專利名稱：一種特異性吲哚類化合物及制備方法與其在治療和預(yù)防癌癥等疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一類引哚雜環(huán)化合物JN-2518系列，及其制備方法和醫(yī)藥學(xué)用途。這一系列化合物能特異性抑制細(xì)胞周期激酶活性，可用于治療和預(yù)防人和動物的惡性腫瘤等多種疾病。
背景技術(shù)：
由于流行病學(xué)的進(jìn)步，早期診斷和治療方法的進(jìn)一步改良，癌癥的治療和預(yù)防在過去的十多年中已取得顯著的成就。據(jù)美國腫瘤協(xié)會統(tǒng)計(jì)，自1999年開始，美國的腫瘤發(fā)病率已呈略為下降趨勢。盡管如此，在美國，腫瘤仍然是威脅人們生命的主要疾病之一。在我國，由于環(huán)境污染和人們的一些不良的生活習(xí)慣，惡性腫瘤的發(fā)病率仍持續(xù)上升。腫瘤對人們的威脅更大。雖然外科手術(shù)和放射治療的不斷成熟，新的治療方法如基因治療等的不斷出現(xiàn)，但迄今為止尚無一方法能取代化療。另一方面，由于現(xiàn)有的抗癌藥物，雖然具有一定療效，但它們大多是細(xì)胞毒藥物，具有嚴(yán)重的毒副作用。于是，發(fā)掘新型高效低毒的抗癌新藥，不僅僅具有挑戰(zhàn)性，而且也是無法回避的當(dāng)務(wù)之急。
腫瘤細(xì)胞，由于喪失了細(xì)胞周期運(yùn)作的調(diào)節(jié)功能而無限增殖。一個典型的細(xì)胞周期可分為G1，S，G2和M期(見圖1)。G1期，亦稱著間隙期(GAP)或DNA合成前期。對于哺乳動物細(xì)胞，G1期極為重要。該期為DNA復(fù)制提供各種蛋白。其中限制點(diǎn)(Restriction point，or R point)是控制細(xì)胞進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)，直接決定細(xì)胞去向，即細(xì)胞或是離開細(xì)胞周期進(jìn)入靜止期(Go)，如正?？稍偕慕M織器官及癌細(xì)胞在化療藥物的作用下進(jìn)入靜止期而躲避藥物的作用；或是進(jìn)入凋亡，如細(xì)胞在其DNA受損傷而無法修復(fù)時則在抑癌基因P53的作用下進(jìn)入凋亡；或是分化成熟不可逆地離開細(xì)胞周期，這是正常細(xì)胞組織生長成熟的主要途經(jīng)；或是越過限制點(diǎn)R，而周而復(fù)始地不斷進(jìn)入S，G2和M期而無限增殖(比如癌細(xì)胞)。
在細(xì)胞周期過程中，最關(guān)鍵控制整個細(xì)胞引擎的蛋白成份是細(xì)胞周期因子依賴的細(xì)胞周期激酶(下文簡稱細(xì)胞周期激酶或cdks)，細(xì)胞周期因子(Cyclins)和相應(yīng)的內(nèi)源性抑制蛋白(cdkI)。迄今為止，至少已發(fā)現(xiàn)了15種細(xì)胞周期因子，9種Cdks和二個家族的內(nèi)源性抑制蛋白。它們分別活動于不同的細(xì)胞周期階段。
典型的細(xì)胞周期激酶具有其由300多氨基酸組成的酶活性中心區(qū)，以及與細(xì)胞周期因子和內(nèi)源性抑制蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。細(xì)胞周期激酶必須與相應(yīng)的細(xì)胞周期因子結(jié)合，形成細(xì)胞周期因子/細(xì)胞周期激酶(Cyclin/Cdks)復(fù)合物才具有激酶活性，而該復(fù)合物若再與內(nèi)源性抑制蛋白cdkI結(jié)合，則激酶活性消失。Cyclin/Cdks復(fù)合物在細(xì)胞周期的特異階段形成，其活性是細(xì)胞周期不斷運(yùn)行所必不可少的。
研究表明，幾乎所有腫瘤細(xì)胞細(xì)都具有各種各樣的細(xì)胞周期激酶異常，或是細(xì)胞周期因子高度表達(dá)，或是細(xì)胞周期激酶高度活化，或是內(nèi)源性抑制蛋白缺失。例如，高達(dá)85％的乳腺癌病人CyclinD/Cdk4/6異常。于是，抑制細(xì)胞周期激酶，則可有效地阻止細(xì)胞增殖(但不是殺細(xì)胞)。進(jìn)而，或者促進(jìn)細(xì)胞分化成熟，或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療多種腫瘤的作用。可以認(rèn)為，細(xì)胞周期激酶抑制劑是一類新型的廣譜抗癌藥物。同時，由于它們是抑制細(xì)胞增殖(cytostatic)，而不是殺細(xì)胞(cytotoxic)，這類藥物應(yīng)具有較低的毒副作用?；诖?，尋找細(xì)胞周期激酶抑制劑已成為抗癌藥物研發(fā)的新策略。這類藥物，或是直接作用于細(xì)胞周期激酶的催化活性中心，或是間接地作用于細(xì)胞周期激酶信息通路。例如美國國立癌癥研究所(NCI)研發(fā)的Flavopiridol，目前正在臨床試用。雖然該化合物由于自身的化學(xué)穩(wěn)定性及選擇性等問題需要改進(jìn)外，但臨床前景仍令人興奮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于尋求一種特異性吲哚類化合物。這種化合物是細(xì)胞周期激酶抑制劑，能特異抑制細(xì)胞周期激酶，阻斷細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而可用于人和動物的多種疾病如惡性腫瘤等的治療和預(yù)防的JN-2518系列化合物，以及該系列化合物的制備方法和醫(yī)藥學(xué)用途；本發(fā)明的另一目的在于尋求一種特異性吲哚類化合物的制備方法；本發(fā)明的目的還在于提供一種特異性吲哚類化合物在治療和預(yù)防癌癥等疾病中所可能使用的藥劑學(xué)劑型?？捎糜趷盒阅[瘤及其它疾病的治療和預(yù)防。
其主要技術(shù)方案是該化合物的基本結(jié)構(gòu)式為 其中1.R1＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；2.R2＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；3.R3＝Cl，Br.F.
該化合物的另一結(jié)構(gòu)式為 其中1.R1＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；2.R2＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；3.R3＝Cl，Br.F.
該化合物的第3種結(jié)構(gòu)式為 其中1.R1＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；2.R2＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；3.R3＝Cl，Br.F.
該化合物的代表性結(jié)構(gòu)式為 該化合物的另一種代表性結(jié)構(gòu)式為
所述化合物的制備方法，其特征是以2-酮吲哚呤(3，0xindole)和吲哚滿二酮(4，Isatin)為基本原料，經(jīng)過氮乙?；磻?yīng)的化合物5和吲哚滿二酮的氯化中間體6在甲苯中進(jìn)行縮合得到化合物7，氮乙基化的產(chǎn)物8在酸性條件下去保護(hù)基(乙酰基)得化合物9，其化學(xué)反應(yīng)式為 在得到化合物9后，再與羥胺反應(yīng)得到產(chǎn)品1，其化學(xué)反應(yīng)式為 一種特異性吲哚類化合物的用途，其特征是該化合物能特異抑制細(xì)胞周期激酶活性，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，用于治療和預(yù)防惡性腫瘤等疾病。
所指的腫瘤包括各種白血病和各種實(shí)體瘤。
在使用時，可以是單藥治療，亦可以是聯(lián)合治療。聯(lián)合治療可以是與其它化療聯(lián)用，亦可以與中草藥聯(lián)用，或是與手術(shù)，放療，免疫治療，激素治療，基因治療等聯(lián)用。聯(lián)合治療可以是同時治療，亦可以是不同先后次序治療。
所述的其它疾病主要包括，但不限于，老年性癡呆，牛皮癬，心血管疾病，腎小球腎炎和愛滋病等。
JN-2518系列化合物作為藥用，可以采用任何給藥途經(jīng)，任何給藥方式。即可以口服，注射，吸入，透皮吸收，植入，腔邊，黏膜，以及靜脈滴注等。
JN-2518系列化合物作為藥用，可以制成片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，粉劑，針劑，噴霧劑，植入劑，拴劑，滴劑等多種劑型。
本發(fā)明通過MTT和SRB法，對人癌細(xì)胞的研究表明，JN-2518對乳腺癌，結(jié)腸癌，激素依賴型和激素非依賴型前列腺癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤都具有很好的抑制作用。尤為重要的是JN-2518對臨床上束手無策的激素非依賴型前列腺癌亦具有好的抑制作用。
本發(fā)明通過MTT法，對晚期前列腺癌患者腹水轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞的研究表明，NJ-2518在一線優(yōu)秀抗癌藥紫杉醇，柔紅霉素，異長春新鹼等產(chǎn)生耐藥的情況下，仍然有良好的療效。
本發(fā)明通過對大鼠W256乳腺癌抑瘤率比較的研究表明，JN-2518對W256有顯著的抗癌活性，而且該抗癌活性直接與給藥劑量成正比。
本發(fā)明通過對HUVEC和LNCAP細(xì)胞周期激酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，JN-2518能選擇性地抑制細(xì)胞周期激酶活性。
本發(fā)明通過對PARP蛋白降階和DNA梯型帶形成的研究，證實(shí)了JN-2518能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
JN-2518是一全新化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物，由于是特異的細(xì)胞周期激酶抑制劑，本專利直接將JN-2518用于治療和預(yù)防動物腫瘤。這里所述的動物主要指人，但不僅僅限于人，如亦適用于家禽等。同時，最近研究表明，許多其它疾病亦與細(xì)胞周期激酶異常有關(guān)，于是JN-2518亦可用于治療老年性癡呆，牛皮癬，心血管系統(tǒng)疾病和腎小球腎炎等。下文所舉的例子，僅僅是為了證明該項(xiàng)專利的實(shí)用性，而不是試圖限制該發(fā)明的應(yīng)用范圍。
應(yīng)該指出，JN-2518在腫瘤或其它疾病治療過程中，可以是單藥治療，亦可以是與2種，3種或更多藥物聯(lián)合治療，同時給藥，或不同先后次序給藥。這里所說的聯(lián)合治療，可以是與其它西藥，中草藥合并使用，或與激素治療，放射治療，免疫治療，化療，冷凍治療以及基因合并治療。
該項(xiàng)發(fā)明提供的藥物產(chǎn)品治療腫瘤及其它疾病，這些產(chǎn)品含有有效劑量的JN-2518和其它制藥工業(yè)所采用的一切適宜添加劑，以及各種適宜的給藥途經(jīng)。
嫻熟的藥物生產(chǎn)工藝包括使用無毒的制藥工業(yè)所接受的藥物前體為原料，采用多種方法合成JN-2518。嫻熟的藥物生產(chǎn)工藝還包括使用制藥工業(yè)所接受的溶劑作為JN-2518的溶媒，例如水，礦物油，食用油，二甲基亞砜，等。
JN-2518可制成口服給藥，局部用藥，吸入給藥，肛門給藥等劑型。使用無毒的制藥工業(yè)所接受的材料作為載體，附加劑，賦型劑。再次指出的是給藥方式可以是聯(lián)合用藥。可服給藥劑型包括片劑，膠囊，酊劑，錠劑，口服糖漿或其它一切適用劑型。
JN-2518可制成系統(tǒng)給藥劑型，包括皮下注射，皮內(nèi)注射，肌肉注射，靜脈注射，脊椎注射，鞘內(nèi)注射，或其它任何注射給藥和滴注。除此之外，JN-2518制劑除含有有效劑量的NJ-2518外，尚含有其它藥學(xué)上一切可用的無毒物質(zhì)。包括一種或多種載體，稀釋劑，附加劑，以及如果需要的話，其它藥用成份。
JN-2518可制成任何形式的口服劑型，包括片劑，錠劑，軟硬膠囊，可服水劑，酊劑，口服混懸液，粉劑，乳化劑等?？诜┬涂珊幸环N或多種甜味劑，矯味劑，顏色劑及防腐劑，以保證色彩完美和便于服用。
用于JN-2518片劑的賦型劑可以是墮性的稀釋劑，如碳酸鈣，碳酸鈉，乳酸鈣，磷酸鈣，磷酸鈉；制顆粒劑玉米淀粉，藻朊酸；粘合劑淀粉，明膠或是阿拉伯膠；滑潤劑硬脂酸，硬脂酸鎂或滑石粉。采用一切已知技術(shù)，制成包衣或無衣片劑。包衣劑型包括腸溶衣和緩釋劑型。用于緩釋劑型的材料可以是甘油單脂或甘油二脂鹽。
JN-2518膠囊可以是硬膠囊，亦可以是軟膠囊。用于硬膠囊的材料可以是碳酸鈣，磷酸鈣或高嶺土。用于軟膠囊的材料如水，油類包括花生油，橄欖油或液態(tài)石蠟。
JN-2518口服水型混懸液可將有效劑量的JN-2518與合適的稀釋劑配制而成。其稀釋混懸劑可以是羥甲基纖維素鈉或甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，藻酸鈉鹽，聚乙烯吡咯烷酮，西黃耆膠，阿拉伯膠。分散劑或濕潤劑包括天然磷脂，如卵磷脂，或烯烴氧化物與脂肪酸的縮合物，如17烷基乙烯氧化烷醇，或是乙烯與脂肪酸部分酯化縮合物，或是己糖醇如聚氧乙烯山梨醇單油酸鹽，或是氧化乙烯和脂肪酸部分脂肪縮合產(chǎn)物，以及乙醇酐，如聚乙烯山梨醇甲酯酸鹽。JN-2518口服水型混懸液也可能含有一種或多種防腐劑，如乙基對或鄰羥基苯安息香鹽；含一種或多種甜味劑，如蔗糖或糖精。
JN-2518油型混懸液可將有效劑量的JN-2518混懸于植物油中，如大豆油，花生油，橄欖油，芝麻油，可可油?；蚴堑V油，如液態(tài)石蠟。該制劑亦可含有稀釋劑，如蜂蠟，蠟，或十六烷醇，上文所述的甜味劑，以及矯味劑和穩(wěn)定劑，如抗氧化劑維生素C(抗壞血酸)。
采用如上所述的分散劑，濕潤劑，混懸劑，防腐劑，矯味劑，甜味劑，以及顏色劑，JN-2518亦可制成水包油型制劑。
JN-2518制成水包油型乳化劑。其油相可以是如上所述的植物油，如大豆油，橄欖油，花生油等。亦可以是液態(tài)石蠟，礦油，或是二類的混合物。乳化劑可以是天然的乳化劑，如金合歡膠，或是西黃耆膠，天然磷脂如大豆磷脂，卵磷脂，脂肪酸，己糖醇或酐的脂或半脂化物，如山梨糖單脂。亦可是人造化工材料，氧化乙烯半脂縮合物，如聚乙烯山梨醇單脂鹽。JN-2518的水包油型乳化制劑亦可含有甜味劑和矯味劑等。
JN-2518的糖漿劑和酊劑可采用甜味劑，如丙醇，丙二醇，山梨醇或蔗糖。該制劑亦可含有濕潤劑，防腐劑，矯味劑，顏色添加劑。
JN-2518的注射劑可采用無菌注射液或是油狀混懸液。其可運(yùn)用藥劑學(xué)上一切適用的分散劑，濕潤劑或混懸劑。該制劑可以是無菌透明液，使用藥劑學(xué)上一切適用的稀釋劑，如1，3-butanediol，水，Ringer’s溶液，或生理鹽水。此外，無菌油脂類亦可作為溶劑或混懸劑。其可以是合成的甘油單脂或二脂，脂肪酸，如油酸等。
JN-2518亦可制成拴劑，如肛門拴劑等。拴劑可由一定量的JN-2518與相應(yīng)的無刺激賦型劑組合而成。賦型劑在常溫下為固體，但在肛門體溫下液化而釋放藥物。適用的賦型劑包括可可脂和聚乙烯二醇類。
JN-2518的系統(tǒng)給藥劑型，根據(jù)所用載體濃度，可以是混懸型，亦可是溶解型。為了使用便利或減輕病人痛苦，可添加防腐劑，緩沖劑和局部麻醉劑。
JN-2518亦可作為獸醫(yī)用藥。為便于動物服用，含有JN-2518的制劑可加入動物詞料中或飲水中。亦可制成方便的劑型作為動物的食品或飲品。
對于人，在治療上述疾病時，JN-2518的劑量范圍初步定為每公斤體重0.01mg至15mg，或按人均體重60公斤計(jì)大約每天0.6mg至900mg。根據(jù)給藥方式，JN-2518可制成單一劑量劑型或多劑量劑型。劑量單位初步定為含有效成份1mg至500mg。
每日給藥次數(shù)依病種而定。多數(shù)情況下，每日不多于四次。應(yīng)指出的是，給藥劑量可能取決于多種因素，如年齡，體重，健康狀況，性別，飲食，以及給藥時間，途徑，病情，和藥物的聯(lián)合使用等。于是，最終給藥方案應(yīng)由醫(yī)生根據(jù)具體情況而決定。
該專利所提及的優(yōu)先化合物，有理想的藥理學(xué)性質(zhì)，其包括但不僅僅限于如下方面優(yōu)越的口服生物利用度，低毒性，低血漿蛋白結(jié)合率和理想的體內(nèi)外半衰期。雖然這類化合物能通過血腦屏障，這對治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是其優(yōu)點(diǎn)，但在治療外周疾病，較低的大腦血藥濃度更為理想。
與背景技術(shù)相比所具有的有益效果實(shí)驗(yàn)表明JN-2518能與細(xì)胞周期激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合。由于該化合物的兩個功能基團(tuán)能與酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)形成更多的氫鍵，于是比ATP有更大的親和力，進(jìn)而能更有效地與ATP竟?fàn)?，從而抑制該酶的活性。該化合物能抑制?xì)胞因子A，B和D所介導(dǎo)的細(xì)胞周期激酶活性，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對多種人體腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，半數(shù)有效抑制濃度在1-9μM之間。對大鼠實(shí)驗(yàn)性腫瘤W256的抑制率達(dá)70％。與美國國立癌癥研究中心研制的Flavopiridol相比，JN-2518具有以下特點(diǎn)1、Flavopiridol是黃酮類化合物，理化性質(zhì)較不穩(wěn)定。必須靜脈給藥。這對于需要長期給藥的病人，極不方便。而JN-2518理化性質(zhì)穩(wěn)定，不但口服有效，而且可制成多種劑型。
2、由于理化性質(zhì)較不穩(wěn)定，F(xiàn)lavopiridol在體內(nèi)易被代謝滅活。于是其體外活性不能反映體內(nèi)作用。JN-2518則不然。
3、Flavopiridol不但抑制細(xì)胞周期激酶，而且抑制蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)等多種維持正常細(xì)胞功能必不可少的蛋白激酶，于是其選擇性差，副作用多。而實(shí)驗(yàn)表明，JN-2518則是特異的細(xì)胞周期激酶抑制劑。
4、Flavopiridol具有黃酮類化合物的毒副作用，優(yōu)其是胃腸道刺激嚴(yán)重。而JN-2518母核化合物無此毒性作用，其它副作用輕微。
全新結(jié)構(gòu)的新化合物JN-2518，是一個很有發(fā)展前景的廣譜抗癌新藥。


圖1細(xì)胞周期分布，調(diào)控機(jī)理，關(guān)鍵的調(diào)控蛋白及其作用；圖2JN-2518對激素依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCAP作用-濃度依賴曲線及其與其它藥物的比較；圖3JN-2518及其它化療藥物對原代培養(yǎng)的B1011前列腺癌腹水轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的作用及其比較；圖4JN-2518對細(xì)胞周期激酶抑制作用；圖5JN-2518誘導(dǎo)PARP蛋白降階；圖6JN-2518誘導(dǎo)LNCAP細(xì)胞(A)和N2A細(xì)胞(B)DNA梯形帶的形成。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)例1JN-2518的化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)確證(一)材料與方法1.試劑2-酮吲哚呤(Oxindole)，吲哚滿二酮(Isatin)，碘乙烷，五氯化磷，鹽酸羥胺，乙酸酐以及甲苯等試劑購于美國Sigma-Aldrich化學(xué)試劑公司。
2.方法2-酮吲哚呤(3，0xindole)在乙酸酐中回流得到氮乙?；a(chǎn)物5。吲哚滿二酮(4，Isatin)和五氯化磷在苯溶液中反應(yīng)得到的氯化中間體6立即和化合物5在無水甲苯中回流2小時，得到的固體過濾后用甲苯和乙醇依次洗靜，在二甲基酰胺中重結(jié)晶得到化合物7，再在堿性條件下與碘乙烷反應(yīng)得氮烴化反應(yīng)產(chǎn)物8，氮乙基化的產(chǎn)物8在酸性條件下去保護(hù)基(乙酰基)得化合物9，最后再與鹽酸羥胺在20％的乙醇中反應(yīng)得到產(chǎn)品1。
(二)結(jié)果以質(zhì)譜，核磁共振，紅外等儀器確認(rèn)結(jié)構(gòu)得到產(chǎn)品1。
實(shí)驗(yàn)例2JN-2518對人癌細(xì)胞的抑制作用下文例舉的是JN-2518及其它優(yōu)先考慮的化合物(見圖2)對腫瘤治療的一些實(shí)例。在此我們再次重申，雖然我們僅僅以治療腫瘤為例，但這并不意味著這些化合物僅僅用于治療腫瘤。
(一)材料與方法試劑JN-2518及系列化合物，由我們實(shí)驗(yàn)室合成，以質(zhì)譜，核磁，紅外確認(rèn)結(jié)構(gòu)，以高壓液相色譜(HPLC)純化。純度為＞98.0％。JN-2518為暗紅色結(jié)晶粉末，分子量為305。實(shí)驗(yàn)時，以DMSO配成溶液，于-20℃保存。維甲酸，柔紅霉素，紫杉醇購于美國Sigma化學(xué)試劑公司。NS389，一新型環(huán)氧化物酶II抑制劑，購于美國生物分子研究實(shí)驗(yàn)室(Biomol.Research Lab)。實(shí)驗(yàn)用其它化學(xué)試劑，除特別說明外，均購于美國Sigma化學(xué)試劑公司。
細(xì)胞培養(yǎng)人癌細(xì)胞系，乳腺癌；MCF-7，SKBR-3；結(jié)腸癌；LDVO，DLD-1，前列腺癌雄激素依賴型LNCAP和雄激素非依賴型PC-3，DU145；神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2A細(xì)胞購于American Type Culture Collection。細(xì)胞置于37℃，5％CO2溫箱中，以含10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基。
MTT和SRBMTT和SRB實(shí)驗(yàn)方法如文獻(xiàn)所述[9]，簡述如下取對數(shù)生長期的癌細(xì)胞，接種于96-孔板中，細(xì)胞密度為每孔5000細(xì)胞/200μl。24小時后加入等系列稀釋的藥物。細(xì)胞在藥物作用下，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。每孔取出100μl的培養(yǎng)液后，加入50μl MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2.，5-diphenyltetrazolium bromide]溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時。以200μl鹽酸-異丙醇溶液溶解紫黑色的甲潛沉淀物，于540nm波長處測定光吸收值。若采用SRB法，則在72小時后，除去所有的培養(yǎng)液，細(xì)胞以10％三氯醋酸固定1小時后，置空氣中自然干燥24小時，加入50μlSRB(sulforhodamine B)染色20-30分鐘，以1％冰醋酸洗滌5次，置空氣中自然干燥后，加入200μl的10mMTris-HCl(pH10.0)溶液溶解紫紅色蛋白-SRB復(fù)合物，于600nm波長處測定光吸收值。求得各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，以實(shí)驗(yàn)組對對照組計(jì)算得細(xì)胞生成抑制率。以Sigma Plot繪圖軟件繪得細(xì)胞生長率——藥物濃度半對數(shù)曲線，并求得藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)。
(二)結(jié)果采用MTT及SRB二種分析方法，我們對JN-2518的抗癌活性進(jìn)行了研究。表1-3列出的是JN-2518及其它化療藥物對各種癌細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度。圖3是列舉的JN-2518及其它藥物對激素依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCAP作用的藥效-藥物濃度曲線。由表1-3及圖3可以看出，不管是乳腺癌(MCF-7，SKBR-3，表1)，結(jié)腸癌(LOV0，DLD-1，表2)，激素依賴型(LNCAP)和激素非依賴型前列腺癌(PC-3，DU-145，表3)，還是神經(jīng)母細(xì)胞癌(N2A，IC50 1.2μM)，對JN-2518都較為敏感，其半數(shù)有效抑制濃度IC50在1-9μM之間(見表1-3)，與臨床常見的化療藥物相似。這一結(jié)果說明JN-2518具有較強(qiáng)的抗癌活性。
表1JN-2518對乳腺癌細(xì)胞半數(shù)有效抑制濃度(IC50，μM)及與其它化療藥物的比較(MTT法)。

表2JN-2518對結(jié)腸癌細(xì)胞的半數(shù)抑制有效濃度(IC50，μM)及與其它化療藥物的比較(MTT法)。

表3JN-2518對前列腺癌細(xì)胞的半數(shù)抑制有效濃度(IC50，μM)及與其它化療藥物的比較(MTT法)。

(三)討論通過MTT和SRB實(shí)驗(yàn)，不難看出JN-2518具有較強(qiáng)的抗癌活性，其對癌細(xì)胞抑制作用比細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑維甲酸(Retinoid acid，IC5021.5-＞50μM)及新型環(huán)氧化物酶II抑制劑NS389(IC50＞200μM)強(qiáng)得多。JN-2518對激素依賴型前列腺癌細(xì)胞LNCAP的抑制作用亦大大強(qiáng)于臨床所常用的Casodex(IC5057.4μM)和Proscar(IC5040.6μM)。更為重要的是，對于臨床上束手無策的激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞(PC-3，DU-145)，JN-2518亦具有很好的抑制作用。相比之下，PC-3和DU-145細(xì)胞對紫杉醇敏感性則下降了近10倍。
神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2A細(xì)胞對JN-2518更為敏感，其IC50為1.2μM。由于該化合物為脂溶性結(jié)構(gòu)，有可能易于通過血腦屏障，進(jìn)而有利于腦瘤的治療。
雖然與柔紅霉素或紫杉醇相比，JN-2518抗癌作用弱些，但前者在有效的藥物濃度下即已產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用，如紫杉醇在血漿藥物濃度0.05μM時即產(chǎn)生嚴(yán)重的骨髓抑制。而JN-2518毒性很低，其前體化合物的小鼠LD50為3.9g/kg。
值得指出的是，由圖3不難看出，雖然LNCAP細(xì)胞對紫杉醇很為敏感，但實(shí)驗(yàn)很難測得其IC90，因?yàn)椴还軡舛榷啻?，總?5-20％左右的細(xì)胞不敏感。其原因可能是這些細(xì)胞在紫杉醇作用下，進(jìn)入G0期而躲避藥物的進(jìn)一步作用。與之相反，JN-2518有很好的療效-濃度曲線。這一結(jié)果也表明，JN-2518若與紫杉醇不同先后順序給藥，則可能產(chǎn)生顯著的協(xié)同作用。
此外，JN-2518對所試腫瘤細(xì)胞的IC50無顯著差異，這與其它化療藥物不同，如結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞對柔紅霉素較前列腺癌細(xì)胞敏感，這說明JN-2518作用于細(xì)胞生成的公共靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)例3JN-2518對前列腺癌腹水轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的作用(一)材料與方法試劑JN-2518見實(shí)驗(yàn)例1。柔紅霉素，紫杉醇，三氧化二砷(As2O3)，Triochstatin A(TSA)購于美國Sigma化學(xué)試劑公司。實(shí)驗(yàn)用其它化學(xué)試劑，除特別說明外，均購于美國Sigma化學(xué)試劑公司。
細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)的前列腺癌腹水轉(zhuǎn)移的人癌細(xì)胞B1011，是由病人腹水，通過離心收集癌細(xì)胞，于37℃，5％CO2溫箱中，以含10％胎牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)一周后，細(xì)胞生長快速而穩(wěn)定。取對數(shù)生長期的B1011癌細(xì)胞，以MTT法研究JN-2518的抗癌活性。
MTTMTT實(shí)驗(yàn)方法如上文所述。
(二)結(jié)果與討論B1011癌細(xì)胞來自于一晚期前列癌病人腹水。該病人已對激素和其它多種化療耐藥，為幫助病人選擇敏感化療藥物，我們將原代培養(yǎng)的癌細(xì)胞(B1011)接種于96-孔板，用不同的化療藥物進(jìn)行如上所述的MTT實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示。實(shí)驗(yàn)表明，B1011癌細(xì)胞對JN-2518較為敏感，其敏感程度較三氧化二砷(As2O3)略強(qiáng)(2.8μM對4.2μM)。但三氧化二砷毒性大，在臨床允許給藥劑量下，其有效血藥濃度達(dá)不到4.2μM。
對所試其它常用抗癌藥如紫杉醇，柔紅霉素，異長春新鹼等，B1011細(xì)胞都已耐藥。如LNCAP前列腺癌細(xì)胞對紫三醇IC50為0.35nM，但B1011細(xì)胞對該藥的IC50卻增至5nM。即，B1011細(xì)胞對紫杉醇敏感性下降了近15倍！B1011細(xì)胞對柔紅霉素和異長春新鹼的耐藥與紫杉醇相當(dāng)。相反，LNCAP和B1011細(xì)胞對JN2518的敏感性相當(dāng)(LNCAP IC50 2.59μM，對B1011，2.8μM)，說明JN2518不僅對早期的激素依賴型的前列腺癌有效，而且對晚期轉(zhuǎn)移的前列腺癌同樣有效。
實(shí)驗(yàn)例4JN-2518對大鼠W256乳腺癌的抗癌作用(一)材料與方法材料JN-2518，見實(shí)驗(yàn)例1-2。Wistar大鼠由美國國立癌癥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
方法藥物混懸液的配制取一定量的JN-2518于研缽中，加入數(shù)滴吐溫-100與藥物一起研磨，再加入足量的水研磨直至充分混懸后備用。
大鼠W256乳腺癌模型及給藥方案多年研究表明大鼠W256乳腺癌與人類腫瘤有較好的相關(guān)性，進(jìn)而有著廣泛的應(yīng)用[10，11]。于是本專利采用該模型，研究了JN-2518抗癌作用。取60-80克的Wistar大鼠40只，按體重隨機(jī)分為4組，每組十只，腋下接種1-2×106W256瘤細(xì)胞。接種后24小時，分別口服給予0，50，100mg/kg的JN-2518，每日一次，共十天。以環(huán)磷酰胺作為陽性對照(在第一天和第五天腹腔給予60mg/kg)。于最后一次給藥后24小時，處死動物，取出全部瘤塊稱重。以試驗(yàn)組的平均瘤重比對照組的平均瘤重，按(1-T/C)求得抑瘤率。以T檢驗(yàn)測定其顯著性差異。
(二)結(jié)果與討論如表4所示，JN-2518對W256有顯著的抗癌活性，其抗癌活性直接與給藥劑量成正比。在100mg/kg劑量下，JN-2518對W256的抑制率達(dá)70％以上。在相同試驗(yàn)條件下，環(huán)磷酰胺陽性對照組也顯示出較強(qiáng)的抗癌活性，但從動物的存活和體重變化可以看出，JN-2518在100mg/kg劑量下，無動物死亡，而且動物體重有所增加，無任何毒性跡象。而環(huán)磷酰胺組，不但動物的平均體重有所下降，而且有一大鼠在給藥后第八天死亡，顯示出明顯毒性。
表4，JN-2518對大鼠W256乳腺癌的抑制作用

*口服給藥(P.O.)； **腹腔給藥(I.P.)。
實(shí)驗(yàn)例5JN-2518對細(xì)胞周期激酶的抑制作用
(一)材料與方法材料蛋白電泳用聚丙酰胺凝膠試劑，SDS，電泳緩沖液，蛋白電轉(zhuǎn)移緩沖液，購于美國Bio-Rad生命科學(xué)公司。實(shí)驗(yàn)用其它化學(xué)試劑，除特別說明外，均購于美國Sigma化學(xué)試劑公司。試驗(yàn)用細(xì)胞周期激酶抗體，cdk2，cdk4，Cyclin D1等抗體購于Santa Cruz生物技術(shù)公司Protein Sepharose A+G購于癌基因Inc。[32P]-ATP購于PerkinElmer生命科學(xué)公司。
細(xì)胞培養(yǎng)見實(shí)驗(yàn)例2。
細(xì)胞周期激酶的抑制作用我們以HUVEC和LNCaP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究了JN-2518對細(xì)胞周期激酶和其它相關(guān)激酶作用。HUVEC和LNCaP細(xì)胞分別以含10％胎牛血清的EMB(endothelial cell basal medium)和RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細(xì)胞以給定濃度的JN-2518處理24小時。收集細(xì)胞，洗滌，并以文獻(xiàn)所述方法[12]提取總蛋白。將100μg蛋白在多種蛋白酶抑制劑存在下，于4℃下以cdk2，cdk4，Cyclin D1，ERK2等特異抗體進(jìn)行免疫沉淀過夜。該免疫沉淀復(fù)合物以緩沖液洗滌四次后再以測定細(xì)胞周期激酶活性的緩沖液洗滌一次。將免疫純化的細(xì)胞周期激酶以其緩沖液混懸，在[32P]-ATP(0.5μCi/100μM)存在下與組蛋白H1反應(yīng)10分鐘。磷酸化的組蛋白，其分別代表相應(yīng)的細(xì)胞周期激酶活性，經(jīng)分離純化后以X-衍射圖片記錄，以密度掃瞄儀定量。并與對照組相比，以(1-T/C)％求得抑制率。陽性對照組，細(xì)胞以不同濃度的PD98058(ERK1/2，足細(xì)胞分裂激酶特異抑制劑)處理，以同法測定酶活性。
(二)結(jié)果與討論圖5是JN-2518對細(xì)胞周期激酶和其它相關(guān)激酶作用的典型實(shí)例。實(shí)驗(yàn)表明采用上述細(xì)胞體系，JN-2518對細(xì)胞周期激酶cdk2，cdk4/6有顯著的抑制作用，其IC50在1.5-6.2μM之間。我們推測，如果采用純酶系統(tǒng)，這種抑制作用可能更明顯。但在相同條件下，該化合物對蛋白激酶C(PKC)，促細(xì)胞分立激酶(MAP kinase)等沒有影響，說明JN-2518對細(xì)胞周期激酶抑制作用具有較好的選擇性。雖然，根據(jù)半數(shù)有效濃度，JN-2518不如文獻(xiàn)所報(bào)道的Flavopiridol，其對純酶系統(tǒng)的細(xì)胞周期激酶1，2和4的半數(shù)有效濃度在10-9至10-8克分子濃度范圍內(nèi)[13]。應(yīng)指出的是，有些化合物采用純酶時，雖然有很好的活性，但其中有些化合物因不能通過細(xì)胞膜而無生物學(xué)活性，更不用說對整體動物有效。
實(shí)驗(yàn)例6JN-2518對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用由于PARP[Poly(ADP-ribose)-Polymerase]蛋白的降階及DNA梯形帶形成，是細(xì)胞凋亡的重要特征而被廣泛地用于細(xì)胞凋亡的研究[14，15]，我們對JN-2518誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行了研究。
(一)材料與方法材料DNA瓊脂糖凝膠，蛋白聚丙酰胺電泳所用試劑，購于美國Bio-Rad生命科學(xué)公司。實(shí)驗(yàn)用其它化學(xué)試劑，除特別說明外，均購于美國Sigma化學(xué)試劑公司。PARP單克隆抗體購于美國Pharmingen，A Becton Dickinson公司。蛋白印跡檢測試劑及其它用品購于美國Amershan生命科學(xué)公司。
細(xì)胞培養(yǎng)見實(shí)驗(yàn)例2。
細(xì)胞凋亡分析1)蛋白印跡法檢測PARP蛋白的降階將對數(shù)生長期的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N2A以不同濃度的JN-2518或20nM紫杉醇(陽性對照)處理48小時。收集細(xì)胞，洗滌，以文獻(xiàn)方法[16]提取蛋白，定量。取100μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙酰胺凝膠電泳。電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，以特異的PARP抗體進(jìn)行檢測，并以β-Actin抗體作為內(nèi)標(biāo)。所得X-衍射圖片以密度掃瞄儀定量。
2)JN-2518誘導(dǎo)DNA梯形帶形成將對數(shù)生長期的人前列腺癌細(xì)胞LNCAP和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N2A以不同濃度的JN-2518或紫杉醇(陽性對照)處理48小時。收集細(xì)胞，洗滌，以文獻(xiàn)方法[16]提取DNA，以2％瓊脂唐凌膠電泳分離DNA片段，照相記錄。
(二)結(jié)果與討論如前所述，抑制細(xì)胞周期激酶cdk4/6和其它細(xì)胞周期激酶如cdk2，則導(dǎo)致細(xì)胞周期運(yùn)行受阻，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分化，或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為證實(shí)這一推論，我們對JN-2518誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了觀察。
如圖6所示，在JN-2518作用下，110Kda的PARP蛋白帶明顯減少，而相同實(shí)驗(yàn)條件下，作為內(nèi)原性對照的β-Actin蛋白則無變化。這一結(jié)果說明JN-2518激活了細(xì)胞凋亡信息通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過DNA梯形帶形成實(shí)驗(yàn)，這一結(jié)論得到充分證實(shí)。
由圖7A和B可以看出，不管是LNCAP前列腺癌細(xì)胞，還是神經(jīng)母細(xì)胞N2A，JN-2518均能明顯引起DNA梯形帶形成。其作用強(qiáng)度與MTT實(shí)驗(yàn)相吻合，N2A細(xì)胞對DNA梯形帶形成較LNCAP細(xì)胞敏感，在藥物濃度小于5.0μM時，即能顯著誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA梯形帶。
結(jié)論我們初步實(shí)驗(yàn)表明，JN-2518及其本專利所列出的化合物是一類很有吸引力的抗癌化合物。它們是一類特異的細(xì)胞周期激酶抑制劑，阻斷腫瘤細(xì)胞周期的正常運(yùn)行，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對多種人的腫瘤細(xì)胞都具有較強(qiáng)的抗癌作用，其IC50在1至9μM之間。對實(shí)驗(yàn)性動物腫瘤亦有較強(qiáng)的抑制作用。于是JN-2518代表了一類新型的抗癌藥物。
權(quán)利要求
1.一種特異性吲哚類化合物，其特征是該化合物的基本結(jié)構(gòu)式為 其中1.R1＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；2.R2＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；3.R3＝Cl，Br.F.
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征是該化合物的結(jié)構(gòu)式為 其中1.R1＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；2.R2＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；3.R3＝Cl，Br.F.
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其特征是該化合物的結(jié)構(gòu)式為 其中1.R1＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；2.R2＝CH3，(CH2)nCH3，C2H4OH，n＝1-5；3.R3＝Cl，Br.F.
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其特征是該化合物的結(jié)構(gòu)式為
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其特征是該化合物的結(jié)構(gòu)式為
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物的制備方法，其特征是以2-酮吲哚呤(3，Oxindole)和吲哚滿二酮(4，Isatin)為基本原料，經(jīng)過氮乙?；磻?yīng)的化合物5和吲哚滿二酮的氯化中間體6在甲苯中進(jìn)行縮合得到化合物7，氮乙基化的產(chǎn)物8在酸性條件下去保護(hù)基(乙?；?得化合物9，其化學(xué)反應(yīng)式為
7.根據(jù)權(quán)利要求3或6所述的化合物的制備方法，其特征是在得到化合物9后，再與羥胺反應(yīng)得到產(chǎn)品1，產(chǎn)品1可以制成片劑或丸劑或膠囊劑或膏劑或霜劑或貼劑或粉劑或針劑或噴霧劑或植入劑或拴劑或滴劑；其化學(xué)反應(yīng)式為
8.一種特異性吲哚類化合物的用途，其特征是該化合物能特異抑制細(xì)胞周期激酶活性，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，用于治療和預(yù)防惡性腫瘤及其他疾病，同時適用于人和動物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征是所指的腫瘤包括各種白血病和各種實(shí)體瘤；其它疾病主要包括老年性癡呆，牛皮癬，心血管疾病，腎小球腎炎和愛滋病。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征是在使用時，可以是單藥治療，亦可以是聯(lián)合治療，聯(lián)合治療可以是與其它化療聯(lián)用，亦可以與中草藥聯(lián)用，或是與手術(shù)，放療，免疫治療，激素治療，基因治療等聯(lián)用，聯(lián)合治療可以是同時治療，亦可以是不同先后次序治療；并可采用口服或注射或吸入或透皮吸收或植入或腔邊或黏膜或靜脈滴注。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類系列有機(jī)雜環(huán)化合物，JN－2518系列化合物及其制備方法與其在治療和預(yù)防癌癥和其它疾病中的應(yīng)用。該系列化合物是通過有機(jī)合成反應(yīng)制得，應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。該系列化合物能特異地抑制細(xì)胞周期激酶活性，阻斷細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而能有效地抑制包括結(jié)腸癌，前列腺癌，乳腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種人體腫瘤細(xì)胞生長。該系列化合物毒副作用低，可用于治療人和動物多種疾病，包括惡性腫瘤，老年性癡呆，牛皮癬，心血管疾病，腎小球腎炎以及艾滋病等的治療和預(yù)防。
文檔編號C07D209/40GK1424312SQ02138518
公開日2003年6月18日 申請日期2002年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月29日
發(fā)明者王龍貴, 程景才 申請人:無錫杰西醫(yī)藥科技有限公司