專利名稱：基于豌豆質(zhì)體藍素pete啟動子的嵌合啟動子的制作方法
〔說明〕本發(fā)明涉及嵌合表達啟動子，特別是適合并適用于植物生物工程領(lǐng)域的。
一般說來，表達啟動子是生物工程和遺傳操作領(lǐng)域中眾所周知的。更具體就植物生物工程而論，編碼希望在宿主細胞中產(chǎn)生的多肽的基因的表達程度常常取決于所用的啟動子。遍在使用的各種啟動子常常只是因為它們的組織特異性或表達強度而限于具體應(yīng)用或特定細胞組織。例如，可能列舉花椰菜花葉病毒的35S啟動子，據(jù)說它與來源于nos基因的啟動子相比是相對較強的啟動子，這兩種啟動子都更特定地用于植物生物工程領(lǐng)域。因此，現(xiàn)在仍需要使得能夠克服迄今常用的啟動子所固有的那些問題的新穎而有用的啟動子。
在以WO97/20056號公布的PCT申請中已報道了解決該問題的一種嘗試，它描述了通過在已知的啟動子中使用“增強子”(即對啟動子的活性具有正向作用)來增加基因表達的程度?！霸鰪姟焙塑账嵝蛄懈挥蠥和T堿基，所述堿基的總量占該“增強子”核苷酸序列的50％以上。特別是，該PCT申請的申請人詳細說明了來源于豌豆質(zhì)體藍素啟動子的“增強子”區(qū)的用途。
此處以及權(quán)利要求書中所用的表達方式將具有以下含義-“核酸”是指DNA或RNA；-“核酸序列”是指從5’末端朝向3’末端閱讀的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈低聚體或多聚體，它包括自我復(fù)制型質(zhì)粒、基因、感染或非感染性DNA或RNA的聚合體以及功能或非功能性DNA或RNA。在本申請所用的核苷酸符號標示中，除非另有說明，否則單鏈核苷酸序列的左手末端是5’末端；-“衍生核酸序列”是指從某序列例如通過一個或多個核苷酸的置換、缺失、添加、突變、斷裂和/或合成而直接或間接得到的序列；-“啟動子”或“啟動子核酸序列”是指翻譯起始密碼子的核酸上游區(qū)，它參與識別和結(jié)合RNA聚合酶以及與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的其他蛋白質(zhì)；
-“植物啟動子”是指能夠引發(fā)植物細胞轉(zhuǎn)錄的啟動子；-“組成型啟動子”是指能夠在所述生物體的整個發(fā)育過程中在該宿主生物體的所有或幾乎所有組織中表達與所述啟動子操作性連接的核酸序列的啟動子；-“組織特異性啟動子”是指能夠以選擇性方式在宿主生物體的某些特定組織中表達與所述啟動子操作性連接的核酸序列的啟動子；-“操作性或功能性連接”是指將啟動子或啟動子核酸序列與要表達的編碼希望產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的核酸序列或基因連接，連接的方式要使得該啟動子真正影響或驅(qū)動該連接核酸序列的轉(zhuǎn)錄。應(yīng)當理解，該啟動子序列還可包括位于轉(zhuǎn)錄起始位點和翻譯起始密碼子之間的轉(zhuǎn)錄序列；-“要表達的編碼希望產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因”是指編碼多肽、優(yōu)選外源或異源多肽的基因或核酸序列，所述外源多肽更優(yōu)選藥學(xué)、治療學(xué)或化妝品學(xué)上的活性物質(zhì)，諸如蛋白質(zhì)、酶、抑制劑、受體、抗體、抗原、其治療活性片段?？梢酝ㄟ^相應(yīng)基因或核酸序列在宿主細胞中的表達生產(chǎn)的例舉性的異源或外源治療活性物質(zhì)是結(jié)構(gòu)蛋白，諸如膠原，鐵轉(zhuǎn)移蛋白或運鐵蛋白，諸如乳鐵蛋白，血液衍生蛋白，諸如血紅蛋白，人血清白蛋白，紅細胞生成素，生長刺激因子，蛋白水解酶或抗蛋白水解酶，諸如α-抗胰蛋白酶，激素，次生代謝物，消化酶，諸如胃脂肪酶，胰脂肪酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，醇脫氫酶，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子，心刺激劑或調(diào)節(jié)劑，以及血壓控制劑諸如血管緊張素；-“表達框”是指能夠驅(qū)動編碼希望在與這類表達框序列相容的宿主生物體中產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因的表達的核苷酸序列。這類表達框一般至少包括一個啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號，以及可選的用于表達或表達所需的其他因子；-“載體”是指表達系統(tǒng)，例如用DNA包被的發(fā)射物、基于核酸的轉(zhuǎn)運載體、適于傳遞核酸序列的核酸分子、和自我復(fù)制型自主環(huán)狀DNA，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒等等。當重組微生物或重組細胞培養(yǎng)物描述為“表達載體”的宿主時，這還可包括環(huán)狀染色體外DNA(諸如象線粒體或葉綠體DNA)，已整合到宿主染色體中的DNA，或者作為整合到宿主基因組中的自主結(jié)構(gòu)在有絲分裂期間通過細胞穩(wěn)定復(fù)制、或者保持在宿主的核或胞質(zhì)中的載體；-“質(zhì)粒”是指能夠在細胞中復(fù)制的自主環(huán)狀DNA分子，包括“表達質(zhì)粒”和“非表達質(zhì)?！薄．斨亟M微生物或細胞培養(yǎng)物描述為“表達質(zhì)?！钡乃拗鲿r，這還包括環(huán)狀染色體外DNA分子和已整合到宿主染色體中的DNA分子。若質(zhì)粒保持在宿主細胞中，則該質(zhì)?；蛘咦鳛樽灾鹘Y(jié)構(gòu)在有絲分裂期間由細胞穩(wěn)定復(fù)制，或者整合到宿主基因組中；“異源序列”或“異源核酸序列”是指來源于對環(huán)境來說是外來的來源或種的序列，或者若是來自相同環(huán)境，則已對其原始形式進行了修飾?？梢詫怂嵝蛄羞M行修飾，例如通過用限制酶處理核酸，以產(chǎn)生能夠操作連接到啟動子的核酸片段。修飾也可以通過使用象位點特異性誘變等技術(shù)進行；-“盒”是指賦予調(diào)節(jié)功能的核酸序列；-“…樣”是指包含與作為參照指示的已知盒和/或已知核酸序列相同或同源的某種序列的與該術(shù)語相聯(lián)系的盒和/或核酸序列，優(yōu)選與參比序列至少50％的序列同一性，甚至更優(yōu)選至少75％的序列同一性，首選至少90％的序列同一性。序列同一性百分數(shù)是在至少6個鄰接核苷酸堿基的比較窗口的基礎(chǔ)上計算出的。可以使用序列對齊算法來確定比較窗口，以確定與參比序列的同源性，例如局部同源性算法、同源性對齊算法和相似檢索算法，這些算法也有計算機程序形式，命名為諸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。序列同一性百分數(shù)通過使用上述一種或多種方法比較參比序列與盒和/或核酸序列得到；-“位于”是指鑒定元件核酸序列上的位置，諸如“盒”、限制位點或具有特定功能的密碼子。用數(shù)字給出的位置指的是該元件在核酸序列中的起始位置，是以核酸序列的讀框方向來說的，即，以相對于標明為+1的轉(zhuǎn)錄起始位點的位置的5’→3’方向；-“轉(zhuǎn)基因植物”是指通過應(yīng)用基因操作技術(shù)得到的植物，包括用這類技術(shù)得到的完整植物、它們的后代、以及利用這類技術(shù)得到的植物器官，例如但不限于根、莖和葉。按照本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因植物還可以有不同的倍性水平，可以是例如多倍體、二倍體和單倍體；-“繁殖體”是指能夠使從其再生完整植物的、有結(jié)構(gòu)或無特定結(jié)構(gòu)的植物細胞的累積塊或聯(lián)合或集合體；這類聯(lián)合體可以是例如外植體、愈傷組織、莖、葉、根、插枝、甚至是種子的形式。
本申請人采用了與前面所討論的PCT申請的申請人所用的完全不同的方法。奇跡般地，本申請人已設(shè)法生產(chǎn)了滿足前述需要的嵌合啟動子，特別是相對現(xiàn)有的常用啟動子來說，能夠增加編碼希望在宿主細胞中、優(yōu)選在植物細胞中產(chǎn)生的多肽的基因或與所述啟動子操作性連接的核酸序列的表達程度的嵌合啟動子。另外，為了能夠選出最適合特定任務(wù)或應(yīng)用或打算要使用的環(huán)境的啟動子，本申請人同時設(shè)法生產(chǎn)了一族啟動子，并因此能夠控制要表達的基因或編碼希望在宿主細胞中產(chǎn)生的多肽的與所述啟動子操作性連接的核酸序列的表達程度。
所以，本發(fā)明的一個目的是包含至少一個得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的、具有SEQ.ID.No.01所述序列的核酸序列的嵌合表達啟動子。優(yōu)選地，該包含得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的核酸序列的嵌合啟動子選自下列成員在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。
另外，本申請人注意到按照本發(fā)明有可能構(gòu)造這樣的啟動子、尤其是植物啟動子，它們具有令人感興趣的啟動子活性，同時具有最小調(diào)節(jié)盒，特別是至少1個“G”盒、“CAAT”盒和“TATA”盒，唯一的條件是“G”盒位于其他盒的上游，即位于核酸序列的5’區(qū)，且該“G”盒優(yōu)選位于離開其他盒上游的用核苷酸堿基表達的一定距離處。因此，本發(fā)明的另一個目的是包含與至少1個“CAAT”盒、1個“TATA”盒和轉(zhuǎn)錄起始位點(在圖中用+1標明)上游操作性連接的“G”盒的嵌合表達啟動子。更優(yōu)選該“G”盒位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)的-225位和-65位之間。甚至更優(yōu)選該“G”盒位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(在圖中用+1標明)的-201位和-115位之間。在首選的實施方案中，該“G”盒位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(在圖中標明為+1位)的-201位或-115位。
有利地，該“G”盒是植物來源的。優(yōu)選“G”盒從豌豆質(zhì)體藍素基因的啟動子得到。更優(yōu)選“G”盒從豌豆質(zhì)體藍素基因的petE啟動子得到。
按照本發(fā)明啟動子的優(yōu)選實施方案，啟動子進一步包含操作性或功能性連接“G”盒上游的“nos E樣”盒。按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，啟動子還包含至少一個與“G”盒操作性或功能性連接的“as1”或“as1樣”盒，并優(yōu)選2個或多個鄰近或分離排列的這樣的盒，首選4個這樣的盒。這些“as1”或“as1樣”盒可以連接所述“G”盒的上游和下游，優(yōu)選連接其上游。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方式中，一個或多個“as1”或“as1樣”盒也可以和已知的反向的順序排列，即從3’到5’方向，并優(yōu)選以反向重復(fù)順序排列。
按照本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案，啟動子還包含至少一個與“G”盒操作性或功能性連接的“as2”盒，并優(yōu)選2個或多個鄰近或分離排列的這樣的盒，首選4個這樣的盒。這些盒還可優(yōu)選連接所述“G”盒的上游和下游，更優(yōu)選連接其上游。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方式中，有些或所有盒也可以和已知的反向的順序排列，或者如上所述為反向重復(fù)盒。
最后，甚至更優(yōu)選的是，如上所述的嵌合啟動子包含至少一個選自下列成員的核酸序列在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。
本發(fā)明的另一個目的是包含至少一個與編碼希望表達的多肽的基因或核酸序列操作性或功能性連接的、得自豌豆質(zhì)體藍素基因的基因啟動子的核酸序列的表達框，所述編碼核酸序列依次與轉(zhuǎn)錄終止核酸序列操作性或功能性連接，其中得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的核酸序列選自在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。
本發(fā)明的另一個目的是分離的啟動子核酸序列，其特征在于該序列選自下列成員在序列表中由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。這樣的序列可以是從在序列表中由SEQ.ID.No.1所述的序列通過一個或多個核酸的缺失、置換、添加得到的。
本發(fā)明的另一個目的涉及用于生產(chǎn)如前所述的啟動子核酸序列的啟動子的脫氧核苷酸或脫氧核苷模塊。這些模塊可以是-構(gòu)件或“定向”模塊，即以和最終啟動子核酸序列相同的方向從序列的5’末端朝向序列的3’末端閱讀的序列；和/或-“引導(dǎo)”模塊，即其末端包括與定向構(gòu)件的末端互補和重疊的核苷酸或核苷堿基的序列。
因此，并首選的是，定向構(gòu)件對應(yīng)于至少一個選自下列成員的序列在序列表中由SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的序列。
另外，優(yōu)選使用與至少一個選自下列成員的序列相對應(yīng)的引導(dǎo)模塊在序列表中由SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的序列。
本發(fā)明的另一個目的是包含能夠引發(fā)編碼希望產(chǎn)生的多肽的基因或核酸序列的轉(zhuǎn)錄的啟動子或啟動子核酸序列的載體，特征在于該啟動子或啟動子核酸序列對應(yīng)于如前所定義的嵌合表達啟動子或啟動子核酸序列。
優(yōu)選該載體選自由pMRT1151、pMRT1149、pMRT1170所述的雙元載體。
本發(fā)明的另一個目的是生產(chǎn)如前所定義的那些嵌合表達啟動子或分離的啟動子核酸序列的方法，特征在于它包括以下步驟-進行稱作LCR的連接鏈式反應(yīng)，以從至少一個選自分別由序列表中的SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的定向構(gòu)件S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7的定向構(gòu)件脫氧核苷酸或脫氧核苷序列和至少一個用于構(gòu)造所述啟動子核酸序列或啟動子的脫氧核苷酸或脫氧核苷引導(dǎo)模塊來生產(chǎn)單鏈連續(xù)DNA分子，所述引導(dǎo)模塊選自分別由序列表中的SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的引導(dǎo)序列G1、G2、G3和G4；-對從前一步驟得到的單鏈進行PCR擴增，以生產(chǎn)對應(yīng)于嵌合表達啟動子或啟動子核酸序列的雙鏈DNA；-可選地分離啟動子或啟動子核酸序列。
優(yōu)選脫氧核苷酸或脫氧核苷構(gòu)件在連接前磷酸化。更優(yōu)選連接在至少一種DNA連接酶的存在下以下列條件下的熱循環(huán)進行-首先在約94℃下約1分鐘的1個循環(huán)；-隨后8個相同循環(huán)，每個由以下步驟組成-65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和37℃下10分鐘。
本發(fā)明的另一個目的是具有穩(wěn)定整合到其基因組中的至少一個如前所定義的啟動子或至少一個啟動子核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物最好選自雙子葉植物，諸如象并優(yōu)選馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油菜籽、甜菜根和向日葵，和/或選自單子葉植物，諸如象并優(yōu)選小麥、大麥、燕麥、稻米和玉米。
本發(fā)明的另一個目的是轉(zhuǎn)基因植物繁殖體，其中繁殖體具有前面所給出的定義，優(yōu)選該繁殖體是種子。
本發(fā)明的又一個目的是含有如前所定義的啟動子或啟動子核酸序列的細胞。優(yōu)選該細胞是原核或真核細胞，更優(yōu)選是選自細菌細胞、昆蟲細胞、動物細胞、人類細胞、真菌細胞、藻類、酵母和植物細胞的細胞，首選是植物細胞。
除了本發(fā)明的優(yōu)選目的以外，還有編碼希望產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因在細胞中的表達方法，特征在于它包括以下步驟-用包含與編碼要產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因操作性連接的、如前文所定義的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化細胞，其中所述編碼核酸序列自身與轉(zhuǎn)錄終止信號操作性連接；-在使得編碼多肽的核酸序列或基因能夠表達的條件下培養(yǎng)該細胞。優(yōu)選在該方法中所用的細胞是原核細胞或真核細胞。更優(yōu)選是選自細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞和植物細胞的細胞，首選是植物細胞。
最后，本發(fā)明的另一個目的是如前所定義的轉(zhuǎn)基因植物或繁殖體的生產(chǎn)方法，特征在于該方法包括以下步驟-用包含如前文所定義的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細胞；-選出具有整合到其基因組中的啟動子或啟動子核酸序列的植物細胞；-通過培養(yǎng)或通過再生整個嵌合或轉(zhuǎn)基因植物來繁殖轉(zhuǎn)化和選出的植物細胞。
附圖的簡要描述本發(fā)明將通過以下對若干個作為最佳方式但非限制性實施例給出的優(yōu)選實施方案的詳細描述并參照附圖而得到更好的理解，在附圖中
-圖I、II和III圖解表示了比較參比分子構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)，使得本發(fā)明的嵌合表達啟動子能夠與所述參比構(gòu)建物進行比較。圖I中，所表示的構(gòu)建含有在沒有任何啟動子序列的情況下編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的報道基因，并因此用作陰性對照。
-圖II圖解表示了含有受CaMV雙35S啟動子(d35S CaMV)(也叫做35S增強啟動子(ep35S))控制的編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的基因的構(gòu)建物，它用作強啟動子的參比對照；-圖III表示了用作瞬時表達實驗的內(nèi)部參照的構(gòu)建物，包括受35SCaMV啟動子控制的編碼熒光素酶的報道基因；-圖IV圖解表示了得自來自豌豆質(zhì)體藍素基因的整個啟動子(petEprom)的本發(fā)明嵌合啟動子的幾種優(yōu)選實施方案的結(jié)構(gòu)，也表示了來自豌豆質(zhì)體藍素基因的整個啟動子(petE prom)的結(jié)構(gòu)。確定為MPr1098、MPr1097和MPr1096的啟動子對豌豆質(zhì)體藍素基因的整個啟動子的酶消化得到，而確定為MPr1108、MPr1109、MPr1110、MPr1111和MPr1112的啟動子通過基于配體的PCR(1b-PCR)得到。MPr1143和MPr1153分別通過缺失啟動子MPr1111的“as-2”和“as-1”盒得到，和通過在啟動子MPr1143的上游融合MPr1108的“as-1樣”和“nos增強子樣”盒得到。將產(chǎn)生的所有啟動子克隆到載體pMRT1144中的限制位點PstI和BamHI之間，以得到具有編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的報道基因uidA的轉(zhuǎn)錄融合體；-圖V表示了煙草葉中不同構(gòu)建物在瞬時表達后的相對啟動子活性的對比圖。轟擊3天后，將這些煙草葉磨碎并通過離心得到澄清的粗提物。用熒光測定法測量粗提物試樣的β-葡糖醛酸糖苷酶和熒光素酶活性，并確定GUS/LUC活性的比率。直方圖相當于所示構(gòu)建物的平均比率加上或減去普及標準誤差(MSE)；-圖VI圖解表示了煙草植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后嵌合啟動子活性的對比圖。所有初級轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到溫室中后，于第2、4、6、8和10周時采集樣品，測量每個樣品的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，并利用蛋白質(zhì)總含量進行估量，得到GUS活性，以rlu/mg蛋白質(zhì)表示。在發(fā)育的每個階段，將每一系列初級轉(zhuǎn)化體的活性按減小的順序排序并彼此進行比較。
在各圖中，某些術(shù)語和表達方式具有以下含義-uidA＝編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的序列；
-IV2＝patatin基因內(nèi)含子；-nos term＝來自胭脂氨酸合酶基因的終止子；-35S term＝來自CaMV的35S RNA的終止子；-B＝內(nèi)切核酸酶限制位點BamHI；-E＝內(nèi)切核酸酶限制位點EcoRI；-H＝內(nèi)切核酸酶限制位點HindIII；-P＝內(nèi)切核酸酶限制位點PstI；-Sp＝內(nèi)切核酸酶限制位點SphI；-as-1＝來自CaMV 35S啟動子的活化序列1；-as-2＝來自CaMV 35S啟動子的活化序列2；-nos E＝來自胭脂氨酸合酶啟動子的活化盒；-D＝內(nèi)切核酸酶限制位點DraIII；-H＝內(nèi)切核酸酶限制位點HindIII；-P＝內(nèi)切核酸酶限制位點PstI；-S＝內(nèi)切核酸酶限制位點SpeI；-Sp＝內(nèi)切核酸酶限制位點SphI；-CAAT＝“CAAT”盒；-G＝“G”盒；-TATA＝“TATA”盒；-+1＝轉(zhuǎn)錄起始位點；-“…樣”是指與序列從其得到名稱的參比序列不是100％相同的序列。
優(yōu)選實施方案的詳細描述實施例11.比較構(gòu)建物(對照)為了能夠比較本申請中所述的嵌合表達啟動子，將編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，1986年)并含有來自馬鈴薯patatin的ST-LS1基因的IV2內(nèi)含子的核酸序列(Vancanneyt等，1990年)的uidA基因(uidA-IV2)置于一種啟動子和來自胭脂氨酸合酶基因(nos term)的終止子的控制下。這種構(gòu)建物然后通過克隆到由Promega公司(Madison，USA)出售的質(zhì)粒載體pGEM3Z中而轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中。
1.1.陰性對照pMRT1144的構(gòu)建為了促進克隆，生產(chǎn)只具有“uidA-IV2/nos term”序列而沒有任何啟動子序列的得自pGEM3Z的質(zhì)粒載體。將這種質(zhì)粒命名為pMRT1144并用作陰性對照(圖I)。為了將uidA/nos term序列引入pGEM3Z質(zhì)粒中，在豌豆質(zhì)體藍素基因的整個啟動子和胭脂氨酸合酶終止子的控制下從5μg質(zhì)粒pGA492-PpetE分離uidA序列。pGA492-PpetE質(zhì)粒通過將從質(zhì)粒pKHn2得到的來自豌豆質(zhì)體藍素基因的petE啟動子(Pwee和Gray，1993)代替來源于bpI221-Pem2質(zhì)粒的em2啟動子(Gaubier等，1993年)克隆到質(zhì)粒pGA492-Pem2-uidA中得到。bpI221-Pem2質(zhì)粒在37℃下用各20單位的酶HindIII和EcoRI消化1小時。然后，表達框“Pem2/uidA/nosterm”通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水中并插入質(zhì)粒pGA492(An，1986)的HindIII和EcoRI位點之間。連接在1.0μl T4 10XDNA連接酶緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下進行16小時。轉(zhuǎn)化有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細菌(Hannahan，1983)。在添加了四環(huán)素(12mg/l)的Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB，細菌用胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，NaCl 10g/l，瓊脂15g/l)上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照Birnboim和Doly的堿裂解法(Bimboim和Doly，1983)提取并通過酶消化進行分析。
從由此得到的pGA492-Pem2-uidA質(zhì)粒開始，通過用HindIII和XbaI雙重消化除去啟動子Pem2。所研究的質(zhì)粒片段通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，按照制造商的建議在37℃下接受DNA聚合酶I的克列諾片段(New England Biolabs)作用30分鐘。然后，其通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最終用1體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白質(zhì)，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，并再懸浮于水。之后，其在37℃下借助10單位的小牛腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim)按照制造商的建議去磷酸化1小時，通過用1體積的苯酚萃取、然后用1體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最終用1體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白質(zhì)，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水中。所得質(zhì)粒命名為pGA492ΔPem2。
并列地，對應(yīng)于豌豆質(zhì)體藍素基因的啟動子的petE啟動子(818個堿基對)通過在37℃下用NcoI消化1小時而從質(zhì)粒pKHn2得到。該828bp啟動子片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水中，然后按照制造商的建議在30℃下接受5單位的綠豆核酸酶(New EnglandBiolabs)作用30分鐘，通過用1體積的苯酚萃取、然后用1體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最終用1體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白質(zhì)，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，再懸浮于水。如前所述，將這種啟動子片段在1.0μl T410X DNA連接酶緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小時而插入到質(zhì)粒pGA492ΔPem2中。轉(zhuǎn)化有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細菌。在添加了四環(huán)素(12mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pGA492-petE prom。
為了分離表達框“petE prom/uidA/nos term”，5μg質(zhì)粒pGA492-petEprom用PstI(在質(zhì)體藍素基因啟動子上的5′位點)和EcoRI(在終止序列上的3′位點)在37℃下消化1小時，進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳并按照制造商的建議在Qiaquick親和柱(Qiagen，Hilden，Germany)上純化。另外，500ng質(zhì)粒pGEM3Z同時在37℃下用EcoRI和PstI(存在于多克隆部位或多接頭中的限制位點)消化1小時，接受0.8％凝膠電泳，然后在Qiaquick親和柱上純化。
連接用50ng載體pGEM3Z-PstI/EcoRI和50ng表達框“petE prom/uidA/nos term”在18℃下在12μl反應(yīng)介質(zhì)中在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(NewEngland Biolabs)的存在下進行1夜。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α通過與連接反應(yīng)混合物混合而轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pGEM3Z-petE prom。
為了將來源于馬鈴薯patatin基因的192bp IV2內(nèi)含子插入到uidA編碼序列中，將該基因的內(nèi)部部分(pGEM3Z-petE prom中的BstBI 710bp片段)切除，然后用含有IV2內(nèi)含子的同等序列(SnaBI/BstBI 902bp片段)取代。為此，質(zhì)粒pGEM3Z-petE prom在37℃下用SnaBI(位于uidA基因的ATG起始子密碼子上游的+383bp位的限制位點)消化1小時，然后在65℃下用BstBI(位于+1093bp位的限制位點)消化1小時。缺失了710bp的質(zhì)粒通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。對應(yīng)于IV2內(nèi)含子序列的BstBI/SnaBI 902bp片段再加上從383延伸至1093bp位的uidA序列從質(zhì)粒pSCV1.2-GI分離并純化。按照克隆中常用的和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，質(zhì)粒pSCV1.2-GI得自質(zhì)粒pSCV1.2，它又依次得自由G.A.Edwards于1990年構(gòu)建的質(zhì)粒pSCV1。雙元質(zhì)粒pSCV1.2通過帶有表達框“35S prom/nptll/nos term”的HindIII片段(Fromm等，1986)在pSCV1的HindIII位點的克隆得到。表達框“35Sprom/GUS-IV2/35S term”通過如Vancanneyt等(1990)所述在37℃下用HindIII消化質(zhì)粒p35S GUS INT達1小時而得到。對應(yīng)于該表達框的DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，電洗脫，然后在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥并再懸浮于水中。該片段的5′突出端按照制造商的建議在37℃下用DNA聚合酶I的克列諾片段(New England Biolabs)鈍化30分鐘，并且該片段通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白質(zhì)，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘后，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥并最終在1.0μl T410X DNA連接酶緩沖液(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下作用16小時而與事先在25℃下用SmaI消化了1小時的20ng質(zhì)粒pSCV1.2連接。轉(zhuǎn)化先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細菌。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。
5微克(5μg)pSCV1.2-GI質(zhì)粒在37℃下用SnaBI(位于uidA基因ATG起始密碼子上游+383bp位的限制位點)消化1小時，然后在65℃下用BstBI(位于+1285bp位的位點)消化1小時。該902bp片段通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。連接用20ng載體pGEM3Z-petE prom BstBI/SnaBI和80ng 902bp片段BstBI/SnaBI在18℃下在10μl反應(yīng)介質(zhì)中在1.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的從這些克隆得到的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pGEM3Z-petE prom/IV2。
為了從質(zhì)粒pGEM3Z-petE prom/IV2除去對應(yīng)于818bp片段(petE)的啟動子序列，該質(zhì)粒在37℃下用BamHI消化1小時，然后在37℃下用PstI消化1小時，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。該質(zhì)粒的5′突出端按照供應(yīng)商的建議用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。連接用10ng由此修飾的質(zhì)粒在18℃下以12μl的反應(yīng)體積在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取，通過酶消化進行分析，并按照Sanger等(1977)所述方法通過測序檢定。所得質(zhì)粒命名為pMRT1144(圖I)。
1.2.陽性對照啟動子MPr1092的構(gòu)建為了得到參比啟動子序列，將“雙35S”花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV D35S prom)置于uidA-IV2/nos term序列的上游。質(zhì)粒pMRT1092(圖II)由以下克隆步驟得到首先，如1.1部分中所述將馬鈴薯patatin基因的192bp IV2內(nèi)含子插入到uidA編碼序列的+383bp位。1微克量(1μg)的質(zhì)粒bpI221(Clontech，CA，USA)在37℃下用SnaBI消化1.5小時，然后在65℃下用BstBI消化1.5小時。缺失了710bp片段的質(zhì)粒通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
20納克(20ng)量的bpI221 BstBI/SnaBI載體和80ng如前所述來源于pSCV1.2-GI的902bp BstBI/SnaBI片段在18℃下以10μl的反應(yīng)體積在1μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下連接1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α用一半的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為bpI221/uidA-IV2。
在第二步中，存在于bpI221/uidA-IV2質(zhì)粒中的CaMV35S啟動子序列用“CaMV D35S”序列置換。為此，bpI221/uidA-IV2質(zhì)粒在37℃下用10單位的HindIII消化10.5小時，然后粘端通過DNA聚合酶I的克列諾片段(New England Biolabs)按照制造商的建議在37℃下作用30分鐘而鈍化。該反應(yīng)的產(chǎn)物在Qiaquick親和柱上純化后，DNA在37℃下用10單位的BamHI消化1夜。對應(yīng)于缺失828bp CaMV 35S啟動子片段的載體的質(zhì)粒片段通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
CaMV D35S prom從質(zhì)粒pJIT163D得到。該質(zhì)粒得自pJIT163質(zhì)粒，它又依次得自質(zhì)粒pJIT160(Guerineau和Mullineaux，1993)。質(zhì)粒pJIT163具有在多接頭的HindIII和SalI位點之間的ATG密碼子。為了除去該ATG并得到質(zhì)粒pJIT163D，pJIT163的質(zhì)粒DNA用HindIII和SalI消化，通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥，按照制造商的建議在37℃下接受DNA聚合酶I的克列諾片段(New England Biolabs)作用30分鐘，通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取并最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而去蛋白質(zhì)，在1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇的存在下在-80℃下沉淀30分鐘，然后以12000g離心30分鐘，用70％乙醇洗滌，干燥并最終在1.0μl T4 10X DNA連接酶(Amersham)和2.5單位的T4 DNA連接酶(Amersham)的存在下在14℃下連接16小時。轉(zhuǎn)化有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細菌。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。
10微克(10μg)質(zhì)粒pJIT163D在37℃下用10單位的KpnI(位于啟動子5′區(qū)中的位點)消化10.5小時，然后粘端用6單位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)在37℃下按照制造商的建議作用30分鐘而鈍化。該反應(yīng)的產(chǎn)物在Qiaquick親和柱上純化后，DNA在37℃下用10單位的BamHI消化1夜。所得對應(yīng)于CaMV D35S啟動子的761bp DNA片段通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。含有10ng質(zhì)粒載體、100ng 761bp片段、1.0μl T4 10X DNA連接酶(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的反應(yīng)混合物以10μl在18℃下連接1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α用一半的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pMRT1092(圖II)。
1.3.參比質(zhì)粒pCaMV35Sluc的描述用作瞬時表達的內(nèi)部參照的質(zhì)粒是pCaMV35Sluc(Torrent等，1997)，它含有在RNA 35S花椰菜花葉病毒啟動子和終止子控制下的熒光素酶報道基因(luc)的表達框。
實施例2含有來自豌豆質(zhì)體藍素基因的缺失啟動子序列的質(zhì)粒的構(gòu)建豌豆質(zhì)體藍素基因的整個啟動子(Last和Gray，1989年)對應(yīng)于從-771bp位延伸至+63bp位的834bp序列(SEQ.ID01)，其中已鑒定了幾個可能的調(diào)節(jié)序列(相對于序列的5′末端朝向3′末端并相對于轉(zhuǎn)錄起始位點+1所給出的數(shù)字，圖IV)-從-734延伸至-607bp位的一系列反向重復(fù)序列，-與存在于CaMV 35S啟動子中的活化序列1(as-1)具有一定相似性的20bp盒(as-1樣)，從-579bp位延伸至-559bp位，-與存在于根癌農(nóng)桿菌的胭脂氨酸合酶基因的啟動子中的活化序列具有一定同源性的21bp盒(nos增強子樣)，從-540bp位延伸至-519bp位，-從-201位延伸至-193bp位的8bp“G”盒，-與在高等植物的啟動子中發(fā)現(xiàn)的III型盒具有一定相似性的從-83位延伸至-69bp位的14bp盒，-在-63位的“CAAT”盒，-在-37bp位的“TATA”盒，
-轉(zhuǎn)錄起始點+1(1位)，-從+1位延伸至63bp位的5′未翻譯區(qū)。
質(zhì)粒pGEM3Z-petE prom如上所述在實施例1的1.1部分中得到。它對應(yīng)于在豌豆質(zhì)體藍素基因的整個啟動子(petE prom，圖IV，SEQ.ID01)控制下的含有報道基因uidA-IV2的質(zhì)粒pGEM3Z，并用作所有基于質(zhì)體藍素啟動子的構(gòu)建的參比啟動子。為了研究不同元件的作用，在petE prom的5’區(qū)中的缺失通過酶消化進行。
2.1.啟動子MPr1097的構(gòu)建啟動子MPr1097從petE啟動子通過反向重復(fù)序列以及212bp Sphl片段上的as-1樣盒(圖IV)的5’缺失得到。為此，5微克(5μg)質(zhì)粒pGEM3Z-petE/IV2在37℃下用20單位的SphI酶消化2小時，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
連接用25ng由此修飾的質(zhì)粒在18℃下在10μl反應(yīng)混合物中在1μlT4 10X DNA連接酶(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pMRT1097，命名為MPr1097的啟動子序列(SEQ.ID02)通過測序檢定。
2.2.啟動子MPr1096的構(gòu)建啟動子MPr1096從petE啟動子通過反向重復(fù)序列、由兩個403bp和105bp的SpeI片段分別帶有的“as-1樣”元件和“nos增強子樣”元件(圖IV)的5’缺失得到。為此，5微克(5μg)質(zhì)粒pGEM3Z-petE/IV2在37℃下用20單位的SpeI酶消化2小時，用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
連接用25ng由此修飾的質(zhì)粒在18℃下在10μl反應(yīng)混合物中在1μlT4 10X DNA連接酶(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pMRT1096，啟動子序列MPr1096(SEQ.ID03)通過測序檢定。
2.3.啟動子Mpr1098的構(gòu)建為了得到基于petE啟動子的最小參比啟動子序列，構(gòu)建只含有“TATA”和“CAAT”盒的207bp啟動子Mpr1098(圖IV)。
這通過以下步驟完成5微克(5μg)質(zhì)粒pGEM3Z-petE/IV2在37℃下用1.5單位的DraIII酶(存在于-128位的1個位點)和15單位的PstI酶(存在于啟動子5’區(qū)中-759bp位的1個位點)消化2小時。由此缺失了位于petE啟動子5’區(qū)中的631bp片段PstI/DraIII的質(zhì)粒通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。該片段的粘端通過6單位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)按照制造商的建議在37℃下作用30分鐘而鈍化。該反應(yīng)的產(chǎn)物在Qiaquick親和柱上純化后，連接用25ng由此修飾的質(zhì)粒在18℃下在10μl反應(yīng)混合物中在1μl T410X DNA連接酶(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pMRT1098，啟動子序列MPr1098(SEQ.ID04)通過測序檢定。該序列對應(yīng)于最小豌豆質(zhì)體藍素啟動子(圖IV)。
實施例3含有嵌合啟動子序列的質(zhì)粒的構(gòu)建除了通過缺失某些5’區(qū)得到的啟動子外，從基本的最小啟動子MPr1098開始，使用結(jié)合了稱為LCR(Barany，1991)并借助“定向”寡脫氧核苷酸生產(chǎn)單鏈連續(xù)DNA的連接鏈式反應(yīng)和生產(chǎn)雙鏈DNA產(chǎn)物的PCR反應(yīng)的1b-PCR技術(shù)合成一系列啟動子。
3.1.啟動子MPr1108的構(gòu)建啟動子MPr1108(圖IV)通過使用1b-PCR技術(shù)將petE啟動子(SEQ.ID.01)的從-641bp位延伸至-569bp位并帶有“as-1樣”和“nos增強子樣”盒的72bp序列與Mpr1098的187bp最小啟動子序列(-128到+59bp，SEQ.ID04)融合來制備。
連續(xù)單鏈DNA借助以下定向寡脫氧核苷酸形成-S1＝5′TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG3′(SEQ.ID12)-S2＝5′CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID13)-S3＝5′CATAATTTGAACACTCTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID14)-S4＝5′GGAATCTGCAGTTGAACACGTACAAACTTACGTCATTTGTGCATGCAGAAGCATAGAGCTGAGCACACAATT3′(SEQ.ID15)100微微摩爾(100pmol)的寡脫氧核苷酸S1、S2和S3通過在5μl10X激酶(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下用15單位的激酶(Amersham)在37℃下作用30分鐘而5’磷酸化。磷酸化的寡脫氧核苷酸通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而純化，接著用1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇在-80℃下沉淀20分鐘，然后以16060g離心30分鐘。沉淀的寡脫氧核苷酸用70％乙醇洗滌，干燥，然后以10pmol/μl的濃度再懸浮于水中。
為了連接“定向”寡脫氧核苷酸，使用以下“引導(dǎo)”寡脫氧核苷酸-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID18)-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID19)-G3＝5′CAGAGTGTTCAAATTATGAATTGTGTGCTCAGC3′(SEQ.ID20)為了進行LCR反應(yīng)，10pmol的磷酸化“定向”寡脫氧核苷酸S1、S2、S3和S4在10pmol的“引導(dǎo)”寡脫氧核苷酸G1、G2和G3、5ul Taq10X DNA連接酶(New England Biolabs)和40單位Taq DNA連接酶(NewEngland Biolabs)的存在下進行連接。該連接反應(yīng)以GeneAmp PCRSystem 9700熱循環(huán)(Perkin Elmer，Norwalk，USA)進行。該反應(yīng)涉及以下步驟94℃下1分鐘，1個循環(huán)；和隨后8個相同循環(huán)，各自由下列步驟組成65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和最后37℃下10分鐘。然后該連接反應(yīng)混合物按照供應(yīng)商的建議在Qiaquick親和柱上純化。最后，所得單鏈DNA的PCR擴增以GeneAmp PCR System 9700熱循環(huán)在各100pmol的寡脫氧核苷酸探針5′GGAATCTGCAGTTGAACACGT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10ul Vent 10XDNA聚合酶緩沖液(New England Biolabs)和2單位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下進行。該DNA在94℃下變性5分鐘，接受各自由在95℃下30秒變性步驟、56℃下30秒雜交步驟和72℃下1分鐘延伸步驟組成的25個循環(huán)，然后在72℃下繼續(xù)延伸5分鐘。
該反應(yīng)混合物的DNA片段在37℃下用20單位的BamHI消化45分鐘，然后在37℃下用20單位的PstI消化1小時，最后在Qiaquick柱上純化。將它們插入到已在37℃下用BamHI酶消化1小時然后在37℃下用PstI酶消化了1小時的質(zhì)粒pGEM3Z-petE/IV2中，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在Qiaquick親和柱上純化，在37℃下在12μl“緩沖液3”10X(New England Biolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后在Qiaquick親和柱上純化。為了進行連接，使如上所述處理的25ng質(zhì)粒和100ng通過PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接觸1夜。有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。由此得到的兩個質(zhì)粒pMRT1108和pMPR1109進行測序。質(zhì)粒pMRT1108含有預(yù)期啟動子(SEQ.ID05)，而質(zhì)粒pMRT1109帶有啟動子序列MPr1109(SEQ.ID06)，它與Mpr1108的不同在于缺失了5’未翻譯區(qū)中的33bp，+1位上游11bp(圖IV)。
3.2.啟動子Mpr1110的構(gòu)建啟動子MPr1110通過在MPr1098啟動子(SEQ.ID04)的-99bp位插入含有“G”盒(從petE啟動子的-204bp位延伸至-186bp位，SEQ.ID01)的18bp模塊并向該修飾最小啟動子序列中融合入來自RNA35S花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV)的含有as-1和as-2元件(Lam，1989；Lam等，1989)的44bp序列來制備(圖IV)。MPr1110利用1b-PCR技術(shù)合成。
單鏈連續(xù)DNA借助以下“定向”寡脫氧核苷酸形成-S1＝5′TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG3′(SEQ.ID12)-S2＝5′CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID13)-S5＝5′CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID16)-S6＝5′CATGCTGCAGACTAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID17)100微微摩爾(100pmol)寡脫氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl10X激酶緩沖液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下借助15單位的激酶(Amersham)5′磷酸化30分鐘。這些磷酸化的寡脫氧核苷酸通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而純化，接著用1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇在-80℃下沉淀20分鐘，然后以16060g離心30分鐘。沉淀的寡脫氧核苷酸用70％乙醇洗滌，干燥，然后以10pmol/μl的濃度再懸浮于水中。為了連接“定向”寡脫氧核苷酸，使用以下“引導(dǎo)”寡脫氧核苷酸-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID19)-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID20)-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID22)為了進行LCR反應(yīng)，10pmol的磷酸化“定向”寡脫氧核苷酸S1、S2、S5和S6在10pmol的“引導(dǎo)”寡脫氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq10X DNA連接酶緩沖液和40單位Taq DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下連接。該連接反應(yīng)以GeneAmp PCR System 9700熱循環(huán)(PerkinElmer，Norwalk，USA)進行。它的組成為94℃下1分鐘，1個循環(huán)；和8個相同循環(huán)，各自由下列步驟組成65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和最后37℃下10分鐘。然后該連接反應(yīng)混合物按照供應(yīng)商的建議在Qiaquick柱上純化。
最后，所得單鏈DNA的PCR擴增以GeneAmp PCR System 9700熱循環(huán)在各100pmol下列寡脫氧核苷酸探針5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和2單位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下進行。該DNA在94℃下變性5分鐘，接受各自由在95℃下30秒變性步驟、56℃下30秒雜交步驟和72℃下1分鐘延伸步驟組成的25個循環(huán)，然后進一步在72℃下延伸5分鐘。
該反應(yīng)混合物的DNA片段在37℃下用20單位的BamHI酶消化45分鐘，然后在37℃下用20單位的PstI酶消化1小時，最后在Qiaquick柱上純化。將它們插入到已在37℃下用BamHI酶消化1小時然后在37℃下用PstI酶消化了1小時的質(zhì)粒pGEM3Z-petE/IV2中，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在Qiaquick親和柱上純化，在37℃下在12μl“緩沖液3”10X(New England Biolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后在Qiaquick親和柱上純化。為了進行連接，使如上所述處理的25ng質(zhì)粒和100ng通過PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接觸1夜。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。質(zhì)粒pMRT1110帶有的啟動子序列MPr1110通過測序檢定(SEQ.ID07)。
3.3.啟動子MPr1111的構(gòu)建啟動子MPr1111通過在MPr1098(SEQ.ID04)的-99bp位插入含有“G”盒(從petE啟動子的-204bp位延伸至-186bp位，SEQ.ID01)的18bp元件并向該最小啟動子中融合入對應(yīng)于CaMV 35S的as-2元件(Lam和Chua，1989)和as-1元件(Lam等，1989)的復(fù)本的58bp序列來制備。MPr1111(圖IV)利用如前所述的lb-PCR技術(shù)合成。
單鏈連續(xù)DNA使用以下“定向”寡脫氧核苷酸產(chǎn)生-S1＝5′TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAGAGGATCCCCG3′(SEQ.ID12)-S2＝5′CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTCTCTCTTTCGA3′(SEQ.ID13)-S5＝5′CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCACACATCTTAGCCA3′(SEQ.ID16)-S7＝5′CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT3′(SEQ.ID18)100微微摩爾(100pmol)寡脫氧核苷酸S1、S2和S5在37℃下在5μl10X激酶緩沖液(Amersham)和500pmol ATP(Sigma)的存在下通過使用15單位的激酶(Amersham)在5′區(qū)中磷酸化30分鐘。這些磷酸化的寡脫氧核苷酸通過用適當體積的苯酚萃取、然后用適當體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)萃取和最終用適當體積的氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)萃取而純化，接著用1/10體積的3M醋酸鈉pH4.8和2.5體積的無水乙醇在-80℃下沉淀20分鐘，然后以16060g離心30分鐘。沉淀的寡脫氧核苷酸用70％乙醇洗滌，干燥，然后以10pmol/μl的濃度再懸浮于水中。為了連接“定向”寡脫氧核苷酸，使用以下“引導(dǎo)”寡脫氧核苷酸-G1＝5′TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA3′(SEQ.ID19)-G2＝5′GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG3′(SEQ.ID20)-G4＝5′TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT3′(SEQ.ID22)為了進行LCR反應(yīng)，10pmol的磷酸化“定向”寡脫氧核苷酸S1、S2、S5和S7在10pmol的“引導(dǎo)”寡脫氧核苷酸G1、G2和G4、5μl Taq10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和40單位Taq DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下連接。該連接反應(yīng)以GeneAmp PCRSystem 9700熱循環(huán)(Perkin Elmer，Norwalk，USA)進行。它的組成為94℃下1分鐘，1個循環(huán)；和8個相同循環(huán)，各自由下列連續(xù)步驟組成65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和最后37℃下10分鐘。然后該連接反應(yīng)混合物按照供應(yīng)商的建議在Qiaquick柱上純化。
最后，所得單鏈DNA的PCR擴增以GeneAmp PCR System 9700熱循環(huán)在各100pmol寡脫氧核苷酸探針5′CATGCTGCAGACTAGTGGATT3′和5′CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3′、各50nmol的dNTP、10μl Vent 10X DNA聚合酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和2單位的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)的存在下進行。該DNA在94℃下變性5分鐘，接受各自由在95℃下30秒變性步驟、56℃下30秒雜交步驟和72℃下1分鐘延伸步驟組成的25個循環(huán)，然后繼續(xù)在72℃下延伸5分鐘。
該反應(yīng)混合物的DNA片段在37℃下用20單位的BamHI消化45分鐘，然后在37℃下用20單位的PstI消化1小時，最后在Qiaquick柱上純化。將它們插入到事先已在37℃下用BamHI酶消化1小時然后在37℃下用PstI酶消化了1小時的質(zhì)粒pGEM3Z-petE/IV2中，接受0.8％瓊脂糖凝膠電泳，在Qiaquick親和柱上純化，在37℃下在12μl“緩沖液3”10X(New England Biolabs)和5000單位的小牛腸堿性磷酸酶(CIP，NewEngland Biolabs)的存在下去磷酸化1小時，最后在Qiaquick親和柱上純化。為了進行連接，使如上所述處理的25ng質(zhì)粒和100ng通過PCR得到的DNA片段在1.2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下在18℃下接觸1夜。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得兩個質(zhì)粒pMRT1111和pMRT1112進行測序。質(zhì)粒pMRT1111含有預(yù)期啟動子MPr1111(SEQ.ID08)，而在質(zhì)粒pMRT1112中，啟動子MPr1112(圖IV)與MPr1111的不同在于缺失了從-127位延伸至-89位的含有“G”盒的35bp和位于-78和-76位的2bp(SEQ.ID09)。
3.4.啟動子Mpr1153的構(gòu)建啟動子MPr1153(圖IV)通過將petE啟動子的從-582bp位延伸至-510bp位并帶有“as-1樣”和“nos增強子樣”元件的78bp序列(SEQ.ID01)融合到通過附加含有“G”盒的18bp元件進行了修飾的啟動子Mpr1098中得到。
為此，質(zhì)粒pMRT1111在37℃下用20單位的PstI酶和1單位的DraIII酶消化1小時。由此缺失了含有CaMV的2個“as-2”元件和“as-1”元件的72bp片段的質(zhì)粒用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。含有petE啟動子的2個“as-1樣”元件和“nos增強子樣”元件的78bp PstI/DraIII片段通過10μg質(zhì)粒pMRT1108用20單位的PstI酶和1單位的DraIII酶在37℃下消化1小時而產(chǎn)生，然后該片段利用Nu-Sieve 3％瓊脂糖凝膠電泳(FMC，Rockland，USA)分離并最終在Quiaquick親和柱上純化。
連接用20ng載體pMRT1111 pstI/DraIII和80ng 78bp片段在18℃下在10μl反應(yīng)混合物中在1.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行1夜。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pMRT1153，啟動子序列MPr1153(SEQ.ID10)通過測序檢定。
3.5.啟動子MPr1143的構(gòu)建啟動子MPr1143(圖IV)通過除去帶有MPr1111的“as-2，as-2，as-1”元件的72bp序列得到。這通過下列步驟實現(xiàn)質(zhì)粒pMRT1111在37℃下同時用20單位的PstI酶和1單位的DraIII酶消化1小時。由此缺失了含有CaMV的2個as-2元件和as-1元件的70bp片段的質(zhì)粒用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。該片段的末端按照供應(yīng)商的建議通過Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)的作用鈍化。該片段在18℃下在含有20ng載體、1.0μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)的10μl反應(yīng)混合物中再連接1夜。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了氨芐青霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。這些克隆之一的啟動子序列MPr1143(SEQ.ID11)通過測序檢定。
實施例4含有啟動子MPr1151、MPr1149、MPr1170和Mpr1092的雙元質(zhì)粒的構(gòu)建對于含有MPr1111、MPr1098、MPr1143和MPr1092的各種表達框來說雙元載體的制備是相同的。25μg量的質(zhì)粒pGA492(An，1986)用80單位的HindIII酶在37℃下消化1小時，然后在Qiaquick親和柱上純化。該質(zhì)粒的5′突出端按照供應(yīng)商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。由此修飾的質(zhì)粒用80單位的EcoRI酶在37℃下消化1小時，然后所得缺失了291bp片段的載體在0.7％瓊脂糖凝膠上分離，并在Qiaquick親和柱上純化。
4.1.pMRT1151的生產(chǎn)表達框“MPr1111/uidA-IV2/nos term”插入雙元質(zhì)粒pGA492的修飾HindIII位點。它從事先用80單位的PstI酶在37℃下消化1小時并在Qiaquick親和柱上純化的質(zhì)粒pMRT1111得到。該質(zhì)粒的5′突出端按照供應(yīng)商的建議使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，USA)鈍化。由此修飾的質(zhì)粒用80單位的EcoRI酶在37℃下消化1小時，然后對應(yīng)于表達框的2.5kb DNA片段在1％瓊脂糖凝膠上分離并在Qiaquick親和柱上純化。
連接通過將100ng如上所述制備的雙元質(zhì)粒pGA492和50ng表達框在18℃下以20μl的反應(yīng)體積在2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下混合在一起過1夜來進行。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了四環(huán)素(12mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化以及通過借助從雙元質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化DNA選出的寡脫氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和從uidA序列周圍的表達框選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′的基因擴增加以分析。所得克隆命名為pMRT1151。
4.2.雙元質(zhì)粒pMRT1149的生產(chǎn)表達框“MPr1143/uidA-IV2/nos term”按照與對質(zhì)粒pMRT1151所述的相同的方案在雙元質(zhì)粒pGA492的修飾HindIII位點克隆，不同的只是該表達框從質(zhì)粒pMRT1143分離。所得克隆命名為pMRT1149。
4.3.雙元質(zhì)粒pMRT1170的生產(chǎn)表達框“petE啟動子/uidA-IV2/nos term”按照與對質(zhì)粒pMRT1151所述的相同的方案在雙元質(zhì)粒pGA492的修飾HindIII位點克隆，不同的只是該表達框從質(zhì)粒pGem3Z-petE/IV2分離。
4.4.雙元質(zhì)粒pGA492MPr1092的生產(chǎn)將啟動子片段MPr1092和”uidA-IV2/nos term”序列插入如上所述制備的雙元質(zhì)粒pGA492中。這兩個片段以下列方式制備CaMV D35S啟動子通過10μg質(zhì)粒pJIT163Δ在37℃下用40單位的KpnI酶消化1小時而分離。該線型化質(zhì)粒的末端按照制造商的建議借助6單位的T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)在37℃下鈍化30分鐘。由此修飾的質(zhì)粒在Qiaquick親和柱上純化，然后用80單位的HindIII酶在37℃下再消化1小時。對應(yīng)于該啟動子的743bp片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
“uidA-IV2/nos term”序列通過4μg質(zhì)粒pMRT1092用40單位的HindIII酶和EcoRI酶消化1小時而得到。對應(yīng)于序列“uidA-IV2/nosterm”的2.2kb片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。
這三個片段之間的連接通過將100ng雙元質(zhì)粒、50ng啟動子片段和50ng對應(yīng)于“uidA-IV2/nos term”序列的片段以20μl的反應(yīng)體積、在2μl T4 10X DNA連接酶緩沖液(New England Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下混合而進行。培養(yǎng)通過使連接混合物經(jīng)受198個各自由“在30℃下培養(yǎng)30秒和在10℃下培養(yǎng)30秒”組成的循環(huán)而以熱循環(huán)進行。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細胞用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了四環(huán)素(12mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取，并通過酶消化以及借助從雙元質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化DNA選出的寡脫氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG3′和從“uidA”序列中的表達框選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG3′進行的基因擴增加以分析。保留的克隆之一命名為pGA492MPr1092。
4.5.雙元質(zhì)粒pMRT1182的生產(chǎn)雙元質(zhì)粒pMRT1182通過在雙元質(zhì)粒pMRT1118中插入啟動子片段CaMV D35S和序列uidA-IV2/term-nos得到。質(zhì)粒pMRT1118在以本申請人的名義于1999年9月3日提交的法國專利申請FR9911112中作了充分描述，該申請的具體說明結(jié)合在此作用參考。雙元質(zhì)粒pMRT1118(5971pb)通過利用AvrII酶消化將T-DNA片段引入到另一個去磷酸化質(zhì)粒(該質(zhì)粒也在同一申請人的前述在先申請中作了充分描述，并命名為pMRT1106，該文也具體結(jié)合在此作為參考)的AvrII位點中得到。為了實現(xiàn)插入，pMRT1106質(zhì)粒DNA(5μg)用AvrII酶消化，借助《QIAquick PCR Purification》試劑盒純化，然后用50單位的小牛腸堿性磷酸酶(New England Biolabs)以120μl終反應(yīng)混合物體積在12μl3×10緩沖液(New England Biolabs)的存在下在37℃下去磷酸化1小時，通過電泳在0.6％瓊脂糖凝膠上在TBE緩沖液中分離，用《QIAquick GelExtraction》試劑盒純化，在上述條件下用小牛腸堿性磷酸酶去磷酸化1秒鐘，最后用《QIAquick PCR Purification》試劑盒純化并轉(zhuǎn)移到50μl H2O中。
PCR連接反應(yīng)用32.5ng經(jīng)過消化的去磷酸化質(zhì)粒pMRT1106和50ng的以10μl反應(yīng)混合物體積在1μl T4 10x DNA連接酶緩沖液(NewEngland Biolabs)和400單位的T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行了消化的T-DNA片段進行。連接包含各自包括2個步驟的180個循環(huán)，第一個是在《GeneAmp PCR System 9700》熱循環(huán)中在10℃下進行30秒，第二個步驟是在30℃下進行30秒。
轉(zhuǎn)化先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細菌(Hanahan，1983)。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取(Bimboim et Doly，1979)并通過酶消化和測序加以檢定。所得質(zhì)粒命名為pMRT1118。
啟動子CaMV D35S通過10μg質(zhì)粒pJIT163Δ在37℃下連續(xù)用KpnI和HindIII酶消化1小時而分離。對應(yīng)于CaMV D35S的743bp片段在0.8％瓊脂糖凝膠上分離，然后在Qiaquick親和柱上純化?！皍idA-IV2/nosterm”序列通過質(zhì)粒pMRT1092用40單位的HindIII和EcoRI酶消化1小時而得到。對應(yīng)于所需序列的2.2kb片段在0.8％凝膠瓊脂糖上分離，然后在Qiaquick親和柱上純化。平行地，10μg雙元質(zhì)粒pMRT1118在37℃下連續(xù)用KpnI和HindIII酶消化1小時。該線型化載體片段然后在3X緩沖液的存在下在37℃下用40單位的小牛腸堿性磷酸酶(NewEngland Biolabs)去磷酸化1小時。連接在100ng雙元質(zhì)粒、50ng CaMVD35S片段和50ng對應(yīng)于“uidA-IV2/term-nos”的片段的存在下以20μl的反應(yīng)體積、在T4(lX)DNA連接酶緩沖液和400單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs)的存在下進行。培養(yǎng)如前所述以“GeneAmp PCRSystem 9700”熱循環(huán)通過PCR循環(huán)進行。先前制備的有活力且感受態(tài)的大腸桿菌DH5α細菌用一半連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化。在添加了卡那霉素(50mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取并通過酶消化進行分析。所得質(zhì)粒命名為pMRT1182。
質(zhì)粒pMRT1151、pMRT1149、pMRT1170和pMRT1182按照Holsters等(1978)描述的技術(shù)轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。在添加了利福平(50mg/l)和四環(huán)素(5mg/l)的LB培養(yǎng)基上選出的所得克隆的質(zhì)粒DNA按照堿裂解法提取，通過向細胞再懸浮緩沖液中加入溶菌酶(25mg/ml)進行修飾。所得質(zhì)粒DNA通過酶消化以及借助從雙元質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化DNA選出的寡脫氧核苷酸5′ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3′和從“uidA”序列周圍的表達框選出的5′TTGATTTCACGGGTTGGG 3′進行的基因擴增加以分析。所得農(nóng)桿菌克隆用于進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化。
實施例5使用瞬時表達技術(shù)測量和對比不同啟動子的表達水平。
5.1煙草的體外培養(yǎng)物，葉制劑。
瞬時表達實驗用6周大的煙草葉(Nicotiana tabacum L.)品種bpD6進行。煙草cv.bpD6的成熟種子在飽和次氯酸鈣溶液(70g/l)中滅菌10分鐘，然后用無菌去離子水沖洗三次5分鐘。將這些無菌種子置于MS20培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)上并在培養(yǎng)室中培養(yǎng)6周(恒溫24℃，光周期為16小時陰暗/8小時光，發(fā)光強度為200μmol光子.m-2.sec-1)。
為了避免葉肉細胞在轉(zhuǎn)化過程中分裂，在用基因槍轉(zhuǎn)化前24小時從6周大的煙草植物bpD6上切下幾片主葉，并將其面朝上附著地置于溫和的質(zhì)壁分離BY3培養(yǎng)基上(MS鹽4，4g/l，肌醇100mg/l，硫胺1mg/l，KH2PO4200mg/l，蔗糖30g/l，山梨糖醇45，5g/l，2，4 D 1mg/l，pH5.8)。
5.2.用嵌合構(gòu)建物的DNA包被的金顆?；驑屴D(zhuǎn)化需要優(yōu)先將DNA包被到直徑為0.6mm的球形金珠上，這些金珠已用無水乙醇(99.98％，小于0.02％的水)滅菌10分鐘，用無菌去離子水洗滌4次，并最終在最高-20℃下在50％甘油溶液中儲存最多4周。
在轉(zhuǎn)化過程中所用的所有對照和實驗質(zhì)粒的濃度都調(diào)節(jié)至1mg/ml。在每個轉(zhuǎn)化實驗中，共同轉(zhuǎn)化內(nèi)部參比對照(pCaMV35Sluc)，以使不同實驗間GUS活性的差異正?；?Leckie等，1994)。
DNA向事先制備好的金珠上的包被在無菌容器中在層流條件下進行。1.8mg無菌珠粒在30μl 50％甘油中的懸浮液試樣在渦旋機中充分混合1分鐘，然后與含有4μg要測試的質(zhì)粒之一和2μg參比質(zhì)粒pCaMV35Sluc的20μl DNA懸浮液一起混合10秒。然后加入20μl 2.5MCaCl2并用力混合10秒。接著向該混合物中加入20μl 0.1M亞精胺并將整個混合物在渦旋下再攪拌30秒。這些珠粒通過將該混合物在冰中培養(yǎng)15分鐘繼續(xù)進行DNA包被，然后包被的珠粒以低速率離心5秒并用無水乙醇洗滌兩次。洗滌后，將這些包被的珠粒再懸浮于32μl無水乙醇中，接受超聲處理三次，每次2秒鐘，在渦旋機中用力混合15秒，然后立即在按照制造商的建議制備的Biolistic PDS-1000/He系統(tǒng)(BioRad，Hercule，USA)中所用的無菌大載體圓盤上分成4等份試樣。大載體支持物和帶有沉積珠粒的大載體的整個排列放置干燥5分鐘。
5.3煙草葉組織的轟擊和瞬時表達按照一般制造商(BioRad，Hercule，USA)關(guān)于裝置的不同組件的操作和裝配的建議借助Biolistic PDS-1000/He系統(tǒng)進行對煙草葉的轟擊。每片葉子用下列條件連續(xù)轟擊兩次-用于加速金珠的氦壓等于6200kPa(900psi)。
-將植物樣品置于距離珠粒加速區(qū)9cm處。
-轟擊在27mm汞的真空中進行。
轟擊完后，將這些葉子置于BY3培養(yǎng)基中并在培養(yǎng)室中在黑暗中在24℃下培養(yǎng)48小時。這種培養(yǎng)使得引入到細胞中的轉(zhuǎn)基因能夠瞬時表達。
5.4使用組織化學(xué)染色評估不同啟動子的活性β-葡糖醛酸糖苷酶表達的揭示如Jefferson等(1987)所述通過組織化學(xué)染色進行。在培養(yǎng)室中培養(yǎng)48小時后，將每片葉子沿著中棱軸切成兩半。半片葉子在β-葡糖醛酸糖苷酶染色緩沖液(5-溴，4-氯，3-吲哚基葡萄糖醛酸化物(X-Gluc)500mg/l，在0.1M，pH7.0磷酸鹽緩沖液中的0.05％ Triton x100)中在37℃下培養(yǎng)48小時，而另半片在液氮中冷凍，然后保存在-80℃下。
染色后，通過將這些葉子分別浸到兩份95％乙醇浴中3小時和12小時進行漂白，然后用蒸餾水沖洗并在兩張玻璃紙之間平展干燥。
不同構(gòu)建物的啟動子活性通過每片葉子在用總量為2μg的帶有GUS報道基因的DNA轟擊兩次后所顯示出的藍色斑點的數(shù)量來評估。
鑒定出三類啟動子。用啟動子MPr1096、MPr1098、MPr1108、MPr1109、MPr1143和MPr1153轟擊的葉子都顯示出平均小于30個藍色斑點。用啟動子petE、MPr1097和MPr1110轟擊的葉子都顯示出在50至150之間的藍色斑點數(shù)。最后，用MPr1111和參比啟動子MPr1092轟擊的葉子有非常大的平均藍色斑點數(shù)，一般大于200。
總之，嵌合啟動子MPr1110和MPr1111使得β-葡糖醛酸糖苷酶能夠以大于或等于用整個petE啟動子達到的水平進行表達；且MPr1111顯示出至少比得上用強組成型參比啟動子D35S prom得到的啟動子活性。
5.5.利用發(fā)光酶測定量化不同啟動子對β-葡糖醛酸糖苷酶的表達將冷凍的半片葉子在乳缽中磨碎，然后讓這些粉末以1ml緩沖液對200mg植物組織的比例融解在提取緩沖液(Tris磷酸鹽25mM pH7.8，二硫蘇糖醇2mM，1，2-二氨基環(huán)己烷N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中。使該混合物均勻后在冰中培養(yǎng)15分鐘，然后通過以16060g離心5分鐘使澄清。
借助“GUS-光化學(xué)發(fā)光報道基因測定”檢測試劑盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照供應(yīng)商的建議測量20μl澄清的粗制葉提取物的GUS活性。光發(fā)射的測量借助Lumat LB-9507發(fā)光計(EGG-Berthold，BadWildbad，Germany)進行。
借助“熒光素酶測定系統(tǒng)”檢測試劑盒(Promega Corp.，Madison，USA)按照供應(yīng)商的建議測量20μl粗制葉提取物的熒光素酶活性。光發(fā)射的測量借助Lumat LB-9507發(fā)光計完成。
結(jié)果呈現(xiàn)在圖V中。對于每項實驗(1片受過轟擊的葉子＝1份粗提物)，計算利用發(fā)光計測量的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和熒光素酶活性間的比例。確定所給構(gòu)建物不同實驗的均值和平均標準誤差。
這些啟動子可以按照從最弱(第1組)開始到最強表達(第6組)的遞增順序分成6組-第1組包括啟動子MPr1108和MPr1109(圖IV)。由這些啟動子帶來的表達似乎與用不含啟動子的構(gòu)建物pMRT1144(圖I)得到的區(qū)別非常小?！癮s-1樣”和“nosE樣”盒融合到最小啟動子MPr1098(圖IV)中得到MPr1108，這只稍微降低了由MPr1098促進的平均表達。該結(jié)果似乎提示由這些盒和它們在MPr1108中的位置引起的抑制劑作用非常小。啟動子MPr1109帶來基本上與用啟動子Mpr1108得到的相同的表達。位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游、即5’未翻譯區(qū)的序列的缺失看來沒有改變用Mpr1108得到的表達。
-第2組包括啟動子MPr1098、MPr1143和MPr1112(圖IV)。啟動子MPr1098和MPr1143顯示出近似活性。啟動子MPr1143從在最小啟動子MPr1098中距離“CAAT”盒36bp的“G”盒的插入得到。這種盒的出現(xiàn)看來對用啟動子MPr1098得到的表達沒有明顯作用。啟動子MPr1112包括“CAAT”盒的上游，“as-2”盒的復(fù)本，接著是來源于CaMV的啟動子35S的“as-1”盒。這些元件自己看來無助于表達率的提高，它們帶來的表達率與用啟動子Mpr1098得到的基本上相同。
-第3組包括啟動子MPr1096和MPr1097(圖IV)。由這兩種啟動子帶來的表達是相同的。MPr1096是通過帶有“nosE樣”盒的片段SphI-SpeI和帶有來自petE啟動子(圖IV)的序列增強子的1個區(qū)域的MPr1097的SpeI-SpeI的缺失得到的，這種缺失看來不影響表達率。在啟動子MPr1096中，在31bp petE序列增強子的前面并在距離“CAAT”盒122bp處的“G”盒的存在看來使得用MPr1098得到的表達率增加了2.5倍。應(yīng)當注意到MPr1143的情況，在28bp petE序列增強子前面在距離“CAAT”盒36bp處的“G”盒的存在沒有使用MPr1098得到的表達率增加。因此，似乎“G”盒和“CAAT”盒之間的距離會影響表達率。
-第4組包括用作參照的啟動子petE(圖IV)。
-第5組包括啟動子MPr1110(圖IV)。在啟動子MPr1143的上游as-2和as-1盒的融合得到了啟動子MPr1110，這使得表達率有相當大的增加，比用petE啟動子得到的高很多(高1.4倍)?？磥怼癎”、“as-1”和“as-2”盒一起對表達有積極的正向協(xié)同作用。
-第6組包括啟動子MPr1111(圖IV)和MPr1092(

圖1)。啟動子MPr1111帶來與參比雙35S CaMV啟動子(MPr1092)類似的表達率。“as-2”元件或盒的加入大大增加了相對于用MPr1110得到的表達率(增加了1.7倍)。這些元件看來協(xié)同起作用?！癮s-2”盒的復(fù)本也增加這種作用。總之，嵌合啟動子MPr1110使得β-葡糖醛酸糖苷酶能夠以平均大于或等于整個petE啟動子的水平表達。啟動子MPr1111具有比得上用參比啟動子D35S得到的平均活性的啟動子活性。
這些結(jié)果與用相同啟動子轟擊的葉子的組織化學(xué)染色后觀察到的那些結(jié)果一致。
CaMV D35S啟動子在文獻中一般報道為是強啟動子。本發(fā)明的嵌合啟動子使GUS報道基因的啟動子活性比參比啟動子CaMV 35S(Kay等，1987)的增加了8-12倍。另外，Mpr1111構(gòu)成了迄今所述的煙草葉中最具活性和最強的嵌合啟動子之一。較小強度的啟動子可以用作與編碼選擇試劑的基因有關(guān)的啟動子，例如為了賦予抗生素抗性，例如用和“nos”型啟動子相同的方式。
實施例6穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后不同啟動子在煙草中的表達6.1.在煙草中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum L.，品種bpD6)的轉(zhuǎn)化通過按照Horsch等(1985)描述的方法用重組農(nóng)桿菌感染6周大的從煙草植物分離的葉片來進行。轉(zhuǎn)化期間，陪替氏培養(yǎng)皿在培養(yǎng)室中在下列條件下培養(yǎng)溫度為24℃，光周期為8小時黑暗/16小時光，發(fā)光強度為200μmol光子.m-2.sec-1，且除了開始的共培養(yǎng)步驟以外，整個callogenesis、再生和生根步驟都在添加了Augmentin(400mg/l)和卡那霉素(200或100mg/ml)的不同選擇培養(yǎng)基上進行；所用的不同步驟和培養(yǎng)基如下-共培養(yǎng)步驟持續(xù)3天，在用農(nóng)桿菌感染植物細胞期間，在添加了1mg/l芐氨基嘌呤和0.1mg/l吲哚-3乙酸的固體MS30共培養(yǎng)基(添加了維生素(Gamborg等，1968)4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖30g/l、瓊脂8g/l(Merck)，pH5.7的基于MS的培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962))上進行。
-芽尖形成步驟在培養(yǎng)室中持續(xù)4周，在添加了1mg/l芐氨基嘌呤、0.1mg/l吲哚-3乙酸、400mg/l Augmentin和200mg/l卡那霉素的固體MS20再生培養(yǎng)基(鹽和維生素MS 4.4g/l(Sigma，M0404)、蔗糖20g/l、瓊脂8g/l(Merck)，pH5.7)上進行。
-發(fā)育和生根步驟持續(xù)3周，在培養(yǎng)室中在添加了400mg/lAugmentin和100mg/l卡那霉素的固體MS20發(fā)育培養(yǎng)基上進行。
-移植到玻璃盆中的步驟在培養(yǎng)室中在添加了400mg/lAugmentin和100mg/l卡那霉素的固體MS20發(fā)育培養(yǎng)基上進行。
6.2.在煙草植物中穩(wěn)定表達后嵌合啟動子活性的比較初級轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到溫室中后第2、4、6、8和10周時測量其中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。對于每個植物，取3份樣品并匯集在試管中。一份樣品取自“老化”葉(位于基底的葉子)，一份來自成熟葉(位于中部的葉子)，一份來自位于植物頂端的幼葉。
每份樣品在液氮下在乳缽中磨碎，將這些粉末以1ml緩沖液對200mg植物粉末的比例再懸浮于提取緩沖液(Tris磷酸鹽25mM pH7.8，二硫蘇糖醇2mM，1，2-二氨基環(huán)己烷，N，N，N′，N′-四乙酸2mM，甘油10％，Triton X100 1％)中。使該物質(zhì)均勻后在冰上培養(yǎng)15分鐘，然后通過以16060g離心5分鐘使澄清。
借助“GUS-光化學(xué)發(fā)光報道基因測定”檢測試劑盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)按照制造商的建議測量20ml澄清的粗提物的GUS活性。光發(fā)射的測量使用Lumat LB-9507發(fā)光計(EGG-Berthold，Bad Wildbad，Germany)進行。
粗提物中的蛋白質(zhì)總量通過Bradford技術(shù)(Bradford，1976)使用“BioRad蛋白質(zhì)測定”試劑(BioRad，Munchen，Allemagne)按照制造商的建議進行評定。
不同種類植物中的報道基因活性用每種構(gòu)建物的20個轉(zhuǎn)化體并在植物生長和發(fā)育的整個期間進行分析。分析不在每個濃度下進行，因為所給種類的不同轉(zhuǎn)化體中的隨機插入位點和拷貝數(shù)不同。
嵌合啟動子MPr1111的結(jié)果與原始pPetE啟動子、最小MPr1143和參比MPr1092啟動子的結(jié)果進行比較，這顯示在圖VI中。
MPr1092參比植物中的GUS活性與在用基于質(zhì)體藍素的啟動子轉(zhuǎn)化的植物中觀察到的相比顯示出相當小的變化。植物轉(zhuǎn)移到溫室中后2至4周之間活性稍有降低；在6周時增加約4倍，8周時再次下降至4周時觀察到的值，最后在10周時稍有增加。對基于質(zhì)體藍素的啟動子的分析顯示無論考察的是哪種啟動子或植物，GUS活性有規(guī)律地在轉(zhuǎn)移到溫室中后從第2至6周增加，而在之后直到開花又下降。
GUS活性的這種表現(xiàn)與植物的發(fā)育相關(guān)，因為質(zhì)體藍素基因活躍地在光合組織中表達。因此pPetE和衍生啟動子的活性遵循植物的活躍生長期，是從轉(zhuǎn)移到溫室中開始到適應(yīng)環(huán)境后6-8周期間，接下來是從第8周直到開花的植物的緩慢發(fā)育期，這出現(xiàn)在轉(zhuǎn)移到溫室中后的10-12周。與此對照，已知是高活性組成型啟動子的參比MPr1092啟動子較小依賴于這些與發(fā)育有關(guān)的作用。
帶有嵌合啟動子MPr1143和帶有參比MPr1092的轉(zhuǎn)化體的比較顯示，無論在發(fā)育的哪個階段，“MPr1143植物”都顯示出與“D35S植物”相比非常低的GUS活性。這些數(shù)據(jù)表明MPr1143只能驅(qū)動在基礎(chǔ)水平上的報道基因的最小表達，并證實了瞬時表達實驗得到的結(jié)果，該結(jié)果顯示“G盒”自身插入到最小pPetE序列中不足以有效地促進表達。
帶有原始pPetE啟動子的轉(zhuǎn)化體與參比“MPr1092植物”的比較顯示植物轉(zhuǎn)移到溫室中后2周時，pPetE與參比物活性相同，在活躍的發(fā)育期間(從2至8周)活性要高3至4倍。這兩種啟動子之間的差異有規(guī)律地從轉(zhuǎn)移后的6周開始減小，在第10周時反轉(zhuǎn)，因為參比植物顯示出的平均活性比“pPetE植物”的大兩倍。這些數(shù)據(jù)沒有證實瞬時表達后得到的結(jié)果，在瞬時表達實驗中pPetE的活性比MPr1092的小2.5倍。
“MPr1111植物”與帶有pPetE的那些植物間的比較顯示直到第6周MPr1111的活性都比pPetE的平均低2至3倍，從那以后活性至少相同。在第8和第10周時，有一些“MPr1111個體”確實比“PetE個體”更具活性。在這種程度上，穩(wěn)定表達與瞬時表達相比導(dǎo)致了不同的結(jié)論，在瞬時表達中MPr1111比pPetE的活性平均高2.5倍。在植物轉(zhuǎn)移到溫室中后在從第4周到第8周的生長發(fā)育期里初級轉(zhuǎn)化體中的MPr1111顯示出比參比MPr1092更具活性，在第8周時活性最大高了2至3倍。
在這些時間過程分析的基礎(chǔ)上，我們可以得出結(jié)論啟動子各自的強度在植物的整個生長過程中不是靜止不變的，這可能是因不同的調(diào)節(jié)過程導(dǎo)致的。MPr1111是驅(qū)動報道蛋白GUS在植物轉(zhuǎn)移到溫室中后第8周時以最高水平表達的啟動子，因此看來是在煙草發(fā)育的這一階段用于大量異源蛋白的表達的最佳候選者。
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序列表<110>默里斯坦治療公司(MERISTEM THERAPEUTICS)<120>嵌合啟動子，它們的生產(chǎn)方法，以及含有它們的框、載體和轉(zhuǎn)基因植物<130>嵌合Ppc啟動子<140><141><160>22<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>834<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(834)<223>豌豆質(zhì)體藍素基因的petE啟動子的整個序列<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特導(dǎo)性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>1aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga actagtggat ctatgcaact tacaacgtgc 60actcgcggag gattggacgt gtgcaactta caacgtacgc attgttcgtc catacaatag 120tgtagaattg gacatgtgca acttacaaca tgtgcaactt acaacgtgcg ctcgcggagg 180aatgtgaagt tgaacacgta caacttacgt catttgtgca tgcagaagca tagagctgag 240cacacaattc ataatttgaa ggacacatga tttgctataa agaactcttt agaagtacca 300caactttgac tgagtttgat atagctaata aagatggagc tcattataat ttgaatggca 360taatcaagct aaacgaacaa gcttagttaa tcatgttaaa caacaattct ttgtaataat 420aaattgtctt tcaactagtc caagtttatg agttgattct tcggaataaa ttagaaaata 480tcttagactt tatacttcat tgattatttc atagagcaag taggagaaat aaaaatatac 540tagtattatt tactaaaaaa aatctaagcc acgtcggagg ataacatcca acccagccaa 600tcacagcaat gttcatcaga taacccactt taagcccacg cactctgtgg cacatctaca 660ttatctaaat cacatattct tccacacatc ttagccacac aaaaacccaa tccacatctt 720tatcatccat tctataaaaa atcaccttct gtgtgtctct ctttcgattc ccttcaaaca 780catacaaatt cagtagagaa gaaactcatt actcttgaga aacctagagg atcc 834<210>2<211>623<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(623)<223>啟動子MPr1097從啟動子petE通過重復(fù)反向序列以及212bp Sph1片段上帶有的as-1樣盒的5′缺失得到<220><223>啟動子MPr1097<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>2aagcttgcat gcagaagcat agagctgagc acacaattca taatttgaag gacacatgat 60ttgctataaa gaactcttta gaagtaccac aactttgact gagtttgata tagctaataa 120agatggagct cattataatt tgaatggcat aatcaagcta aacgaacaag cttagttaat 180catgttaaac aacaattctt tgtaataata aattgtcttt caactagtcc aagtttatga 240gttgattctt cggaataaat tagaaaatat cttagacttt atacttcatt gattatttca 300tagagcaagt aggagaaata aaaatatact agtattattt actaaaaaaa atctaagcca 360cgtcggagga taacatccaa cccagccaat cacagcaatg ttcatcagat aacccacttt 420aagcccacgc actctgtggc acatctacat tatctaaatc acatattctt ccacacatct 480tagccacaca aaaacccaat ccacatcttt atcatccatt ctataaaaaa tcaccttctg 540tgtgtctctc tttcgattcc cttcaaacac atacaaattc agtagagaag aaactcatta 600ctcttgagaa acctagagga tcc623<210>3<211>326<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(326)<223>啟動子MPr1096從啟動子petE通過由兩個SpeI 403bp片段帶有的“as-1樣”和“增強子樣”元件和重復(fù)反向序列5′缺失得到<220><223>啟動子MPr1096<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>3aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga actagtatta tttactaaaa aaaatctaag 60ccacgtcgga ggataacatc caacccagcc aatcacagca atgttcatca gataacccac 120tttaagccca cgcactctgt ggcacatcta cattatctaa atcacatatt cttccacaca 180tcttagccac acaaaaaccc aatccacatc tttatcatcc attctataaa aaatcacctt 240ctgtgtgtct ctctttcgat tcccttcaaa cacatacaaa ttcagtagag aagaaactca 300ttactcttga gaaacctaga ggatcc 326<210>4<211>207<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(207)<223>207bp的啟動子MPr1098只含有“TATA”和“CAAT”盒并對應(yīng)于啟動子petE上的最小參照啟動子<220><223>啟動子Mpr1098<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989300><30l>Pwee，K.H.
Gray，JohnC.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>4aagcttgcat gcctgctctg tggcacatct acattatcta aatcacatat tcttccacac 60atcttagcca cacaaaaacc caatccacat ctttatcatc cattctataa aaaatcacct 120tctgtgtgtc tctctttcga ttcccttcaa acacatacaa attcagtaga gaagaaactc 180attactcttg agaaacctag aggatcc 207<210>5<21l>28l<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(281)<223>啟動子MRr1108通過將帶有“as-1樣”和“nos增強子樣”元件的啟動子petE的72bp序列融合到MPr1098的187bp的最小啟動子序列中而得到<220><223>啟動子MPr1108<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>5aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg caatctaatt atctaaatca 120atattcttcc acacatctta gccacacaaa aacccaatcc acatctttat catccattct 180ataaaaaatc accttctgtg tgtctctctt tcgattccct tcaaacacat acaaattcag 240tagagaagaa actcattact cttgagaaac ctagaggatc c 281<210>6<211>250<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(250)<223>啟動子MPr1109與MPr1108的不同在于缺失了5′UTR中的33bp，+1點上游11bp<220><223>啟動子MPr1109<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>6aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg cacatctaca ttatctaaat 120cacatattct tccacacatc ttagccacac aaaaacccaa tccacatctt tatcatccat 180tctataaaaa atcacctttg tgtgtctctc tttcgattcc cttcaaacac atgagaaacc 240tagaggatcc 250<210>7<211>280<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(280)<223>啟動子MPr1110通過在MPr1098的-99bp位插入含有“G”盒的18bp元件并通過融合RNA 35S CaMV啟動子的44bp序列而得到<220><223>啟動子MPr1110<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>7aagcttgcat gcctgcagac tagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 60cgcatgccac tctgtggcac atctacatta tctaaatcta agccacgtcg gaggataaca 120tattcttcca cacatcttag ccacacaaaa acccaatcca catctttatc atccattcta 180taaaaaatca ccttctgtgt gtctctcttt cgattccctt caaacacata caaattcagt 240agagaagaaa ctcattactc ttgagaaacc tagaggatcc 280<210>8<211>303<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(303)<223>啟動子MPr1153通過融合從-582位延伸至-510bp位的通過加入“G”盒進行了修飾的啟動子petE的78bp序列而得到<220><223>啟動子MPr1153<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>8aagcttgcat gcctgcagtt gaacacgtac aaacttacgt catttgtgca tgcagaagca 60tagagctgag cacacaattc ataatttgaa cactctgtgg cacatctaca ttatctaaat 120ctaagccacg tcggaggata acatattctt ccacacatct tagccacaca aaaacccaat 180ccacatcttt atcatccatt ctataaaaaa tcaccttctg tgtgtctctc tttcgattcc 240cttcaaacac atacaaattc agtagagaag aaactcatta ctcttgagaa acctagagga 300tcc303<210>9<211>296<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(296)<223>啟動子MPr1111通過在MPr1098的-99bp位插入含有“G”盒的18bp元件并融合58bp序列(as2和as1元件的復(fù)本)而得到<220><223>啟動子MPr1111<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>9aagcttgcat gcctgcagac tagtgattga tgtgatatca agattgatgt gatatctcca 60ctgacgtaag ggatgacgca tgccactctg tggcacatct acattatcta aatctaagcc 120acgtcggagg ataacatatt cttccacaca tcttagccac acaaaaaccc aatccacatc 180tttatcatcc attctataaa aaatcacctt ctgtgtgtct ctctttcgat tcccttcaaa 240cacatacaaa ttcagtagag aagaaactca ttactcttga gaaacctaga ggatcc 296<210>10<211>220<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(220)<223>啟動子MPr1143(圖II)通過除去MPr1111的帶有元件“as-2，as-2，as-1”的72bp序列而得到<220><223>啟動子MPr1143<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>10aagcttgcat gccgtggcac atctacatta tctaaatcta agccacgtcg gaggataaca 60tattcttcca cacatcttag ccacacaaaa acccaatcca catctttatc atccattcta 120taaaaaatca ccttctgtgt gtctctcttt cgattccctt caaacacata caaattcagt 180agagaagaaa ctcattactc ttgagaaacc tagaggatcc 220<210>11<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向構(gòu)件S1<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>11ttcccttcaa acacatacaa attcagtaga gaagaaactc attactcttg agaaacctag 60aggatccccg 70<210>12<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向構(gòu)件S2<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的定向構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>12cacaaaaacc caatccacat ctttatcatc cattctataa aaaatcacct tctgtgtgtc 60tctctttcga 70<210>13<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向構(gòu)件S3<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的定向構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>13cataatttga acactctgtg gcacatctac attatctaaa tcacatattc ttccacacat 60cttagcca 68<210>14<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向構(gòu)件S4<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的定向構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>14ggaatctgca gttgaacacg tacaaactta cgtcatttgt gcatgcagaa gcatagagct 60gagcacacaa tt 72<210>15<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向構(gòu)件S5<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的定向構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>15ctgtggcaca tctacattat ctaaatctaa gccacgtcgg aggataacat attcttccac 60acatcttagc ca 72<210>16<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向構(gòu)件S6<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的定向構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>16catgctgcag actagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcatgcc 60act63<210>17<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>定向構(gòu)件S7<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的定向構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>17catgctgcag actagtgatt gatgtgatat caagattgat gtgatatctc cactgacgta 60agggatgacg catgccact79<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引導(dǎo)構(gòu)件G1<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的引導(dǎo)構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>18tgtgtttgaa gggaatcgaa agagagacac a 31<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引導(dǎo)構(gòu)件G2<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的引導(dǎo)構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>19gattgggttt ttgtgtggct aagatgtgtg 30<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引導(dǎo)構(gòu)件G3<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的引導(dǎo)構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>20cagagtgttc aaattatgaa ttgtgtgctc agc 33<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引導(dǎo)構(gòu)件G4<220><223>用于通過1b-PCR構(gòu)建啟動子的引導(dǎo)構(gòu)件寡核苷酸<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>21tgtagatgtg ccacagagtg gcatgcgt 28<210>22<211>259<212>DNA<213>人工序列<220><221>啟動子<222>(1)..(259)<223>啟動子MPr1112與MPr1111的不同在于缺失了含有“G”盒并從-127位延伸至-89位的35bp和缺失了位于-78和-76bp位的2bp<220><223>啟動子MPr1112<300><301>Last，D.I.
Gray，J.C.<302>質(zhì)體藍素是由豌豆單倍體基因組中的單拷貝基因編碼的<303>Plant Mol.Biol.<304>12<306>655-666<307>1989<300><301>Pwee，K.H.
Gray，John C.<302>豌豆質(zhì)體藍素啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因煙草植物中的細胞特異性但非全光調(diào)節(jié)的表達<303>Plant Journal<304>3<306>437-449<307>1993<400>22aagcttgcat gcctgcagac tagtgattga tgtgatatca agattgatgt gatatctcca 60ctgacgtaag ggatgacgca tgccactctg tggcacatct acattatccc acacatctac 120cacacaaaaa cccaatccac atctttatca tccattctat aaaaaatcac cttctgtgtg 180tctctctttc gattcccttc aaacacatac aaattcagta gagaagaaac tcattactct 240tgagaaacct agaggatcc 259
權(quán)利要求
1.包含至少一個得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的、具有SEQ.ID.No.01所述序列的核酸序列的嵌合表達啟動子。
2.按照權(quán)利要求1的嵌合啟動子，其中得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的核酸序列選自下列成員由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。
3.包含與至少1個“CAAT”盒、“TATA”盒和轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)上游操作性或功能性連接的“G”盒的嵌合表達啟動子。
4.按照權(quán)利要求3的嵌合表達啟動子，其中“G”盒位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)的-225位和-65位之間。
5.按照權(quán)利要求3的嵌合表達啟動子，其中“G”盒位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)的-201位和-115位之間。
6.按照權(quán)利要求3的嵌合表達啟動子，其中“G”盒位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)的-201位。
7.按照權(quán)利要求3的嵌合表達啟動子，其中“G”盒位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)的-115位。
8.按照權(quán)利要求3的嵌合啟動子，其中“G”盒是植物來源的。
9.按照權(quán)利要求3的嵌合啟動子，其中“G”盒從豌豆質(zhì)體藍素基因的啟動子得到。
10.按照權(quán)利要求3的嵌合啟動子，其中“G”盒從豌豆質(zhì)體藍素基因的petE啟動子得到。
11.按照權(quán)利要求3-10任一項所述的嵌合啟動子，其中它進一步包含操作性或功能性連接“G”盒上游的“nos E樣”盒。
12.按照權(quán)利要求3-11任一項所述的嵌合啟動子，其中它進一步包含至少一個與“G”盒操作性或功能性連接的“as1”或“as1樣”盒。
13.按照權(quán)利要求12的嵌合啟動子，其中該啟動子包含2個或多個鄰近或分離排列的“as1”或“as1樣”盒。
14.按照權(quán)利要求12或13的嵌合啟動子，其中該啟動子包含4個“as1”或“as1樣”盒。
15.按照權(quán)利要求12-14任一項所述的嵌合啟動子，其中“as1”或“as1樣”盒連接所述“G”盒的上游和下游，優(yōu)選連接其上游。
16.按照權(quán)利要求12-15任一項所述的嵌合啟動子，其中一個或多個“as1”或“as1樣”盒以反向順序排列，優(yōu)選以反向重復(fù)順序排列。
17.按照權(quán)利要求3-16任一項所述的嵌合啟動子，其中它進一步包含至少一個與“G”盒操作性連接的“as2”盒。
18.按照上述權(quán)利要求任一項所述的嵌合啟動子，其中該啟動子包含至少2個或多個“as2”盒，優(yōu)選4個“as2”盒。
19.按照權(quán)利要求18的嵌合啟動子，其中所述“as2”盒連接所述“G”盒的上游和下游，優(yōu)選連接其上游。
20.按照權(quán)利要求17-19任一項所述的嵌合啟動子，其中一個或多個“as1”或“as1樣”盒以反向順序排列，優(yōu)選以反向重復(fù)順序排列。
21.按照權(quán)利要求3-20任一項所述的嵌合啟動子，其中它包含至少一個選自下列成員的核酸序列由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。
22.包含至少一個與要表達的編碼要產(chǎn)生的多肽的核酸序列操作性或功能性連接的、得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的核酸序列的表達框，所述編碼核酸序列自身與轉(zhuǎn)錄終止核酸序列操作性或功能性連接，其中得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的核酸序列選自由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。
23.分離的啟動子核酸序列，其中該序列選自下列成員由SEQ.ID.No.02、SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06、SEQ.ID.No.07、SEQ.ID.No.08、SEQ.ID.No.09、SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所述的序列。
24.用于權(quán)利要求1-21或23任一項所述的嵌合表達啟動子或分離的啟動子核酸序列的定向脫氧核苷酸構(gòu)件，其中序列選自下列成員由SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的序列。
25.用于權(quán)利要求1-21或23任一項所述的嵌合表達啟動子或分離的啟動子核酸序列的引導(dǎo)脫氧核苷酸構(gòu)件，其中序列選自下列成員由SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的序列。
26.包含能夠引發(fā)編碼要產(chǎn)生的多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄的啟動子或啟動子核酸序列的載體，其中所述啟動子或啟動子核酸序列對應(yīng)于權(quán)利要求1-21或23任一項所述的嵌合表達啟動子或啟動子核酸序列。
27.按照權(quán)利要求26的載體，其中該載體選自下列成員由pMRT1151、pMRT1149、pMRT1170所述的雙元載體。
28.權(quán)利要求1-21或23任一項所述的嵌合表達啟動子或分離的啟動子核酸序列的制備方法，其中它包括以下步驟-進行稱作LCR的連接鏈式反應(yīng)，以從至少一個選自分別由SEQ.ID.No.12、SEQ.ID.No.13、SEQ.ID.No.14、SEQ.ID.No.15、SEQ.ID.No.16、SEQ.ID.No.17和SEQ.ID.No.18所述的“定向”脫氧核苷酸S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7的定向脫氧核苷酸構(gòu)件和至少一個用于所述啟動子核酸序列或啟動子的“引導(dǎo)”脫氧核苷酸構(gòu)件來生產(chǎn)連續(xù)單鏈DNA，所述引導(dǎo)構(gòu)件選自分別由SEQ.ID.No.19、SEQ.ID.No.20、SEQ.ID.No.21和SEQ.ID.No.22所述的“引導(dǎo)”脫氧核苷酸G1、G2、G3和G4；-對從前一步驟得到的單鏈DNA進行PCR擴增，以生產(chǎn)對應(yīng)于嵌合表達啟動子或啟動子核酸序列的雙鏈DNA；-可選地分離啟動子或啟動子核酸序列。
29.按照權(quán)利要求28的方法，其中脫氧核苷酸構(gòu)件在連接前磷酸化。
30.按照權(quán)利要求28的方法，其中連接在至少一種DNA連接酶的存在下以下列條件下的熱循環(huán)進行-在約94℃下約1分鐘的1個循環(huán)；-8個相同循環(huán)，每個由以下步驟組成-65℃下1分鐘，57℃下1分鐘，52℃下1分鐘，48℃下1分鐘，43℃下1分鐘和37℃下10分鐘。
31.具有穩(wěn)定整合到其基因組中的至少一個分別如權(quán)利要求1-21或23任一項所述的啟動子或至少一個啟動子核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。
32.按照權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因植物，其中該植物選自雙子葉植物，優(yōu)選馬鈴薯、煙草、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油菜籽、甜菜根或向日葵，或選自單子葉植物，優(yōu)選小麥、大麥、燕麥、稻米或玉米。
33.按照權(quán)利要求31或32任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物的繁殖體。
34.按照權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)基因植物繁殖體，其中該繁殖體是種子。
35.含有如權(quán)利要求1-21或23任一項所述的啟動子或啟動子核酸序列的細胞。
36.按照權(quán)利要求35的細胞，其中該細胞選自植物細胞、人類細胞、動物細胞、昆蟲細胞、細菌細胞、藻類細胞和真菌細胞，優(yōu)選是植物細胞。
37.編碼要產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因在細胞中的表達方法，其中所述方法包括以下步驟-用包含與編碼要產(chǎn)生的多肽的核酸序列或基因操作性連接的、如權(quán)利要求1-21或23任一項所述的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化細胞，其中所述編碼核酸序列自身與轉(zhuǎn)錄終止信號操作性連接；-在使得編碼多肽的核酸序列或基因能夠表達的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞，由此產(chǎn)生了多肽。
38.按照權(quán)利要求37的方法，其中細胞是原核細胞或真核細胞。
39.按照權(quán)利要求37或38任一項所述的方法，其中細胞選自微生物細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、動物細胞和植物細胞。
40.按照權(quán)利要求37-39任一項所述的方法，其中細胞是植物細胞。
41.權(quán)利要求31或32任一項所述的轉(zhuǎn)基因植物或權(quán)利要求33所述的繁殖體的生產(chǎn)方法，其中該方法包括以下步驟-用包含如權(quán)利要求1-21或23任一項所述的至少一個啟動子或至少一個啟動子核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細胞；-選出具有整合啟動子或啟動子核酸序列的植物細胞；-通過培養(yǎng)或通過再生整個嵌合或轉(zhuǎn)基因植物來繁殖轉(zhuǎn)化和選出的植物細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少1個得自豌豆質(zhì)體藍素基因啟動子的核酸序列的嵌合啟動子,該核酸序列優(yōu)選得自petE啟動子。本發(fā)明還涉及這類嵌合啟動子的生產(chǎn)方法,以及含有它們的表達框、載體、和轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號C07K14/415GK1351669SQ00807947
公開日2002年5月29日 申請日期2000年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月22日
發(fā)明者I·朗塞, V·格魯伯, M·泰森 申請人:默里斯坦治療公司