衍生物的活化形式(如N-羥基琥珀酸酰亞胺酯或?；溥?imidazolide)反應(yīng))。含胺的1，2-或1，3二醇的1-羥基被酸不穩(wěn)定性基團(tuán)(如4，4′-二甲氧基三苯甲基)保護(hù)。用另一個(gè)1，2-或1，3-二醇(如1，3-丙二醇、四甲基二醇或苯頻那醇)保護(hù)苯基硼酸，以形成環(huán)二酯。然后將得到的產(chǎn)品與活化的膦(如2-氰乙基N，N-二異丙基氨基氯化膦)反應(yīng)，得到用于寡核苷酸合成的最終活性反應(yīng)材料。
用于制備式I化合物合成中間物的芳基硼酸(如苯基硼酸)通常通過從芳基鹵產(chǎn)生芳基鎂或芳基鋰，隨后與三烷氧基硼酸酯的轉(zhuǎn)金屬作用而就地制備(見Todd，M.H.等人(1997)Tetrahedron Lett.，38，6781-6784；Crisofoli，W.A.等人，(1991)Tetrahedron Lett.，32，5881-5884；Sharp，M.J.等人，(1987)TetrahedronLett.，28，5093-5096；以及Larson，R.D.等人，(1994)J.Org.Chem.，59，6391-6394)。
另外，已發(fā)展出過渡金屬催化及交叉偶聯(lián)反應(yīng)來從芳基鹵和烷氧基二硼(見Ishiyama，T.等人，(1995)Org.Chem.，60，7508-7510；Giroux，A.等人，(1997)Tetrahedron Lett.，38，3941-3844)或者二甲氧基氫硼烷(見Murata，M.等人，J.Org.Chem.，1997，62，6458-6459)生產(chǎn)苯基硼酸，這些反應(yīng)用PdCl2(dppf)作為催化劑。用作式I化合物制備的合成中間物的苯基二硼酸是1998年8月21日申請(qǐng)的09/138105(未授權(quán))文中的主題。
式I化合物一旦產(chǎn)生出來，就能它用來生產(chǎn)式II和式III的化合物，這些能用本領(lǐng)域熟知的自動(dòng)固相合成技術(shù)來生產(chǎn)。例如，自動(dòng)固相寡核苷酸合成的化學(xué)，包括包含有一個(gè)或多個(gè)非天然修飾的寡核苷酸(如由式I化合物)在下面的評(píng)論文章和參考書中被描述到Crockett，G.C.(1982)“The ChemicalSynthesis of DNA”，Aldrichimica Acta 16(3)，47-55；Engles，J.W.和Uhlmann，E.(1989)“Gene Synthesis”，Angew Chem.Int.Ed.Engl.28，716-734；Goodchild，J.(1990)“Conjugates of Oligonucleotides and Modified OligonucleotidesA Reviewof Their Synthesis and Properties”，Bioconjugate Chem.1(3)，165-187；Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(1984)M.J.Gait ed(IRL PressLimitedOxford，England)，217pp.。
在固相合成中，式I化合物所需的加料時(shí)間和它們的濃度將會(huì)與用在市售DNA合成儀中的市售未修飾氨基亞磷酸酯的通常方案相同。只需將含有式I化合物的溶液加到市售的合成儀上為額外的氨基亞磷酸酯提供的容器端口(如394型，Applied Biosystem，F(xiàn)oster City，California，USA)。但是，當(dāng)式I具體的化合物的偶聯(lián)效率顯著低于其他的氨基亞磷酸酯時(shí)，可能有必要修改式I化合物的加料時(shí)間和濃度，以使該合成最優(yōu)化。最優(yōu)化寡核苷酸合成方案以糾正過低的偶聯(lián)效率的方法在本領(lǐng)域那些技術(shù)中是周知的。一般情況下，僅需增加加入的試劑的濃度或試劑的量以實(shí)現(xiàn)較高的偶聯(lián)效率。偶聯(lián)效率的測(cè)定方法也是周知的。例如，當(dāng)R2是二甲氧基三苯甲基(DMT)時(shí)，通過測(cè)量酸處理步驟(該步驟去除DMT基團(tuán))的DMT陽離子濃度能測(cè)定偶聯(lián)效率。通常通過分光光度計(jì)監(jiān)控酸洗液測(cè)定DMT陽離子濃度。酸/DMT溶液是亮橙色的?；蛘?，既然封堵劑(capping)阻止寡核苷酸進(jìn)一步擴(kuò)展(在此偶聯(lián)失敗)，用如毛細(xì)電泳或HPLC分析，比較截?cái)嗟墓押塑账崤c全長(zhǎng)的寡核苷酸的比例，可以估計(jì)偶聯(lián)效率。
固相寡核苷酸合成可用許多種載體進(jìn)行。合適的載體是那種能對(duì)將成為合成的寡核苷酸的3′末端堿基的被保護(hù)單體提供進(jìn)行連接的官能基團(tuán)。對(duì)在具體的合成化學(xué)中使用的試劑，載體應(yīng)是惰性的。適合的載體在本領(lǐng)域那些技術(shù)中是周知的。固相載體材料包括但不限于聚丙烯酰嗎啉、二氧化硅、受控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯、聚苯乙烯/膠乳和羧基修飾的聚四氟乙烯。較佳的載體是氨基-官能化的受控多孔玻璃和羧基官能化的聚四氟乙烯。
作為起點(diǎn)，固相寡核苷酸合成需要偶聯(lián)在固相載體上的全保護(hù)的單體(如保護(hù)的核苷)。這種連接通常是通過3′-羥基基(當(dāng)偶聯(lián)時(shí)為氧代)與連接及共價(jià)結(jié)合，該連接基又與固相載體共價(jià)結(jié)合。第一合成循環(huán)通過縮合反應(yīng)經(jīng)由核苷酸單體的3′-磷酸酯將其連接到已結(jié)合的核苷的5′-羥基上，得到3′-5′磷酸二酯鍵。接下來的合成循環(huán)是將核苷酸單體加入在最后結(jié)合的核苷酸的5′-羥基上。這樣，寡核苷酸以從3′到5′位的方向合成，得到一個(gè)其3′端連接在固相載體上的“增長(zhǎng)”的寡核苷酸。
雖然通過琥珀酸酯或半琥珀酸酯將單體共價(jià)連接到受控多孔玻璃上是較佳的，但本領(lǐng)域有大量的這些技術(shù)可用來將核苷單體連接到固相載體上。常規(guī)的通過半琥珀酸酯被連接到受控多孔玻璃的受保護(hù)的核苷可以從市場(chǎng)上許多來源得到的(如Glen Reseach，Sterling，Vermont，USA；Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，USA；Pharmacia LKB，Piscataway，New Jersey，USA)。
將式I化合物連到寡核苷酸的3′端需要用連接到固相載體上全封閉(blocked)的式I化合物啟動(dòng)寡核苷酸的合成。用多種不同的活性基團(tuán)官能化的受控多孔玻璃可由市售得到(如Sigma Chemial，St.Louis，Missoui，USA)。在Atkinson等人的Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(Gait，ed.IRLPress，Washington，D.C.，1984)文中第三章描述了連接的方案。三異丙基苯磺酰氯、三異丙基苯磺酰咪唑、三異丙基苯磺酰三唑烷(triazolide)或甚至是三異丙基苯磺酰四唑烷(tetrazolide)也能用作縮合劑。二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和結(jié)構(gòu)類似物也適合作連接劑。其他連接劑和適當(dāng)?shù)目s合劑在本領(lǐng)域技術(shù)中是熟知的。
一旦合成了全長(zhǎng)的寡核苷酸，保護(hù)基團(tuán)被去除(該寡核苷酸被去保護(hù))，然后在使用之前將該寡核苷酸從固相載體上切下。切下和去保護(hù)可以同時(shí)發(fā)生，或者按任意順序依次發(fā)生。這兩個(gè)步驟能分開(intersperse)進(jìn)行，這樣一些保護(hù)基團(tuán)在從固相載體上切下之前從寡核苷酸中去除，其他的基團(tuán)可在溶液中從切下的寡核苷酸上去除。這些事件的次序取決于所存在的具體的封閉基團(tuán)、與固相載體的具體的連接方式，以及進(jìn)行該合成的個(gè)人喜好。當(dāng)在切下之前進(jìn)行去保護(hù)時(shí)，保護(hù)基團(tuán)能從仍保持與固相載體的連接的寡核苷酸中洗掉。相反，當(dāng)去保護(hù)在切下之后進(jìn)行時(shí)，去除的保護(hù)基團(tuán)將與寡核苷酸一起保留在溶液中。通常要求寡核苷酸在使用之前從保護(hù)性的基團(tuán)中分離出來。
本發(fā)明的寡核苷酸并不限于短的單鏈序列。技術(shù)人員應(yīng)該知道，雖然寡核苷酸合成通常有大約1000個(gè)堿基的上限，較佳的是大約100個(gè)堿基，但許多寡核苷酸能連接在一起形成更長(zhǎng)的序列。另外，具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸能雜交形成雙鏈分子。寡核苷酸的雜交和連接以形成更長(zhǎng)的雙鏈分子的方法在本領(lǐng)域那些技術(shù)中是熟知的(見，如Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，1985)。IV.生物偶聯(lián)物如上面所述，式I的芳基硼酸可以使用自動(dòng)固相合成摻入合成的寡核苷酸中，從而得到式II和III的化合物。由此而得到的修飾寡核苷酸能用于生物偶聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)包括但不限于大分子(如核酸)的固定化、純化和檢測(cè)。
當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)種類的分子通過化學(xué)的或生物的方法結(jié)合時(shí)，發(fā)生了生物偶聯(lián)。在大多數(shù)情況下，生物偶聯(lián)是基于已知的兩個(gè)配偶體之間的配對(duì)反應(yīng)的。例如，生物偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在抗原和結(jié)合蛋白質(zhì)(如抗體)之間。生物偶聯(lián)反應(yīng)包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、多糖、激素、核酸、脂質(zhì)體與細(xì)胞相互之間的結(jié)合，或者與任何其他添加有用性質(zhì)的分子種類的結(jié)合。本發(fā)明的修飾寡核苷酸和多核苷酸尤其可用作第一結(jié)合配偶體，與作為第二配偶體的核酸產(chǎn)生相應(yīng)的生物偶聯(lián)，以進(jìn)行相應(yīng)的固定化、純化和檢測(cè)。
使用簡(jiǎn)短的符號(hào)來闡明生物偶聯(lián)，第一結(jié)合配偶體是式II或III的化合物，它由下圖表示 在此圖中，“寡核苷酸”表示式II或III的寡核苷酸，它大約具有10-10000個(gè)堿基的長(zhǎng)度，并且在3′末端或5′末端有大約1-10個(gè)芳基硼酸基團(tuán)，其中基團(tuán)B′是H或B(OH)2基團(tuán)。
在這個(gè)說明性的例子中，第二結(jié)合配偶體是一個(gè)從2-羥基苯基異羥肟酸(水楊基異羥肟酸)衍生得到的分子，它已掛接到結(jié)合物上。合適的結(jié)合物包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、多糖、激素、核酸、脂質(zhì)體、細(xì)胞和熒光標(biāo)記物。第二結(jié)合配偶體可有下圖描述 在式IV中，X是官能基團(tuán)，它包括但不限于OH、NH2、NHR′、NHOH和NHOR′，其中，R′是官能基團(tuán)，它包括但不限于CH3、CH2CH3、CH2CN、CH2COOH、CH2CONH2和CH2OCH3。Y是官能基團(tuán)，它包括但不限于O、S、和NH，較佳的是O。
式IV化合物及其制備方法在美國(guó)專利第5594111、5594151、5623055、5648470、5668257、5668258、5677431、5688928和5744627，以及懸而未決的1995年7月7日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列第08/488193號(hào)、1995年7月22日申請(qǐng)的第08/577068號(hào)、1996年8月7日申請(qǐng)的第08/689341號(hào)、1997年10月22日申請(qǐng)的第08/925195號(hào)和1997年10月22日申請(qǐng)的第08/956204號(hào)中描述到。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，作為第一結(jié)合配偶體的式II或III的寡核苷酸或多核苷酸，與作為第二配偶體的式IV結(jié)合物之間的生物偶聯(lián)，將產(chǎn)生如式V的生物偶聯(lián)物 其中，X2是O、NH、NR′、NOH和NOR′，其中R′如前所述。
用式II或III化合物作為第一結(jié)合配偶體、式VI化合物為第二配偶體的生物偶聯(lián)也能產(chǎn)生 式VI化合物及其制備方法在美國(guó)專利第5777148和5837878號(hào)，以及懸而未決的1997年10月22日申請(qǐng)的美國(guó)專利系列第08/956194號(hào)、1997年10月22日申請(qǐng)的第09/956196號(hào)中描述到，本文用其內(nèi)容作為參考。由此得到的生物偶聯(lián)物可用式VII表示 式VI和VII生物偶聯(lián)物能在緩沖的水溶液或有機(jī)溶劑中制備。該生物偶聯(lián)物在約4-70℃下在幾分鐘內(nèi)形成。該生物偶聯(lián)物在給定pH和溫度的水溶液中的穩(wěn)定性顯著地受X2基團(tuán)和Y基團(tuán)的影響。例如，式VI的生物偶聯(lián)物(其中X是NOH，Y是O)在pH約大于4.5小于12.5的水溶液中是穩(wěn)定的。但是，式VII的生物偶聯(lián)物(其中X是NOH，Y是O)在pH約大于2.5小于12.5的水溶液中是穩(wěn)定的。這樣，當(dāng)在低pH的緩沖水溶液中工作時(shí)，用式VII的生物偶聯(lián)物較佳。
每一個(gè)結(jié)合配偶體之間的生物偶聯(lián)反應(yīng)(硼酸絡(luò)合反應(yīng))對(duì)離子強(qiáng)度的顯著改變、有機(jī)溶劑的存在、去垢劑的存在、離液序列試劑(蛋白質(zhì)變性劑)的存在不敏感，而這些因素與現(xiàn)有的間接標(biāo)記系統(tǒng)是不相容的，在該系統(tǒng)中，必須維持生物大分子的結(jié)構(gòu)以保存所需的結(jié)合特性。在大多數(shù)情況下，通過這里所描述的系統(tǒng)將控制生物偶聯(lián)物的形成的約束條件限于那些被維持生物活性種類的生存能力(天然的構(gòu)象)所需的條件所給予的情況。
本發(fā)明將通過實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的描述。下面的實(shí)施例是用作說明性的目的，而不是對(duì)本發(fā)明作的任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地知道大多數(shù)非臨界參數(shù)能被改變和修改，得到主要相同的結(jié)果。V.實(shí)施例實(shí)施例1這個(gè)實(shí)施例描述1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)-苯甲?；鵠氨基-1，3-辛烷二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基氨基亞磷酸酯的制備。 A.4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸的合成將4-羧基苯基硼酸(10.0g，60.2mmol)溶于熱的無水1，4-二噁烷(150mL)中，用少量的活性炭處理后，在該溶液仍是熱的情況下用0.5μm的玻璃纖維過濾器過濾。將濾液加熱回流，加入苯頻哪醇(22.1g，60.3mmol)。將該溶液回流1小時(shí)，然后冷卻至室溫。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除溶劑得到白色固體，在-20℃從乙醚/己烷中結(jié)晶過夜。將該固體過濾并在真空中干燥，得到23.3g(得率為78％)的產(chǎn)品。通過1H和13C核磁共振(NMR)光譜測(cè)定法和高相液壓層析(HPLC)確定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.23(寬單峰，1H，CO2H)，8.19(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.13(雙峰，2H，ArH)，7.10(多重峰，20H，ArH，[苯頻哪醇])。13CNMR(75MHz，DMSO-D6)δ167.4，141.9，135.4，129.2，128.2，127.6，127.4，126.2，96.3。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，用0-100％乙腈過柱15分鐘，測(cè)定260nm的吸收值)保留時(shí)間＝14.9±0.1分鐘。B.4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸NHS酯的合成將4-二二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸(17.4g，35.0mmol)溶在無水四氫呋喃(100mL)中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(4.0g，34.8mmol)，然后加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(7.2g，34.6mmol)。在室溫下攪拌過夜，在此期間形成白色的1，3-二環(huán)己基脲沉淀。用過濾器過濾該固體，并用少量四氫呋喃洗滌。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干合并的濾液，得到灰白色固體。用四氫呋喃(100mL)溶解該固體，然后過濾，再加入300mL的己烷。在-20℃過夜結(jié)晶。過濾得到該固體，并在真空中干燥，得到18.4g(得率為89％)的產(chǎn)品。用1H和13C測(cè)定產(chǎn)品純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-D6)δ8.31(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.25(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，7.15(多重峰，20H，ArH[苯頻哪醇])，2.91(單峰，4H，CH2)。13CNMR(75MHz，DMSO-D6)δ170.4，161.9，141.7，136.0，129.7，128.2，127.6，127.4，126.2，96.5，25.5。C.8-[N-(芐氧基羰基)氨基]-3-氧代辛酸甲酯將6-[N-(芐氧基羰基)氨基]己酸(25.0g，94.0mmol)和2，2-二甲基-1，3-二氧雜環(huán)己烷-4，6-二酮(13.6g，94.0mmol)溶解在無水二氯甲烷(500mL)中。加入三乙胺(35mL，255mmol)，然后在干燥的氮?dú)庵性谑覝叵聰嚢柙摲磻?yīng)混合物。加入二乙基氰基膦酸酯(15.4mL，94.0mmol)，該溶液迅速變成黃色。攪拌過夜之后，小心地用1M鹽酸水溶液(200mL)洗滌該溶液兩次，用水(200mL)洗三次，用飽和氯化鈉溶液(200mL)洗一次。用無水硫酸鎂干燥該溶液，然后過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮成厚的橙色漿狀物。用500mL純甲醇溶解該物質(zhì)，然后在氮?dú)庵谢亓?小時(shí)。冷卻該溶液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除該溶劑。剩余物用乙酸乙酯∶己烷(1∶1，v/v，50mL)溶解，并等分成10mL一份通過制備性的HPLC(Waters PrepLC 2000系統(tǒng))在Porasil二氧化硅柱(47mm×300mm；Waters)上純化。流速是50mL/分鐘。使用以下的梯度50∶50(v/v)的乙酸乙酯∶己烷22分鐘，然后用100％乙酸乙酯18分鐘，接著用100％的甲醇20分鐘。測(cè)定洗脫液270nm的吸收值；該產(chǎn)物洗脫在第一個(gè)主峰中。合并產(chǎn)物部分并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到一澄清的淡黃色的漿狀物，將該漿狀物在4℃貯存中固化，得到27.7g(得率為92％)的產(chǎn)物。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-D6)δ7.33(多重峰，5H，ArH)，7.23(三重峰，1H，NH)，5.00(單峰，2H，ArCH2O)，3.60(單峰，3H，OCH3)，3.58(單峰，2H，[C＝O]CH2[C＝O])，2.97(四重峰，2H，NHCH2CH2)，2.49(三重峰，2H，CH2CH2[C＝O])，1.40(多重峰，4H，NHCH2CH2和CH2CH2[C＝O])，1.20(多重峰，2H，CH2CH2CH2).13C NMR(75MHz，DMSO-D6)δ203.6，168.0，156.3，137.5，128.4，65.2，51.7，48.5，42.1，40.1，29.2，25.6，22.5。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝13.1±0.1分鐘。C.8-[N-芐氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇的合成用無水四氫呋喃(125mL)溶解甲基8-[N-(芐氧基羰基)氨基]-3-氧代辛酸甲酯(26.0g，80.9mmol)。在氮?dú)庵袑⒃撊芤郝丶拥嚼涞?冰浴)硼氫化鋰(6.1g，279.8mmol)的無水四氫呋喃(250mL)溶液中。滴加結(jié)束后，將反應(yīng)混合物溫?zé)岬绞覝夭嚢柽^夜。之后在冰浴中將該混合物冷卻，然后慢慢地滴加到300mL1M鹽酸水溶液。加完鹽酸并且泡沫停止后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該混合物濃縮以去除大部分的四氫呋喃。將250mL氯仿加到剩余物中(水和產(chǎn)物)，充分地?fù)u動(dòng)該混合物，使其分層。用額外的250mL氯仿抽提水層。然后用飽和氯化鈉溶液(100mL)洗滌該氯仿抽提液一次，然后用無水硫酸鈉干燥并過濾。將濾液蒸干得到一厚的澄清的無色漿狀物。將該漿狀物與甲醇共蒸發(fā)(100mL，5次)，將剩余物用乙醚和己烷結(jié)晶-20℃過夜。過濾得到的白色固體并在真空中干燥，得到23.5g(得率為98％)的產(chǎn)物。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.33(多重峰，5H，ArH)，7.22(三重峰，1H，NH)，5.00(單峰，2H，ArCH2O)，4.33(三重峰，1H，CH2OH)，4.29(雙峰，1H，CHOH)，3.50(多重峰，3H，CH[OH]CH2CH2OH)，2.98(兩個(gè)三重峰，2HNHCH2CH2)，1.52-1.23(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH[OH]CH2CH2OH)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ156.4，137.6，128.5，127.9，67.4，65.2，58.4，40.4，40.2，37.5，29.5，26.4，25.0。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝11.0±0.1分鐘。D.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-(芐氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇的合成將8-[N-芐氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇(8.3g，28.0mmol)和無水吡啶(50mL，一次)共蒸發(fā)。將所得到的漿狀物溶解在無水吡啶(50mL)中，然后加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(10.0g，29.5mmol)。在沒有水分的空氣中，室溫下攪拌該橙色溶液過夜。然后加入10mL甲醇，在室溫再攪拌該溶液1小時(shí)。加入200mL叔丁基甲醚，充分地?fù)u動(dòng)該混合物，在-20℃靜置該懸浮液2小時(shí)。過濾該混合物，用100mL叔丁基甲醚洗滌固體，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將合并的濾液濃縮成厚的黃色漿狀物。將溶液分成5mL等份，用20mL乙酸乙酯和加了1mL三乙胺的20mL己烷溶解該漿狀物，通過制備性HPLC(Waters PrepLC 2000系統(tǒng))用Porasil二氧化硅柱(47mm×300mm；Waters)純化。39∶60∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺的流速是50mL/分鐘。測(cè)定洗脫液280nm的吸收值。合并產(chǎn)品部分并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到一澄清的淡黃色漿狀物。在真空中將該漿狀物置于氫氧化鉀顆粒之上進(jìn)一步干燥，得到12.9g(得率為77％)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.45-7.27(多重峰，14H，ArH[DMT，Cbz])，7.22(三重峰，1H，NH)，6.86(雙峰，4H，ArH[DMT])，5.62(寬單峰，1H，CHOH)，5.04(單峰，2H，ArCH2O)，3.75(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.63(雙峰，1H，CHOH)，3.20-3.00(多重峰，4H，NHCH2CH2和CH2CH2O-DMT)，1.72-1.23(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2-CH2CH2CH[OH]-CH2CH2O-DMT)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ158.9，156.8，145.1，137.0，136.3，130.3，128.8，128.3，128.2，127.1，113.5，87.0，71.5，66.7，62.7，55.4，41.2，37.4，36.9，30.1，26.8，25.3。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝17.2±0.1分鐘。E.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-氨基-1，3-辛二醇的合成將1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-(芐氧基羰基)氨基-1，3-辛二醇(12.9g，21.6mmol)溶解在250mL的甲醇中。將該溶液加到1升的Parr氫化容器中，然后用氮?dú)獯祾呷芤?分鐘。加入鈀-碳催化劑(1.0g，10％Pd/C)的乙酸乙酯(20mL)懸液，將該容器固定化到Parr搖床上。再在該容器中沖入氮?dú)猓缓笈懦?，充入氫氣，使其中的壓力達(dá)到35psi。在室溫?fù)u動(dòng)該容器6小時(shí)，然后排出氫氣，沖滿氮?dú)?，并從搖床上取下。用0.5μm的玻璃纖維過濾器過濾該內(nèi)容物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干該濾液，得到澄清的無色漿狀物。在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步干燥該漿狀物，得到10.1g(100％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.38-7.16(多重峰，9H，ArH)，6.86(雙峰，4H，ArH)，3.71(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.63(多重峰，4H，CHOH和CH2NH2)，3.04(三重峰，2H，NH2CH2CH2)，2.53(三重峰，2H，CH2CH2O-DMT)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ158.2，145.6，136.4，128.9，129.1，127.9，126.7，113.2，85.4，67.3，60.7，55.0，41.1，37.5，32.3，26.5，25.1。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝12.7±0.1分鐘。F.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-[(4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；鵠氨基-1，3-辛二醇將1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-氨基-1，3-辛二醇(10.0g，21.6mmol)溶解在無水四氫呋喃(100mL)中，加入4-二羥基硼基-(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(12.8g，21.6mmol)。澄清溶液在干燥氮?dú)庵袛嚢柽^夜。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該混合物濃縮成厚的漿狀物。將該漿狀物溶于含10mL三乙胺的乙酸乙酯(25mL)，在4℃將溶于冷卻數(shù)小時(shí)。過濾冷混合物，除去沉淀的固體，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮為原糖漿。用25mL乙酸乙酯和含1mL三乙胺的25mL己烷溶解該剩余物，將溶于分成5mL等份，通過制備性HPLC(Waters PerpLC 2000系統(tǒng))用Porasil二氧化硅柱(47×300mm；Waters)純化。39∶60∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺的流速是50mL/分鐘。測(cè)定洗脫液280nm的吸收值。合并產(chǎn)品部分并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到澄清的淡褐色漿狀物。在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步將該漿狀物干燥，得到14.9g(73％的得率)的淡茶色玻璃狀的泡沫。用1H和13C以及梯度和等度HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.61(三重峰，1H，NH)，8.14(雙峰，2H，ArH[PBA])，8.00(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.39-7.09(多重峰，30H，ArH[DMT，苯頻哪醇])，6.86(雙峰，4H，ArH[DMT])，4.27(雙峰，1H，CHOH)，3.70(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.57(寬單峰，1H，CHOH)，3.29(兩個(gè)三重峰，2H，NHCH2CH2)，3.07(三重峰，2H，CH2CH2O-DMT)，1.70-1.23(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH-[OH]CH2CH2O-DMT)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ166.0，158.1，145.4，141.9，138.4，136.3，135.1，129.7，128.1，127.8，127.5，127.2，127.0，126.5，113.1，96.1，85.3，67.2，60.5，55.9，38.2，37.4，29.1，26.6，24.9。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝19.4±0.1分鐘。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，用7％0.1M三乙銨乙酸乙酯作等度，pH6.5，93％的乙腈)RT＝6.2±0.1分鐘。G.1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[(4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；鵠-氨基-1，3-辛烷二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基氨基亞磷酸酯的合成用無水二氯甲烷(50mL，用堿性氧化鋁過濾)溶解1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-8-N-[(4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；鵠-氨基-1，3-辛烷二醇(3.5g，3.7mmol)。加入N，N-二異丙基乙基胺(2.6g，14.9mmol)，在室溫下在氮?dú)庵袛嚢柙撊芤?。然后?-氰乙基-N，N-二異丙基-氨基亞膦酰氯(chlorophosphine)(1.2mL，5.4mmol)，攪拌該溶液1小時(shí)。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該反應(yīng)混合物濃縮至大約20mL，加入乙酸乙酯(150mL，先用100mL的重碳酸鈉飽和溶液洗滌)。用50mL的重碳酸鈉飽和溶液洗滌該有機(jī)溶液一次，然后用50mL氯化鈉飽和溶液洗滌一次，在無水硫酸鎂中干燥，然后過濾。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干該濾液，得到淡黃色的漿狀物。用25mL的乙酸乙酯和含1mL三乙胺的己烷(25mL)溶解該物質(zhì)。將溶液分成5mL等份，通過制備性HPLC在Porasil二氧化硅柱(40mm×100mm；Waters)上純化。19∶80∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺的流速是50mL/分鐘。測(cè)定洗脫液270nm的吸收值；該產(chǎn)品在主峰洗脫。合并產(chǎn)品部分并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上將將其蒸干，得到澄清的無色玻璃狀泡沫，在真空中進(jìn)一步將其在無水氫氧化鉀顆粒上干燥，得到2.7g(78％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。1HNMR(300MHz，乙腈-d3)δ8.14(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.89(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.43-7.08(多重峰，31H，ArH[DMT，苯頻哪醇]和NH)，6.86-6.82(兩個(gè)雙峰，4H，ArH[DMT])，3.95(多重峰，1H，CHO-P)，3.74-3.734(兩個(gè)單峰，6H，Ar-OCH3)，3.50(多重峰，4H，OCH2CH2CN和NCH(CH3)2)，3.34(多重峰，2H，NHCH2CH2)，3.12(多重峰，2H，CH2CH2O-DMT)，2.58-2.46(兩個(gè)三重峰，2H，OCH2CH2CN)，1.80-1.30(多重峰，10H，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH-[OH]CH2CH2O-DMT)。注意到1H NMR光譜是復(fù)雜的，這是因?yàn)榇嬖诓糠植鸱值姆菍?duì)映異構(gòu)體的緣故。HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，用7％0.1M乙酸三乙銨，pH6.5、93％的乙腈等組成洗脫液)RT＝11.7和12.8±0.1分鐘(非對(duì)映異構(gòu)體)。
實(shí)施例2本實(shí)施例闡明1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-N-[(4-二羥基-硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨酰基]氨基-1，2-丙二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的制備。 A.4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸的合成結(jié)合圖4和5說明，將4-羧基苯基硼酸(10.0g，60.2mmol)溶解在熱的無水1，4-二氧雜環(huán)乙烷(150mL)，用少量的活性炭處理，然后在溶液仍是熱的情況下用0.5μm的玻璃纖維過濾器過濾。將濾液加熱回流，然后加熱22.1g苯頻哪醇(60.3mmol)。將該溶液回流1小時(shí)，然后冷卻至室溫。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將溶劑去除，得到白色固體，將該白色固體在-20℃下過夜從乙醚/己烷中結(jié)晶。將該固體過濾并在真空中干燥，得到23.3g(78％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.23(寬單峰，1H，CO2H)，8.19(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.13(雙峰，2H，ArH)，7.10(多重峰，20H，ArH，[苯頻哪醇])。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ167.4，141.9，135.4，129.2，128.2，127.6，127.4，126.2，96.3 。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝14.9±0.1分鐘。B.4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸NHS酯的合成將4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸(17.4g，35.0mmol)溶解在100mL無水四氫呋喃中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(4.0g，34.8mmol)，然后加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(7.2g，34.6mmol)。在室溫下將該溶液攪拌過夜，在此期間，形成1，3-二環(huán)己基脲白色沉淀。過濾除去該固體，然后用少量四氫呋喃洗滌該固體。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該合并濾液蒸干，得到灰白色的固體。用100mL四氫呋喃溶解該固體，過濾，然后加入300mL己烷。在-20℃過夜結(jié)晶。過濾得到該固體，然后在真空中干燥，得到18.4g(89％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C測(cè)定產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.31(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.25(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，7.15(多重峰，20H，ArH[苯頻哪醇])，2.91(單峰，4H，CH2)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ170.4，161.9，141.7，136.0，129.7，128.2，127.6，127.4，126.2，96.5，25.5。C.3-(N-芐氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2-丙二醇的合成將16.0g的N-芐氧基羰基-β-丙氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(50.0mmol)溶解于50mL的2-丙醇中，然后加入4.6g的3-氨基-1，2-丙二醇(50.4mmol)。在室溫下攪拌該混合物過夜。形成白色沉淀。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除該溶劑，得到白色固體，將該固體溶解在200mL的水中。加入陰離子交換樹脂(AG1-X8[OH-型]，濕重50g；Bio-Rad)，然后攪拌該漿液1小時(shí)。過濾去除該樹脂，用100mL水洗滌一次，100mL甲醇洗滌兩次。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干該濾液，得到白色固體。將該固體與甲苯(100mL)共蒸發(fā)一次，然后在真空中干燥，得到14.1g(96％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.85(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.37-7.26(多重峰，5H，ArH)，7.21(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，4.99(單峰，2H，ArCH2O)，4.64(寬單峰，2H，OH)，3.48(pentet，1H，CH2CH[OH]CH2OH)，3.27(兩個(gè)雙峰，2H，CH2CH[OH]CH2OH)，3.18(四重峰，2H，NHCH2CH2)，3.08(兩個(gè)多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2OH)，2.28(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.0，156.3，137.4，128.5，127.9，70.5，65.3，63.8，42.2，37.2，35.7。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝9.4±0.1分鐘。D. 1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(N-芐氧基羰基-β-丙氨?；?氨基-1，2丙二醇的合成將3-(N-芐氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇(5.0g，16.9mmol)溶解在50mL無水吡啶中，然后加入5.7g的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(16.9mmol)。在干燥氮?dú)庵?，在室溫下將該黃色溶液攪拌過夜。然后加入10mL甲醇，將該溶液再攪拌1小時(shí)。在浴溫度小于40℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除溶劑，得到厚的黃色漿狀物。將該漿狀物用乙酸乙酯(200mL)和5％(v/v)碳酸鈉水溶液(100mL)分配。溶液分層后，乙酸乙酯層用飽和氯化鈉溶液(150mL)洗滌一次。用無水硫酸鎂干燥該乙酸乙酯溶液，過濾，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮得到黃色的膠狀物。用含1mL三乙胺的乙酸乙酯∶己烷(1∶1，v/v，30mL)溶解該膠狀物，過濾，將濾液分成5mL等份，通過制備性HPLC(Waters PrepLC 2000系統(tǒng))在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)純化。流速是50mL/分分鐘。用下列的分級(jí)梯度用74∶25∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脫10分鐘，去除較小的污染物，然后用94∶5∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脫20分鐘，得到想要的產(chǎn)品。測(cè)定洗脫液270nm的吸收值。合并產(chǎn)品部分然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到一澄清的淡黃色漿狀物。在真空中用氫氧化鉀顆粒進(jìn)一步干燥該漿狀物，得到5.4g(54％的得率)的易碎(crisp)的玻璃狀泡沫。用1H和13C以及HPLC測(cè)定產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.80(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.41-7.18(多重峰，15H，ArH[DMT，Cbz]和NH[β-丙氨酸])，6.88(雙峰，4H，ArH[DMT])，5.00(單峰，2H，ArCH2O)，4.97(雙峰，1H，CH[OH])，3.72(單峰，6H，ArOCH3)，3.68(多重峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.19(四重峰，2H，NHCH2CH2)，3.14(兩個(gè)多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.85(多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.24(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ170.5，158.1，156.0，145.0，137.2，135.9，129.7，128.2，127.8，127.6，127.5，126.5，113.1，85.2，68.7，65.7，65.1，54.9，42.6，37.1，35.5。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝15.3±0.1分鐘。E.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(β-丙氨?；?氨基-1，2-丙二醇的合成將5.4g的1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(N-芐氧基羰基-β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇(9.0mmol)溶解在150mL純甲醇中。將該溶液加到1升的Parr氫化容器中，溶液用氮?dú)獯祾?分鐘。然后加入鈀-碳催化劑(1.0g，10％Pd/C)的乙酸乙酯(20mL)懸液，然后將該容器固定化到Parr搖床上。再在該容器中用氮?dú)獯祾?，然后排出，充入氫氣，使其中的壓力達(dá)到35psi。在室溫?fù)u動(dòng)該容器6小時(shí)，然后排出氫氣，沖滿氮?dú)?，并從搖床上取下。用0.5μm的玻璃纖維過濾器過濾該內(nèi)容物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干該濾液，得到澄清的無色漿狀物。在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步干燥該漿狀物，锝到4.0g(96％的得率)的易碎玻璃狀泡沫。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.86(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.40-7.18(多重峰，9H，ArH)，6.87(雙峰，4H，ArH)，3.72(單峰，6H，ArOCH3)，3.68(多重峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.21(雙峰of多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.10(寬單峰，3H，NH2和OH)，2.90(多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.68(三重峰，2H，NH2CH2CH2)，2.24(三重峰，2H，NH2CH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.7，158.1，145.1，136.0，129.7，127.8，127.7，126.5，113.1，85.2，68.7，65.7，54.9，42.5，38.7，38.1。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝11.9±0.1分鐘。F.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-N-[(4-二甲基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)-苯甲?；?-β-丙氨酰基)]氨基-1，2-丙二醇的合成在氮?dú)庵校瑢?.0克1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-(β-丙氨酰基)氨基-1，2-丙二醇(8.6mmol)溶解在100mL無水二氯甲烷中。加入8.5克4-二羥基硼基-(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(14.4mmol)，該溶液變成淡黃色。在室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)，然后用100mL重碳酸鈉飽和溶液洗滌一次，100mL氯化鈉飽和溶液洗滌一次。用無水硫酸鎂干燥該溶液，過濾并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，得到黃色的漿狀物。用含1mL三乙胺的25mL乙酸乙酯溶解該漿狀物，將溶液分成5mL等份，通過制備性HPLC(Waters PrepLC 2000系統(tǒng))在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)純化。流速是50mL/分鐘。用下列分級(jí)梯度洗脫用99∶1(v/v)的乙酸乙酯∶三乙胺洗脫10分鐘，去除一些較小的污染物，然后用79∶20∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脫20分鐘，得到想要的產(chǎn)品。測(cè)定洗脫液的270nm吸收值。合并產(chǎn)品部分，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到澄清的淡黃色漿狀物。在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步干燥該漿狀物，得到3.9g(48％的得率)的易碎的玻璃狀泡沫。用1H和13C以及梯度和等度HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.64(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.11(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.97(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.86(三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.41-7.08(多重峰，30H，ArH[DMT，苯頻哪醇])，6.86(雙峰，4H，ArH[DMT])，4.97(雙峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMt)，3.72(單峰，6H，ArOCH3)，3.21(多重峰，1H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.46(四重峰，2H，NHCH2CH2)，3.16(兩個(gè)多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.89(多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.38(三重峰，2H，NH2CH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ170.8，166.2，158.3，145.2，142.0，138.3，136.1，135.1，129.9，128.2，128.0，127.8，127.5，127.3，127.1，126.7，113.3，96.3，85.4，68.9，65.9，55.1，42.9，36.3，35.3。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝18.7±0.1分鐘。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，用7％0.1M乙酸三乙銨，pH6.5、93％乙腈等組成洗脫液)RT＝2.5±0.1分鐘。G.1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-3-N-[(4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨?；鵠氨基-1，2-丙二醇2-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的合成將3.9克1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨?；鵠氨基-1，2-丙二醇(4.1mmo1)溶解在100mL無水二氯甲烷中(經(jīng)堿性氧化鋁過濾)。加入N，N-二異丙基乙胺，在干燥氮?dú)庵性谑覝叵聰嚢柙撊芤?。滴?.1mL的2-氰乙基-N，N-二異丙基氨基亞膦酰氯(5.0mmo1)，將該溶液攪拌1小時(shí)。然后用100mL二氯甲烷稀釋該反應(yīng)混合物，并用50mL飽和重碳酸鈉溶液水洗滌一次，用飽和氯化鈉溶液洗一次，用無水硫酸鎂干燥，然后過濾。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該濾液蒸干，得到淡黃色的玻璃狀泡沫。用15mL的乙酸乙酯和含1mL三乙胺的己烷(10mL)溶解該材料。將溶液分成5mL等份，通過制備性HPLC(WatersPrepLC 2000系統(tǒng))在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)純化。流速為50mL/分鐘。用到下列分級(jí)梯度用50∶49∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脫10分鐘，然后用99∶1(v/v)的所乙酸乙酯∶三乙胺洗脫5分鐘，然后用49∶50∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脫5分鐘。測(cè)定洗脫液的270nm吸收值；用99∶1(v/v)的乙酸乙酯∶三乙胺稀釋該產(chǎn)品。合并產(chǎn)品部分并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到澄清無色的漿狀物。在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步干燥該漿狀物，得到3.6g(76％的得率)的易碎玻璃狀片。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.65(兩個(gè)三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.15(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.99(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.84(兩個(gè)三重峰，1H，NH[氨基丙二醇])，7.43-7.10(多重峰，30H，ArH[DMT，苯頻哪醇])，6.87(兩個(gè)雙峰，4H，ArH[DMT])，4.06(多重峰，1H，CH)，3.71(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.80-3.35(多重峰，8H，OCH2CH2CN，NCH(CH3)2，CHCH2OP和NHCH2CH2)，3.18(兩個(gè)多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，3.03(兩個(gè)多重峰，2H，CH2CH[OH]CH2O-DMT)，2.69(兩個(gè)三重峰，2H，OCH2CH2CN)，2.40(多重峰，2H，NHCH2CH2)，1.02(兩個(gè)雙峰，12H，NCH(CH3)2)。注意到1H NMR光譜是復(fù)雜的，這是由于存在部分拆分的非對(duì)映異構(gòu)體的緣故。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，用7％0.1M乙酸三乙銨等度，pH6.5，93％乙腈)RT＝4.1和4.8±0.1分鐘(非對(duì)映異構(gòu)體)。
實(shí)施例3本實(shí)施例闡明1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基硼基(四苯基乙二醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙酰氨基]絲氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的合成。 A.4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸的合成結(jié)合圖6和7說明，將4-羧基苯基硼酸(10.0g，60.2mmol)溶解在熱的無水1，4-二氧雜環(huán)乙烷(150mL)，用少量活性炭處理，然后在溶液仍是熱的情況下用0.5μm的玻璃纖維過濾器過濾。將濾液加熱回流，然后加入22.1g苯頻哪醇(60.3mmol)。將該溶液回流1小時(shí)，然后冷卻至室溫。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將溶劑去除，得到白色固體，將該白色固體在-20℃下過夜從乙醚/己烷中結(jié)晶。將該固體過濾并在真空中干燥，得到23.3g(78％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.23(寬單峰，1H，CO2H)，8.19(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.13(雙峰，2H，ArH)，7.10(多重峰，20H，ArH，[苯頻哪醇])。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ167.4，141.9，135.4，129.2，128.2，127.6，127.4，126.2，96.3。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝14.9±0.1分鐘。B.4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸NHS酯的合成將4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸(17.4g，35.0mmo1)溶解在100mL無水四氫呋喃中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(4.0g，34.8mmol)，然后加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(7.2g，34.6mmol)。在室溫下將該溶液攪拌過夜，在此期間，形成1，3-二環(huán)己基脲白色沉淀。過濾除去該固體，然后用少量四氫呋喃洗滌該固體。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干該合并的濾液，得到灰白的固體。用100mL四氫呋喃溶解該固體，過濾，然后加入300mL己烷。在-20℃過夜結(jié)晶。過濾得到該固體，然后在真空中干燥，得到18.4g(89％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C測(cè)定產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.31(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，8.25(雙峰，2H，ArH[苯甲酸])，7.15(多重峰，20H，ArH[苯頻哪醇])，2.910(單峰，4H，CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ170.4，161.9，141.7，136.0，129.7，128.2，127.6，127.4，126.2，96.5，25.5。C.n-芐氧基羰基-β-丙氨?；z氨酸甲酯的合成將14.1克N-芐氧基羰基-β-丙氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(44.0mmol)溶解在100mL無水N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入絲氨酸甲酯的鹽酸鹽(5.2g，43.6mmol)。在室溫下攪拌該混合物，然后加入10mL的N，N-二異丙基乙胺(57.4mmol)。將反應(yīng)物攪拌過夜。然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除溶劑，得到澄清無色的漿狀物。用250mL乙酸乙酯和250mL水將該材料分配。溶液分層，接著用200mL硫酸氫鉀的半飽和溶液將乙酸乙酯層洗滌一次，然后用200mL重碳酸鈉飽和溶液洗滌兩次，再用200mL氯化鈉飽和溶液洗滌一次。用無水硫酸鎂干燥該乙酸乙酯溶液，過濾，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干，得到澄清無色的漿狀物。在真空中將該漿狀物干燥，得到10.4g(74％的得率)的無定形白色固體。用1H和13C以及HPLC測(cè)定產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.21(雙峰，1H，NH[絲氨酸])，7.33(多重峰，5H，ArH)，7.18(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，5.00(三重峰，1H，OH)，4.99(單峰，2H，Ar-CH2O)，4.32(多重峰，1H，CH)，3.62(多重峰，2H，CH2OH)，3.60(單峰，3H，CH3)，3.18(四重峰，2H，NHCH2CH2)，2.33(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.0，170.5，155.9，137.2，128.2，127.6，127.5，65.1，61.1，54.5，51.5，36.9，35.2。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝9.9±0.1分鐘。D.3-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-芐氧基羰基-β-丙氨酰基絲氨酸甲酯的合成將10.0克N-芐氧基羰基-β-丙氨?；柞?30.8mmol)溶解在100mL無水吡啶中，然后加入11.0克4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(32.5mmol)。在氮?dú)庵?，將該黃色溶液在室溫下攪拌過夜。然后加入10mL的甲醇，再攪拌該溶液1小時(shí)。在浴溫度低于40℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中去除溶劑，得到厚的黃色漿狀物。用300mL的乙酸乙酯和150mL的飽和重碳酸鈉溶液將該漿狀物分配。分層后，用150mL飽和重碳酸鈉水溶液洗滌該乙酸乙酯層一次，接著用150mL飽和氯化鈉水溶液洗滌一次。然后用無水硫酸鎂干燥該乙酸乙酯溶液，過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，得到黃色的漿狀物。在室溫下用100mL乙酸乙酯溶解該漿狀物并攪拌。慢慢地滴加200mL己烷，得到近灰白的固體沉積。在-20℃過夜收集該固體，過濾，并用100mL乙酸乙酯和己烷的混合液(1∶1，v/v)洗滌，然后在真空中干燥，得到17.0克(88％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.51(雙峰，1H，NH[絲氨酸])，7.39-7.21(多重峰，15H，ArH[DMT，Cbz]和NH[β-丙氨酸])，6.90(雙峰，4H，ArH[DMT])，5.02(單峰，2H，Ar-CH2O)，4.60(多重峰，1H，CH)，3.73(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.64(單峰，3H，CO2CH3)，3.23(多重峰，4H，NHCH2CH2和CHCH2O)，2.43(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.0，170.7，158.4，156.2，144.8，137.3，135.5，135.4，129.9，128.5，127.9，127.8，126.9，113.2，85.5，65.3，63.0，55.0，52.3，51.9，37.0，35.2。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝15.9±0.1分鐘。E.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-芐氧基羰基-β-丙氨?；z氨醇的合成將10.0克3-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-芐氧基羰基-β-丙氨酰基絲氨酸甲基酯溶解在100mL無水四氫呋喃中。在干燥的氮?dú)庵校瑢⒃撊芤旱渭拥綌嚢柚呐饸浠?1.0g，45.9mmol)的無水四氫呋喃(100mL)溶液中。在干燥氮?dú)庵?，將該澄清無色的溶液在室溫下攪拌6小時(shí)。然后加入50mL的水，再攪拌4小時(shí)。加入200mL四氫呋喃，得到白色沉淀。過濾該混合液，用少量四氫呋喃洗滌該固體，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將濾液濃縮到50毫升。然后加入250mL乙酸乙酯，溶液分層。接著用100mL飽和重碳酸鈉水溶液洗滌該乙酸乙酯溶液一次，再用100mL飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，用硫酸鎂干燥，然后過濾。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將濾液蒸干，得到澄清無色的漿狀物，在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步將該漿狀物干燥，得到9.3g(97％的得率)的易碎玻璃狀泡沫。用1H和13C以及HPLC測(cè)定產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.80(雙峰，1H，NH[絲氨酸])，7.40-7.19(多重峰，15H，ArH[DMT，Cbz]和NH[β-丙氨酸])，6.88(雙峰，4H，ArH[DMT])，5.00(單峰，2H，Ar-CH2O)，4.63(三重峰，1H，CH2OH)，4.01(多重峰，1H，CH)，3.72(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.45(三重峰，2H，CHCH2OH)，3.20(四重峰，2H，NHCH2CH2)，2.98(兩個(gè)三重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.32(四重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ170.2，158.2，156.2，145.3，137.3，136.0，129.9，129.1，128.5，127.9，127.6，126.7，113.2，85.2，65.2，62.6，60.8，55.0，50.9，37.2，35.8。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝14.8±0.1分鐘。F.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-丙氨酰基絲氨醇的合成將9.3克1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-芐氧基羰基-β-丙氨酰基絲氨醇(15.5mmol)溶解在200mL純甲醇中。將該溶液加到1升的Parr氫化容器中，用氮?dú)獯祾呷芤?分鐘。然后加入鈀-碳催化劑(1.0g，10％Pd/C)的乙酸乙酯(20mL)懸液，然后將該容器固定化到Parr搖床上。再在該容器中充入氮?dú)?，然后排出，沖入氫氣，使其中的壓力達(dá)到35psi。在室溫?fù)u動(dòng)該容器6小時(shí)，然后排出氫氣，沖滿氮?dú)猓膿u床上取下。用0.5μm的玻璃纖維過濾器過濾該內(nèi)容物，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干該濾液，得到澄清的無色漿狀物。在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步干燥該漿狀物，得到7.1g(93％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.87(雙峰，1H，NH[絲氨酸])，7.38-7.20(多重峰，9H，ArH)，6.88(雙峰，4H，ArH)，3.97(多重峰，1H，CH)，3.72(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.45(三重峰，2H，CHCH2OH)，3.26(寬單峰，3H，NH2和OH)，2.95(兩個(gè)多重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.73(兩個(gè)三重峰，2H，NHCH2CH2)，2.19(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ171.3，158.3，145.4，136.1，130.0，128.0，127.9，126.7，113.3，85.3，62.7，60.9，55.0，51.O，37.8，37.7。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝11.0±0.1分鐘。G.1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基硼基-(苯頻哪醇環(huán)酯)-苯甲?；?-β-丙氨?；?]絲氨醇的合成在干燥氮?dú)庵?，?-O-(4，3′-二甲氧基三苯甲基)-β-丙氨?；z氨醇(7.1g，14.4mmol)溶解在100mL無色四氫呋喃中。加入2.0mL三乙胺(14.4mmol)，然后加入8.5g的4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲酸N-羥基-琥珀酰亞胺酯(14.4mmol)。在室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)，然后過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將該濾液濃縮，得到厚的漿狀物。用250mL乙酸乙酯溶解該漿狀物，接著用200mL飽和重碳酸鈉水溶液洗滌兩次，用200mL飽和氯化鈉水溶液洗滌一次。用硫酸鎂干燥該溶液，然后過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)，得到黃色漿狀物。用含1mL三乙胺的乙酸乙酯(60mL)溶解該漿狀物，將溶液分成10mL等份，通過制備性HPLC(Waters PrepLC 2000系統(tǒng))在Porasil二氧化硅柱上(47×300mm；Waters)純化。流速是50mL/分鐘。用到下列分級(jí)梯度用66∶33∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脫10分鐘，去除一些較小的污染物，然后用98∶1∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脫20分鐘，得到想要的產(chǎn)品。測(cè)定洗脫液的270nm吸收值。合并產(chǎn)品部分，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到澄清無色的漿狀物。在真空中在氫氧化鉀顆粒上進(jìn)一步將該漿狀物干燥，得到7.1g(93％的得率)的易碎玻璃狀泡沫。用1H和13C以及梯度和等度HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.64(三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.09(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.95(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.83(雙峰，1H，NH[絲氨酸])，7.38-7.09(多重峰，30H，ArH[DMT，苯頻哪醇])，6.85(雙峰，4H，ArH[DMT])，4.68(三重峰，1H，CHCH2OH)，4.05(多重峰，1H，Ch)，3.70(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.49(多重峰，4H，CHCH2OH和NHCH2CH2)，2.98(兩個(gè)多重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.46(三重峰，2H，NHCH2CH2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ166.3，158.2，145.3，142.0，141.9，138.1，136.0，135.2，129.9，128.2，127.9，127.6，127.4，127.1，126.7，113.2，96.3，85.2，62.6，60.9，55.1，50.9，36.3，35.4。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，乙腈的0.1M乙酸三乙銨的線性梯度，pH6.5，在15分鐘的乙腈為0-100％，測(cè)定260nm的吸收值)RT＝18.6±0.1分鐘。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，用7％0.1M乙酸三乙銨，pH6.5，93％乙腈等組成洗脫液)RT＝2.4±0.1分鐘。H.1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基硼基(四苯基乙二醇環(huán)酯)苯甲酰基)-β-丙氨酰]絲氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙氨基氨基亞磷酸酯的合成將7.2克1-O-(4，4′-二甲氧三苯甲基)-2-N-[(4二羥基硼基(四苯基乙二醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨酰]絲氨醇(7.6mmol)溶解在250mL(經(jīng)堿性氧化鋁過濾)無水二氯甲烷中。加入N，N-二異丙基乙胺(5.5mL，31.6mmol)，在干燥氮?dú)庵?，將該溶液在室溫下攪拌。滴?.5mL的2-氰乙基-N，N-二異丙基-氨基亞膦酰氯(10.5mmol)，然后攪拌該溶液1小時(shí)。接著將在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將灌溉溶液濃縮至50mL，然后加入300mL的(先用100mL飽和重碳酸鈉水溶液洗滌的)乙酸乙酯。用100mL飽和重碳酸鈉溶液洗滌該有機(jī)溶液一次，然后再用100mL飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，用無水硫酸鎂干燥，然后過濾。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將濾液干燥，得到淡黃色的玻璃狀泡沫。用25mL乙酸乙酯和含1mL三乙胺的己烷(15mL)溶解該泡沫。將溶液分成5mL等份，通過制備性HPLC(Waters PrepLC 2000系統(tǒng))在Porasil二氧化硅柱上(40×100mm；Waters)純化該溶液的5mL等分。流速是50mL/分鐘。用下列多相線性梯度用50∶49∶1(v/v/v)到79∶20∶1(v/v/v)的乙酸乙酯∶己烷∶三乙胺洗脫10分鐘，用99∶1(v/v)的乙酸乙酯∶三乙胺洗脫5分鐘，用79∶20∶1的乙酸乙酯∶甲醇∶三乙胺洗脫2分鐘，并保持該組成3分鐘。測(cè)定洗脫液260nm的吸收值，產(chǎn)品洗脫液出現(xiàn)在第一主峰。合并產(chǎn)品部分，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將其蒸干，得到一澄清無色的漿狀物。用加了2mL三乙胺的30mL乙酸乙酯溶解該漿狀物，將該溶液滴加到迅速攪拌的冰冷的己烷(300mL)中，得到白色沉淀。-20℃過夜收集該白色沉淀，之后過濾，用冷己烷充分洗滌，在真空中在無水碳酸鉀上干燥，得到7.9g(91％的得率)的產(chǎn)品。用1H和13C以及HPLC測(cè)定該產(chǎn)品的純度。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.64(兩個(gè)三重峰，1H，NH[β-丙氨酸])，8.11(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.97(雙峰，2H，ArH[PBA])，7.95(雙峰，1H，NH[絲氨酸])，7.38-7.09(多重峰，30H，ArH[DMT，苯頻哪醇])，6.85(雙峰，4H，ArH[DMT])，4.22(多重峰，1H，CH)，3.70(單峰，6H，Ar-OCH3)，3.70-3.40(多重峰，8H，OCH2CH2CN，NCH(CH3)2，CHCH2OP和NHCH2CH2)，3.02(多重峰，2H，CHCH2O-DMT)，2.68(兩個(gè)三重峰，2H，OCH2CH2CN)，2.48(多重峰，2H，NHCH2CH2)，1.02(兩個(gè)三重峰，12H，NCH(CH3)2)。13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ170.5，166.2，158.3，145.2，142.1，142.0，138.1，135.9，135.2，139.9，138.2，127.9，127.6，127.4，127.1，126.8，119.0，113.3，96.3，85.4，62.3(寬)58.5，58.4，58.3，58.3，42.6，42.4，36.3，35.4，31.0，24.4，24.3，22.1，19.9，19.8。31P NMR(121MHz，DMSO-d6)δ147.4，147.1(非對(duì)映異構(gòu)體)。
HPLC(反相，4.6×100mm的C4柱，流速為1.0mL/分鐘，用7％0.1M乙酸三乙銨等度，pH6.5，93％乙腈)RT＝4.4±0.1分鐘。
實(shí)施例4本實(shí)施例闡明硼酸修飾的寡聚脫氧核苷酸的自動(dòng)固相合成。
使用標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)氨基亞磷酸酯化學(xué)(由Perkin Elmer/AppliedBiosystems[Foster City CA]提供的DNA自動(dòng)合成器394型，和由GlenReseach[Sterling，VA]提供的聯(lián)合Ultrafast DNA合成試劑)，以三苯甲基ON(Trityl ON)的模式合成1μmol規(guī)模的寡聚脫氧核苷酸PX001(序列為5′-CGCCAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3′)。將完成的寡聚脫氧核苷酸保留在載體上。將適當(dāng)量的含有苯基硼酸(PBA)的氨基亞磷酸酯溶解在無水乙腈(1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-8-N-[4-二羥基硼基-(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?]氨基-1，3-辛二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基-氨基亞磷酸酯和(1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3-N-[4-二羥基硼基-(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨酰基)]氨基-1，2-丙二醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基-氨基亞磷酸酯，或者75∶25(v/v)的無水乙腈∶無水四氫呋喃(1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基硼基-(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨酰基)]絲氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基氨基亞磷酸酯)中，得到0.1M的最終濃度。將這些溶液放在DNA合成器中的一個(gè)額外的氨基亞磷酸酯瓶中。然后，一個(gè)或多個(gè)PBA部分通過標(biāo)準(zhǔn)偶合循環(huán)的修飾被加到寡聚脫氧核苷酸的5′-端，其中偶合反應(yīng)的“等待時(shí)間”被延長(zhǎng)到15分鐘。該合成又以Trityl ON的模式進(jìn)行。從每一循環(huán)收集到的三苯甲基溶液和接著的HPLC分析估算，寡聚脫氧核苷酸上的PBA酰亞胺酯(amidite)的偶合得率估計(jì)大于95％。
然后根據(jù)儀器制造者的方案，用濃氫氧化銨從載體上將完成的三苯甲基化的PBA修飾的寡聚脫氧核苷酸切下來。通過在60℃的加熱塊中加熱該氫氧化銨溶液1小時(shí)，核苷堿基上的保護(hù)基和硼酸上的保護(hù)基被同時(shí)去除。然后將該溶液放到冰箱中冷卻至4℃，并在SpeedVAC真空濃縮器(SavantInstruments[Farmingdale，NY])中濃縮到1mL。含有PBA修飾寡聚脫氧核苷酸粗品的溶液被保存在4℃，直到它被用HPLC純化。
實(shí)施例5本實(shí)施例闡明硼酸修飾的寡聚脫氧核苷酸的純化。
通過反相HPLC，用一般的純化合成寡聚脫氧核苷酸的修飾方法純化粗制的三苯甲基化的硼酸修飾的寡聚脫氧核苷酸。但是，通常用來純化三苯甲基化的未修飾的寡聚脫氧核苷酸和標(biāo)記的寡聚脫氧核苷酸的C18和C8相對(duì)三苯甲基化的硼酸修飾的寡聚脫氧核苷酸表現(xiàn)很差。與想要的產(chǎn)品有關(guān)的峰非常的寬，拖尾很長(zhǎng)，這樣很難雜質(zhì)中分離出來。已發(fā)現(xiàn)C4相能更好的進(jìn)行，取得令人滿意的結(jié)果。
將上述粗制的三苯甲基化的硼酸修飾的寡聚脫氧核苷酸溶液的一個(gè)等分(10-100μL)注射到4.6mm×150mm的C4柱上(Inertil5μm，MetaChenTechnologies[Torrance，CA])，該柱與Hewlett Packard Seris1050液相層析分析儀相連。用乙腈(組分B)和0.1M、pH為6.5乙酸三乙銨(組分A)作為雙相的線性梯度來展柱。其梯度如下用95∶5(v/v)的A∶B到65∶35(v/v)的A∶B過柱21分鐘，然后用10∶90(v/v)的A∶B過柱3分鐘。流速是1.0mL/分鐘，用280nm的UV檢測(cè)來觀察分離。產(chǎn)品寡聚脫氧核苷酸在18-22分鐘洗出，PBA基團(tuán)數(shù)增加則保留時(shí)間相應(yīng)較長(zhǎng)。收集該產(chǎn)品，并將其在SpeedVac中蒸發(fā)，得到油狀顆粒。用1mL80∶20(v/v)的冰乙酸∶水溶解該顆粒，并在室溫下靜置1小時(shí)以去除三苯甲基基團(tuán)。然后再在SpeedVac中蒸發(fā)該溶液，得到油狀顆粒。用0.5mL的水溶解該油狀顆粒冷凍保藏。通過HPLC用上述的柱和梯度分析10μL等分。由此得到的硼酸修飾的寡聚脫氧核苷酸的純度一般大于90％(見圖8)。
在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利出版物在說明書中多被完全地引用到。雖然本發(fā)明已結(jié)合較佳實(shí)施方案及其實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明的范圍并不僅僅限于那些已描述的實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員來說，對(duì)本發(fā)明上述描述所作的修改和改進(jìn)都不能偏離本發(fā)明的范圍，該范圍在下面的權(quán)利要求中進(jìn)行說明和限制。
權(quán)利要求
1.下式所示的化合物 其中，R1是芳基硼酸酯基團(tuán)；Y選自O(shè)(CH2)m、S(CH2)m和C-C單鍵，其中m是1-5的整數(shù)；Z選自有1-16個(gè)碳原子的亞烷基、亞烷基酰氨基、亞烷基酰氨基亞烷基和亞烷基酰氨基亞烷基酰氨基；X選自亞甲基和C-C單鍵；R2選自氫、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基和二甲氧基苯甲基；以及R3選自氫和活化的含磷基團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，R1是苯基硼酸酯基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述苯基硼酸酯基團(tuán)選自下列基團(tuán) 其中，R4和R5獨(dú)立地選自氫、甲基和苯基；以及Q選自亞甲基和C-C單鍵。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Y是C-C單鍵。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Y是O(CH2)m，m是1。
6.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Y是S(CH2)m，m是1。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Z是C1-C5亞烷基。
8.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Z是C1-C2亞烷基酰氨基。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，X是亞甲基。
10.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，X是C-C單鍵。
11.如權(quán)利要求3所述的化合物，其中，R2是二甲氧基三苯甲基；R3是氨基亞磷酸酯。
12.如權(quán)利要求3所述的化合物，其中，Q是亞甲基。
13.如權(quán)利要求11所述的化合物，其中，所述氨基亞磷酸酯是β-氰乙基-N-二異丙基氨基氨基亞磷酸酯。
14.如權(quán)利要求13所述的化合物，其中，所述化合物是1-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-N-[(4-二羥基硼基(苯頻哪醇環(huán)酯)苯甲?；?-β-丙氨?；鵠絲氨醇3-O-(2-氰乙基)-N，N-二異丙基氨基氨基亞磷酸酯。
15.下式所示的化合物 其中，R是芳基硼酸基團(tuán)；Y選自O(shè)(CH2)m、S(CH2)m和C-C單鍵，其中m是1-5的整數(shù)；Z選自有1-16個(gè)碳原子的亞烷基、亞烷基酰氨基、亞烷基酰氨基亞烷基和亞烷基酰氨基亞烷基酰氨基；X選亞甲基和C-C單鍵；R6選自氫和羥基；R7選自羥基和單磷酸酯；n是0-10的整數(shù)n′為約10-1000的整數(shù)；以及Nu′和Nu″獨(dú)立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸類似物，其中，對(duì)于任意給定的單體值n，R、Y和X可以是相同或不同；對(duì)于任意給定的單體值n′，R6和Nu′可以是相同或不同。
16.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中，R是苯基硼酸基團(tuán)。
17.如權(quán)利要求16所述的化合物，其中，所述苯基硼酸基團(tuán)選自下列基團(tuán)
18.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中，Z是C1-C5亞烷基。
19.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中，Z是C1-C2亞烷基酰氨基。
20.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中，X是亞甲基。
21.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中，R6是氫。
22.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中，X是C-C單鍵。
23.如權(quán)利要求15所述的化合物，其中，n′為約10-800的整數(shù)。
24.如權(quán)利要求23所述的化合物，其中，n′為約10-400的整數(shù)。
25.如權(quán)利要求24所述的化合物，其中，n′為約10-100的整數(shù)。
26.下式所示的化合物 其中，R是芳基硼酸基團(tuán)；Y選自O(shè)(CH2)m、S(CH2)m和C-C單鍵，其中m是1-5的整數(shù)；Z選自有1-16個(gè)碳原子的亞烷基、亞烷基酰氨基、亞烷基酰氨基亞烷基和亞烷基酰氨基亞烷基酰氨基；X選自亞甲基和C-C單鍵；R6選自氫和羥基；R7選自羥基和單磷酸酯；n是0-10的整數(shù)n′為約10-1000的整數(shù)；以及Nu′和Nu″獨(dú)立地選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和核苷酸類似物，其中，對(duì)于任意給定的單體值n，R、Y和X可以是相同或不同；對(duì)于任意給定的單體值n′，R6和Nu′可以是相同或不同。
27.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中R1是苯基硼酸基團(tuán)。
28.如權(quán)利要求27所述的化合物，其中，所述苯基硼酸基團(tuán)選自下列基團(tuán)
29.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中，Z是C1-C5亞烷基。
30.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中，Z是C1-C2亞烷基酰氨基。
31.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中，X是亞甲基。
32.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中，R6是氫。
33.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中，X是C-C單鍵。
34.如權(quán)利要求26所述的化合物，其中，n′為約10-800的整數(shù)。
35.如權(quán)利要求34所述的化合物，其中，n′為約10-400的整數(shù)。
36.如權(quán)利要求35所述的化合物，其中，n′為約10-100的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供用于摻入修飾寡核苷酸和多核苷酸的芳基硼酸試劑。由此得到的修飾寡核苷酸和多核苷酸能用于生物大分子的固定化化和純化的生物偶聯(lián)反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07F19/00GK1354752SQ00805176
公開日2002年6月19日 申請(qǐng)日期2000年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月19日
發(fā)明者R·J·凱澤, M·L·斯托威茨 申請(qǐng)人:坡林克斯股份有限公司