專利名稱：一種從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)，具體地說是一種從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的日益成熟，越來越多的重組蛋白質(zhì)藥物被開發(fā)利用，由于生產(chǎn)過程中涉及到革蘭氏陰性菌及分離純化過程復(fù)雜，因此會(huì)造成內(nèi)毒素的污染。
親和技術(shù)是分離純化生物大分子的有效手段，主要利用配基與生物大分子之間的親和作用原理；將配基通過共價(jià)鍵鍵合到多孔介質(zhì)上就得到親和介質(zhì)，可以用來選擇性地吸附內(nèi)毒素，實(shí)現(xiàn)從重組蛋白質(zhì)溶液中去除內(nèi)毒素的目標(biāo)；已有的親和配基和親和介質(zhì)包括單克隆抗體，多克隆抗體，抗生素，多粘菌素B，聚乙烯亞胺，組氨酸，凝膠過濾柱，親和膜，顆粒吸附劑等。
由于重組蛋白質(zhì)種類較多，其分離純化步驟各不相同，生產(chǎn)過程中對(duì)其中的內(nèi)毒素含量要求也有差異，因此去除內(nèi)毒素的方法和效果無法完全通用。韓國(guó)專利(KR8902068)采用凝膠過濾柱Sephacryl S-200，利用分子篩原理來分離分子大小不同的內(nèi)毒素和干擾素，以除去干擾素中的內(nèi)毒素；但流速低，為4ml/hr，過程中需要添加其它物質(zhì)如Triton X-100。歐洲專利(EP0800862)采用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用離子交換的原理，來去除重組蛋白質(zhì)腫瘤壞死因子或白介素中的內(nèi)毒素，主要吸附重組蛋白質(zhì)。歐洲專利(EP0337243)使用串聯(lián)的兩只反相液相色譜柱，來純化重組人IL-2，在純化重組人白介素-2的同時(shí)，去除內(nèi)毒素雜質(zhì)，流速低，介質(zhì)昂貴。美國(guó)專利(US4885168)采用低分子量殼聚糖，利用殼聚糖上帶正電荷的氨基來與帶負(fù)電荷的核酸與內(nèi)毒素作用，達(dá)到除去核酸與內(nèi)毒素的目的，但殼聚糖的利用率低。中國(guó)專利(00123290.6)魏桂林等的一種用于內(nèi)毒素去除的疏水荷正電親和膜，將胺類疏水荷正電親和配基鍵合到纖維素膜上，得到相應(yīng)的親和膜；胺類疏水荷正電親和配基包括2～12碳的烴基二胺、帶有乙烯基的不飽和雜環(huán)化合物、帶有環(huán)氧基團(tuán)的季銨鹽及帶有多個(gè)疏水基團(tuán)的季銨鹽；其主要應(yīng)用于水中內(nèi)毒素的去除。D.Petsch，T.C.Beeskow等(1997，Journal of Chromatography B.693，79-91)采用去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，以微孔尼龍膜為介質(zhì)，制成親和膜；采用單張親和膜，可以去除緩沖液或牛血清白蛋白中的內(nèi)毒素；但流速低，阻力高，處理量少，不易放大。
針對(duì)干擾素制劑生產(chǎn)過程中的內(nèi)毒素，需要根據(jù)其分子量大小、等電點(diǎn)的范圍、溶液中其它物質(zhì)的含量和種類，來判斷和選擇親和配基的種類和親和介質(zhì)，達(dá)到去除內(nèi)毒素、又盡可能減少干擾素活性損失的目的?，F(xiàn)有技術(shù)的方法并不能滿足干擾素制劑生產(chǎn)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種流速較高，處理量大，符合生產(chǎn)要求的從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將殼聚糖，或去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，共價(jià)結(jié)合到多孔介質(zhì)上，以動(dòng)態(tài)過濾或靜態(tài)吸附(或靜態(tài)浸泡)的方式進(jìn)行操作，用以去除重組干擾素制劑中的內(nèi)毒素；其中親和配基在多孔介質(zhì)上的量為含氮量0.02％～3％。
所述多孔介質(zhì)是含有多羥基的多糖介質(zhì)，如纖維素、葡聚糖或瓊脂糖；或者是含有多羥基的合成介質(zhì)，如聚乙烯醇；重組干擾素溶液的pH為pH3.5～6.0；以殼聚糖為親和配基，殼聚糖的分子量范圍為1萬～100萬；所述多孔介質(zhì)的型式為平板膜、中空纖維膜、小球或顆粒；所述動(dòng)態(tài)過濾重組干擾素溶液的流速為1～20ml/min；靜態(tài)吸附的操作條件為4℃至室溫，靜置2～24小時(shí)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明方法內(nèi)毒素去除率高，干擾素活性回收率高。過濾后溶液的內(nèi)毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干擾素的活性(效價(jià))回收率為90％。
2.本發(fā)明特異性好(處理的重組干擾素濃度不同，或活性不同)，適合生產(chǎn)的要求。過濾后溶液的內(nèi)毒素濃度(＜10EU/ml)符合藥典生產(chǎn)要求。
3.本發(fā)明實(shí)用范圍廣，前景好?？梢匀コ蓴_素制劑生產(chǎn)中含有的內(nèi)毒素污染物，解決其產(chǎn)品質(zhì)量問題，達(dá)到藥典規(guī)定的生產(chǎn)要求；還可望應(yīng)用于其它重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)過程，去除生物藥物中內(nèi)毒素等有害物質(zhì)，提高我國(guó)的藥物生產(chǎn)水平；創(chuàng)造較高的經(jīng)濟(jì)效益。
總而言之，親和膜法既結(jié)合了膜的流速高、表面積大、孔徑均勻、液體與配基之間擴(kuò)散半徑小的優(yōu)勢(shì)，又結(jié)合了親和法高選擇性、高效率的優(yōu)點(diǎn)，將親和膜制備成相應(yīng)的去除器，容易實(shí)現(xiàn)放大以滿足藥物生產(chǎn)的需要。因此，采用親和膜來去除干擾素制劑中的內(nèi)毒素，流量高、去除效果好、有效成分回收率高，優(yōu)于柱親和層析法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
制備以殼聚糖為配基的親和膜取50片直徑為47毫米的纖維素膜，用大量水沖洗干凈，置于一個(gè)200ml的燒杯中，加入40ml環(huán)氧氯丙烷、120ml 1M的NaOH和0.19gNaBH4，混合均勻，室溫下靜置過夜，進(jìn)行活化；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入150ml 1％殼聚糖(分子量35萬)溶液(1％醋酸溶液配制)，于60℃下過夜(16小時(shí)以上)；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入100ml0.25％硼氫化鈉溶液(0.1M pH8.5磷酸緩沖液配制)，室溫下還原反應(yīng)4小時(shí)，取還原后的膜，用大量水洗至中性，瀝干并烘干。該親和膜的含氮量為0.02％。
以殼聚糖為配基的親和膜的應(yīng)用效果將10張親和膜制成相應(yīng)的分離器，以9ml/min的流速過濾干擾素制劑200ml(干擾素效價(jià)91406IU/ml，溶液pH3.5)，過濾后溶液的內(nèi)毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干擾素的活性(效價(jià))回收率為90％。
實(shí)施例2.
制備以己二胺為配基的親和膜取320片直徑為47毫米的纖維素膜，用大量水沖洗干凈，置于一個(gè)1000ml的燒杯中，加入650毫升氧化液中(含2％NaIO4)，30℃烘箱過夜進(jìn)行活化；次日，取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入800ml1％己二胺(0.1M pH＝7磷酸緩沖液配制)，30℃烘箱過夜，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)；次日取交聯(lián)后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，加入800ml 0.6％NaBH4(0.1MpH＝9磷酸緩沖液配制)還原，30℃烘箱過夜。再用大量水洗至中性，瀝干并烘干。該親和膜的含氮量為2.2％。
以己二胺為配基的親和膜的應(yīng)用效果將10張親和膜制成相應(yīng)的分離器，以18ml/min的流速過濾干擾素制劑225ml(干擾素效價(jià)93976IU/ml，溶液pH4.2)，過濾后溶液的內(nèi)毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜10EU/ml，干擾素的活性(效價(jià))回收率為88％。
實(shí)施例3.
制備以去氧膽酸鈉為配基的親和膜取50片直徑為47毫米的纖維素膜，用大量水沖洗干凈，置于一個(gè)200ml的燒杯中，加入40ml環(huán)氧氯丙烷、120ml 1M的NaOH和0.19克NaBH4，混合均勻，室溫下靜置過夜，進(jìn)行活化；次日取活化后的膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入125ml 1％己二胺溶液(1％pH9磷酸緩沖液配制)，于60℃下過夜(16小時(shí)以上)；次日取膜，用大量水洗至中性，瀝干，然后加入125ml 0.1M pH6.0的MES緩沖液，再加入2.5克去氧膽酸鈉、1.25克EDC，混勻，室溫下過夜。取交聯(lián)后的膜，用大量水洗至中性，瀝干并烘干。即得以去氧膽酸鈉為配基的親和膜。
以去氧膽酸鈉為配基的親和膜的應(yīng)用效果將10張親和膜制成相應(yīng)的分離器，以9ml/min的流速過濾干擾素制劑200ml(干擾素效價(jià)91406IU/ml，溶液pH6)，過濾后溶液的內(nèi)毒素濃度從＞80EU/ml降低到＜40EU/ml，干擾素的活性(效價(jià))回收率為70％。
權(quán)利要求
1.一種從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于將殼聚糖，或去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，共價(jià)結(jié)合到多孔介質(zhì)上，以動(dòng)態(tài)過濾或靜態(tài)吸附的方式進(jìn)行操作，用以去除重組干擾素制劑中的內(nèi)毒素；其中親和配基在多孔介質(zhì)上的量為含氮量0.02％～3％。
2.按照權(quán)利要求1所述從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于所述多孔介質(zhì)是含有多羥基的多糖介質(zhì)纖維素、葡聚糖或瓊脂糖；或者是含有多羥基的合成介質(zhì)聚乙烯醇。
3.按照權(quán)利要求1所述從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于重組干擾素溶液的pH為pH3.5～6.0。
4.按照權(quán)利要求1所述從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于以殼聚糖為親和配基，殼聚糖的分子量范圍為1萬～100萬。
5.按照權(quán)利要求1所述從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于多孔介質(zhì)的型式為平板膜、中空纖維膜、小球或顆粒。
6.按照權(quán)利要求1所述的一種從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法，其特征在于所述動(dòng)態(tài)過濾重組干擾素溶液的流速為1～20ml/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)，具體地說是一種從干擾素制劑中去除內(nèi)毒素的方法，將殼聚糖，或去氧膽酸鈉，或己二胺作為親和配基，共價(jià)結(jié)合到多孔介質(zhì)上，以動(dòng)態(tài)過濾或靜態(tài)吸附的方式進(jìn)行操作，用以去除重組干擾素制劑中的內(nèi)毒素；其中親和配基在多孔介質(zhì)上的量為含氮量0.02％～3％。本發(fā)明方法內(nèi)毒素去除率高，干擾素活性回收率高；特異性好，適合生產(chǎn)的要求；實(shí)用范圍廣，前景好。
文檔編號(hào)C07K14/555GK1523037SQ0311103
公開日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月21日
發(fā)明者李京華, 邵英光, 叢潤(rùn)滋, 王俊德 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所