專利名稱：大蒜中總氨基酸及其他鹽基性物質(zhì)的提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從大蒜中提取總氨基酸(其中包括大量含硫氨基酸和一般氨基酸)以及其他鹽基性物質(zhì)的總部位的制備方法。
背景技術(shù)：
大蒜為百合科植物，學名Allium salivum，其磷莖自古以來即為我國人民藥食兩用、現(xiàn)代醫(yī)學證明大蒜具有抗血栓、抑制血小板凝集、抑制人體內(nèi)膽固醇合成、抗炎菌、抗病毒以及腫瘤化學預防的作用(WHO monographs on selectedmedicinal plants vol.1，P.16-32，World Health Organization，Geneva)(聯(lián)邦德國衛(wèi)生局Bundesgesundheitsamt Deutschland.E委員會Commission E monographsP.134July 06.1988)而這些保健和治療作用均與其中的含硫化合物密切相關(guān)(A.Kamel and M.SalehStudies in Natural Products Chem.Vol 23.P 455-485.Atta-ur-Rahman主編2000，Elsevier)。
大蒜中的含硫化合物包括半胱氨酸及其衍生物(甲基半胱氨酸，S-1-烯丙基半胱氨酸，S-2-烯丙基半胱氨酸，丙基半胱氨酸，甲硫氨酸以及它們的氧化型亞砜類化合物Sulfoxide)以及這些氨基酸組成的二肽類；這些含硫氨基酸及肽在大蒜中存在的酶(包括各種肽水解酶、肽轉(zhuǎn)化酶，特別是γ-谷氨酸肽轉(zhuǎn)化酶，過氧化氫氧化酶，蒜氨酸酶等)的作用下可轉(zhuǎn)化成大蒜辣素Allicim，由于大蒜辣素化學性質(zhì)不穩(wěn)定，又可以進一步反應(yīng)生成Ajoene類，dithiine類，硫醚類等多種類型的化合物。
早期國內(nèi)外對大蒜的開發(fā)主要集中提供含硫揮發(fā)油類，即大蒜辣素及其進一步反應(yīng)產(chǎn)物。近十多年來則更重視其中高含量的含硫氨基酸。諸如大蒜原生藥粉的開發(fā)，特別是用冷凍干燥生產(chǎn)，以保持高含量含硫氨基酸的脫臭大蒜粉的口服制劑以作為保健品和藥品。
由于上述含硫氨基酸系多種同類型化合物共同存在，以及它們化學上的不穩(wěn)定性。使藥效工作者很難得到高純度樣品進行生物測試。因此上述這些藥效究屬何種化合物產(chǎn)生，它們的藥理效價、構(gòu)效關(guān)系，相互的協(xié)同作用…等問題，很多目前尚不完全清楚，加上當前國際國內(nèi)對植物藥(中藥)療效的認識大部分傾向于認為是多種化學成份共同作用的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從大蒜中提取其中總含硫氨基酸包括一般氨基酸及鹽基性物質(zhì)的混合部位的方法。
本發(fā)明為提供系統(tǒng)技術(shù)用于生產(chǎn)包括大蒜總氨基酸及其它鹽基性成份的部位用于生產(chǎn)各種口服的保健品和治療劑，并可再經(jīng)精制用于生產(chǎn)注射或靜脈滴注用。
本工藝所用大蒜原料可為新鮮大蒜、干大蒜片，得率可因生藥原料的產(chǎn)地和探收時間存放條件的不同而不同，一般新鮮大蒜生產(chǎn)得率為2-4％，干大蒜片生產(chǎn)得率為3-5％。
本發(fā)明提供的制備技術(shù)包括下列步驟1、抑制酶活性(a))鮮大蒜原料于150℃烘烤30分鐘使各種酶失活。
(b)鮮大蒜原料浸入沸水中或隔水蒸煮，保持沸騰30分鐘至45分鐘，以保證各種酶完全失活。
2、脫脂經(jīng)抑制酶活性后的大蒜加適量水攪碎，以氯仿脫脂，以除去脂溶性物質(zhì)部分，本工藝脫脂可用鹵代烷、C1-C5低級酯、C1-C5低級醚等有機溶劑如石油醚，氯仿，四氯化碳，二氯甲烷，二氯乙烷，乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲乙酮，乙醚、苯或甲苯等。
3、提取經(jīng)脫脂后的大蒜液的提取劑為水，或含水甲醇、含水乙醇、含水丙醇等含水水溶性溶劑加入溶劑約10-20倍量，溫浸提取2小時，過濾，濾渣重復提取一次，合并提取液，提取用醇濃度可為50-90％。
4、溶劑沉淀和膜處理經(jīng)水或含水醇提取所得溶液用3千-5萬分子量的膜超濾，收集濾過液(3千-5萬分子量的膜可以是集束中空纖維膜，平板膜，卷式膜和陶瓷膜等)除去截留的高分子物質(zhì)。
5、離子交換上述處理液通過聚苯乙烯型大孔磺酸型離子交換樹脂，例如D001、HD-82、D061、S-9等強陽性離子交換樹脂使氨基酸、生物胺等活性物質(zhì)吸著于樹脂上，再用水或50％醇洗柱，洗去糖類，皂類，酚類物質(zhì)等非氨基酸類的中性或酸性物質(zhì)，洗凈的樹脂柱以1-5％氨水或氨性乙醇洗脫，至洗脫液呈現(xiàn)堿性，直至茚三酮定性反應(yīng)為陰性，減壓濃縮至1/3體積，除去過量的氨水。
6、活性炭吸附加適量活性炭以進一步除去色素類物質(zhì)，過濾，濾液再以水或50％乙醇洗，減壓濃縮至小體積噴霧干燥，即為本有效部位，為微黃色粉末。
7、精制如作為注射劑或靜脈滴注用，應(yīng)進一步精制，并除去其中的熱源及蛋白質(zhì)，方法為重復一次離子交換處理及再經(jīng)一次膜過濾，具體方法同上。
產(chǎn)品中包括的化學成份有(1)含硫氨基酸半胱氨酸Cysteine，甲基半胱氨酸S-methyl cysteine(SMC)，硫-1-烯丙基半胱氨酸S-1-propenyl cysteine，硫-2-丙烯基半胱氨酸，S-2-propenyl cysteine(即S-丙烯基半胱氨酸S-allyl cysteine簡稱SAC)，硫丙基半氨酸S-propanyl cysteine，甲硫氨酸Metheonine以及它們的亞砜類，諸如硫-2-烯丙基半胱氨酸亞砜(蒜氨酸Alliin)，硫-1-烯丙基半胱氨酸亞砜(即異蒜氨酸isoalliin)甲硫氨酸亞砜Methiin環(huán)蒜氨酸cycloalliin等。
(2)普通氨基酸甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、門冬氨酸、賴氨酸、烏氨酸、絲氨酸、蛋氨酸以及上述這些氨基酸(特別是谷氨酸與上述含硫氨基酸)構(gòu)成的二肽，上述含硫氨基酸及肽的相對含量可因大蒜原料的不同產(chǎn)地，采集時間，存放條件及時間的不同而有所不同(見表1)。
此外本部位中定性使知還含有少量的大蒜辣素及其降解產(chǎn)物，微量的硒氨基酸及其降解產(chǎn)物，生物胺類化合物。
本品為淡黃色固體，易溶于水，甲醇及含水乙醇，難溶于三氯甲烷、四氯化碳、二氯甲烷，乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲乙酮，乙醚，石油醚等有機溶劑中按本品編號Ex-A 040224產(chǎn)品的分析數(shù)據(jù)。
氨基酸分析報告游離 22.93mg/10ml

用氨基酸自動分析儀測定普通氨基酸含量游離氨基酸含量36.30％水解氨基酸含量76.35％蒜氨酸含量參照美國藥典USP25版(2004年)Official Monographys P.2550Garlic項下Content of alliin規(guī)定的方法測定對照樣品為按常規(guī)方法合成的蒜氨酸經(jīng)反復純化測定蒜氨酸含量為8.6％。
用本工藝生產(chǎn)保健品可用鮮大蒜或干大蒜片生產(chǎn)藥品，要求選用特定產(chǎn)地和貯藏方法的大蒜原料以保證50％以上化學成份清楚、恒定和可控，用于生產(chǎn)針劑除選用特定產(chǎn)地和貯藏方法的優(yōu)質(zhì)大蒜原料，并需將口服制劑原料進一步純化，特別是膜過濾純化以達到80％以上化學成份，清楚、恒定、可控，除去其中的熱原和蛋白質(zhì)，并符合國家規(guī)定的指紋圖譜規(guī)范要求。


圖1是提取出的產(chǎn)品氨基酸指紋圖譜。
圖2是蒜氨酸的HPLC圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述，但不限制本發(fā)明。
實施例(一)當年去皮500克大蒜鱗莖瓣，投入到2500毫升水中煮沸三十分鐘，殺大蒜生物酶，在此期間保持大蒜的完整。殺酶完成后從水中撈出，自然冷卻到室溫。將殺過酶的大蒜瓣粉碎并加入二倍量的三氯甲烷或二氯甲烷同時攪拌十分鐘，完成后，使渣、液分離，液體部分用液-液分離器分出水層，把大蒜組織和水層部分再用三氯甲烷或二氯乙烷脫脂一次。脫脂的大蒜和水被加入15倍水，加熱浸提2小時，溫度控制在40～70度之間，提取結(jié)束后，用抽濾法使渣液分離，收集浸提液。渣重新加15倍量水再以上法浸提一次，渣液分離，合并兩次浸提液。浸提液先用0.1微米膜濾去浸提液中的微粒，然后再用3千或五千分子量超濾膜超濾，超濾溫度控制在25度左右，壓力控制在2～3kg。收集通過液。通過液減壓濃縮，濃縮溫度控制在50度，濃縮到2000毫升體積時放出自然冷卻至室溫。
上述濃縮液通過D001離子交換樹脂，樹脂用量為500毫升，樹脂在被使用前要清洗并處理成氫型。料液以每分鐘30毫升左右的流速通過。通完料液后，樹脂用兩倍柱床體積的去離子水清洗殘液，再用兩倍柱床體積的50％乙醇洗去可能被樹脂吸附的醣類，糖苷類物質(zhì)。隨后以1％氨水洗脫，直至洗脫液用茚三酮作定性反應(yīng)呈陰性。洗脫液合并減壓濃縮，濃縮至250毫升左右除去溶液中多余的氨水。濃縮液加入適量顆?；钚蕴?，攪拌30分鐘，靜止3小時以上，用0.45微米尼龍膜過濾，濾液減壓濃縮至干，得微黃色大蒜有效部位20.3克。經(jīng)含量分析，其中蒜氨酸含量為8.6％。氨基酸含量大于80％。
實施例(二)隔年去皮大蒜鱗莖瓣500克，隔水蒸煮三十分鐘殺生物酶，殺酶完成后自然冷卻到室溫。將殺過酶的大蒜瓣粉碎并加入二倍量的甲乙酮或乙酸乙酯浸泡攪拌10分鐘，靜止過夜脫脂。第二天使渣液分離，液體部分用液-液分離器分除甲乙酮或乙酸乙酯，把大蒜組織和水液部分再用甲乙酮或乙酸乙酯脫脂一次。脫脂后的大蒜加入15倍50％甲醇回流提取2次，每次2小時，提取結(jié)束后，使液渣分離，收集提取液。合并兩次提取液減壓濃縮，濃縮至含醇量小于10％。濃縮液先用0.1微米膜濾去提取液中的微粒，再用一萬或三萬分子量超濾膜超濾，超濾溫度控制在25度，壓力控制在2kg左右。收集通過液。通過液合并減壓濃縮，濃縮溫度控制在50度，濃縮到2000毫升時放出自然冷卻至室溫。
上述濃縮液通過HD-82離子交換樹脂，樹脂用量為500毫升，料液以每分鐘30毫升左右的流速通過。料液通過后，樹脂用兩倍柱床體積的去離子水洗去殘液，再用兩倍柱床體積的50％乙醇洗去可能被樹脂吸附的醣類，糖苷類物質(zhì)。隨后以5％氨性乙醇洗脫，直至洗脫液用茚三酮作定性反應(yīng)呈陰性，洗脫液合并減壓濃縮，濃縮至250毫升左右，除去溶液中多余的氨水后，在濃縮液中適量加入顆?；钚蕴?，攪拌30分鐘，靜止3小時以上，用0.45微米尼龍膜過濾，濾液減壓濃縮至干，得微黃色大蒜有效部位11.7克。經(jīng)含量分析，其中蒜氨酸含量為5.1％，氨基酸含量大于80％。
實施例(三)當年去皮大蒜鱗莖瓣500克，置于150度烤箱內(nèi)30分鐘殺酶，待冷卻至室溫后，投入到二倍量二氯乙烷或四氯化碳中，粉碎并沸騰回流30分鐘，脫脂，回流后用真空過濾去除二氯乙烷或四氯化碳，用液-液分離器分出水層，同法操作二次。對脫脂后的大蒜和分出的水層加入15倍30％丙醇，熱浸提4小時，溫度在60度左右，提取結(jié)束后，離心渣液分離，收集提取液。渣中新加15倍30％丙醇再以上法抽提一次，渣液分離。合并兩次提取液減壓濃縮，溫度控制在50度左右，濃縮到含醇量小于10％止，靜置冷卻到室溫。接著用0.1微米膜濾去濃縮液中的微粒，然后再用五萬分子量超濾膜超濾，超濾溫度控制在25度，壓力控制在2～3kg。收集通過液。通過液減壓濃縮，濃縮溫度控制在50度，濃縮到400毫升體積時放出自然冷卻至室溫。
上述濃縮液通過強酸性苯乙烯系D061陽離子交換樹脂，樹脂用量為500毫升，樹脂在通入料液前被處理為氫型，料液以每分鐘30毫升左右的流速通過。料液通過后，樹脂用兩倍柱床體積的去離子水洗去殘液，再用兩倍柱床體積的50％乙醇洗去可能被樹脂吸附的醣類，糖苷類物質(zhì)。隨后以5％氨水洗脫，直至洗脫液用茚三酮作定性反應(yīng)呈陰性，洗脫液合并減壓濃縮，濃縮至1升左右以除去溶液中多余的氨水。濃縮液加入適量顆?；钚蕴?，攪拌30分鐘，靜止3小時以上，用0.45微米尼龍膜過濾，濾液減壓濃縮至干，得微黃色大蒜有效部位13.1克。經(jīng)高效液相色譜分析，其中蒜氨酸含量為5.7％，總氨基酸含量大于80％。
實施例(四)大蒜鱗莖干片1000克，加20倍量50％乙醇粉碎并回流二小時，提取，回流結(jié)束，離心分離液渣，渣加15倍量50％乙醇再回流一次，渣液分離。提取液真空濃縮，溫度控制在50度，濃縮到4升左右此時幾乎不含醇，自然冷卻到室溫。冷卻液以每次500毫升乙酸丁酯或乙醚等有機溶劑萃取二次，脫脂。脫過脂的水液進一步減壓濃縮到小體積，約1000毫升時趁熱加入2000毫升95％乙醇或異丙醇，醇沉，放置過夜，取上輕液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在50度，濃縮到1000毫升時放出自然冷卻至室溫。
上述濃縮液通過S-9離子交換樹脂，樹脂用量為1000毫升，樹脂在通入料液前被處理為氫型，料液以每分鐘30毫升左右的流速通過。料液通過后，樹脂用兩倍柱床體積的去離子水洗去殘液，再用兩倍柱床體積的50％乙醇洗去可能被樹脂吸附的醣類，糖苷類物質(zhì)。隨后以3％氨水洗脫，直至洗脫液用茚三酮作定性反應(yīng)呈陰性，洗脫液合并減壓濃縮，濃縮至1升左右以除去溶液中多余的氨水。濃縮液中加入顆?；钚蕴窟m量，攪拌30分鐘，靜止3小時以上，用0.45微米尼龍膜過濾，濾液減壓濃縮至干，得微黃或淺棕色大蒜有效部位51.6克。經(jīng)高效液相色譜分析，其中蒜氨酸含量為6.2％，總氨基酸含量大于80％。
權(quán)利要求
1.一種從大蒜中提取制備總氨基酸及其他鹽基性物質(zhì)的提取工藝包括a、生物酶失活；b、脫脂；c、用水或含水有機溶劑提取；d、膜超濾；e、強陽離子樹脂富集；f、活性炭脫色；g、精制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于運用烘烤，燙煮，蒸煮的工序使大蒜中的諸種生物酶失活。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于大蒜脫脂溶劑采用鹵代烷烴、甲乙酮、乙酸乙酯、乙醚、苯或甲苯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于提取大蒜總氨基酸及鹽基性物質(zhì)的提取劑為水或含水甲醇、含水乙醇、含水丙醇含水水溶性溶劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于膜超濾采用三千分子量到五萬分子量的超濾膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于離子交換樹脂是聚苯乙烯型大孔磺酸型離子交換樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的提取工藝，其特征在于聚苯乙烯型大孔磺酸型離子交換樹脂為D001、HD-82、D061、S-9等強陽性離子交換樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及提取制備大蒜的有效部位，即包括多種大蒜含硫氨酸以及它們的二肽類，其制備過程包括(1)失活各種酶，(2)脫脂，(3)抽提，(4)沉淀或超濾，(5)離子交換富集，(6)脫色，(7)再精制各步驟。本工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，得率2－4％總氨基酸含量80％以上蒜氨酸含量5－10％以上以用于制作保健品藥品口服及注射劑。
文檔編號C07C323/58GK1775741SQ20041006815
公開日2006年5月24日 申請日期2004年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月15日
發(fā)明者陳仲良, 殷夢龍, 丁一政 申請人:上海南和藥物保健有限公司