專利名稱：抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物制劑的制備方法，具體地說，是一種抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法。用于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
偽狂犬病是由偽狂犬病病毒引起的一種可以引起多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要癥狀的疾病。近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化、集約化發(fā)展，豬的偽狂犬病在許多地區(qū)爆發(fā)流行，而且有逐步擴大蔓延的趨勢。該病嚴重危害著養(yǎng)豬業(yè)，可引起妊娠母豬流產(chǎn)，初生仔豬多為急性致死性經(jīng)過，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且在國際貿(mào)易時導(dǎo)致貿(mào)易壁壘。目前該病的檢測方法主要為病毒分離、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，最近又研制了gE-ELISA和膠體金鑒別診斷技術(shù)，為我國根除此病提供有效的檢測手段。這些快速靈敏的檢測試劑盒均需要有特異性高的免疫抗體。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，孔令達等在《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報》2004年第5期發(fā)表的“豬偽狂犬病高免血清的制作與初步應(yīng)用”一文中，用豬作為實驗動物，通過強化免疫，制備高效價的免疫抗體用于免疫檢測取得了良好的效果。用豬作為實驗動物飼養(yǎng)不方便，一次采血量少，且手續(xù)麻煩，成本高。在進一步的文獻檢索中，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題“抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法”相同或者類似的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法，使其制備卵黃抗體的方法簡便、產(chǎn)量高、易于純化。制備抗體的敏感性高，特異性強，可用于免疫檢測，為建立基因工程缺失疫苗和鑒別診斷方法的技術(shù)與產(chǎn)品提供物質(zhì)條件。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明具體步驟如下
1)采用將豬狂犬病疫苗或豬狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清潔級供試雞。免疫劑量每頭份0.5ml，間隔10天進行第二次免疫，免疫劑量為0.5ml。免疫10天后，進行第三次免疫，免疫劑量為1ml。第三次免疫10天后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行效價測定，當(dāng)卵黃抗體效價達1∶1280以上時收集免疫卵；2)強化免疫卵黃，用對倍無菌水稀釋、用水配成2摩爾/升的乳酸液，調(diào)pH4.4進行酸處理去除雜蛋白、0.5％鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素處理和-40℃凍融處理，以去除脂質(zhì)，抽濾液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析除鹽、柱層析獲得高純度(99.9％)的抗豬狂犬病卵黃抗體。
本發(fā)明的基本原理是利用家禽作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)各類生物活性物質(zhì)。當(dāng)供試雞免疫后即產(chǎn)生特異性抗體，血液中的抗體逐漸進入卵黃并蓄積。該抗體穩(wěn)定，經(jīng)提純后可用于免疫檢測。
本發(fā)明的有益效果是提供制備抗豬偽狂犬病卵黃抗體的方法簡便，成本低，制備的卵黃抗體其敏感性高，特異性強，為建立基因工程缺失疫苗和鑒別診斷方法的技術(shù)與產(chǎn)品提供物質(zhì)條件；為使用常規(guī)血清學(xué)方法難以區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬成為可能；為我國根除豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)技術(shù)保障。
具體實施例方式
以下實施例中采用中牧股份有限公司所屬的生物制品廠生產(chǎn)的豬用疫苗，由全國畜牧獸醫(yī)部門發(fā)售，為凍干疫苗，劑量為50頭份/瓶。
實施例1飼養(yǎng)清潔級經(jīng)產(chǎn)蛋雞，第一次免疫豬狂犬病疫苗，免疫劑量每頭份0.5ml(凍干疫苗用生理鹽水稀釋成20ml)。間隔10天進行第二次免疫，免疫劑量為0.5ml。免疫10天后，進行第三次免疫，免疫劑量為1ml。用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行效價測定，當(dāng)效價達1∶1280以上時收集免疫卵，無菌獲取卵黃，用對倍無菌水稀釋、用2mol.L-1乳酸液調(diào)pH4.4進行酸處理去除雜蛋白、0.5％鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素處理和-40℃凍融處理，以去除脂質(zhì)，抽濾液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析除鹽、柱層析獲得高純度的抗豬狂犬病卵黃抗體。其免疫球蛋白的得率達90％以上。
制備抗豬偽狂犬病卵黃抗體的方法簡便，成本低，獲得的卵黃抗體純度高，特異性強，可用于免疫檢測。
實施例2飼養(yǎng)清潔級經(jīng)產(chǎn)蛋雞，第一次免疫豬狂犬病gE基因工程缺失疫苗，免疫劑量每頭份0.5ml。間隔10天進行第二次免疫，免疫劑量為0.5ml。免疫10天后，進行第三次免疫，免疫劑量為1ml。用gE酶聯(lián)免疫吸附試驗進行效價測定，當(dāng)效價達1∶1280時收集免疫卵。其后抗豬狂犬病卵黃抗體的制備方法同方案1。
制備的卵黃抗體其敏感性高，特異性強，為建立基因工程缺失疫苗和鑒別診斷方法的技術(shù)與產(chǎn)品提供物質(zhì)條件；為使用常規(guī)血清學(xué)方法難以區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬成為可能；為我國根除豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)技術(shù)保障。
權(quán)利要求
1.一種抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下1)采用將豬狂犬病疫苗或豬狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清潔級供試蛋雞，用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行效價測定后，收集免疫卵；2)強化免疫卵黃，用水稀釋、用乳酸液調(diào)酸進行酸處理去除雜蛋白、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素處理和凍融處理，以去除脂質(zhì)，抽濾液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析除鹽、柱層析獲得的抗豬狂犬病卵黃抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法，其特征是，所述的步驟1)中，采用將豬狂犬病疫苗或豬狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清潔級供試蛋雞，連續(xù)免疫三次，每次間隔10天，第三次免疫10天后，用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行效價測定，當(dāng)卵黃抗體效價達1∶1280以上時收集免疫卵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法，其特征是，所述的水是對倍無菌水，所述的乳酸液濃度是用水配成2摩爾/升，乳酸液進行酸處理的pH值是4.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法，其特征是，所述的鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素的濃度是0.5％，
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法，其特征是，所述的凍融處理的溫度是-40℃。
全文摘要
一種抗豬偽狂犬病卵黃抗體的制備方法，本發(fā)明具體步驟如下1)采用將豬狂犬病疫苗或豬狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清潔級供試蛋雞，用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行效價測定后，收集免疫卵；2)強化免疫卵黃，用水稀釋、用乳酸液調(diào)酸進行酸處理去除雜蛋白、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素處理和凍融處理，以去除脂質(zhì)，抽濾液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析除鹽、柱層析獲得高純度的抗豬狂犬病卵黃抗體。本發(fā)明制備的卵黃抗體其敏感性高，特異性強，為建立基因工程缺失疫苗和鑒別診斷方法的技術(shù)與產(chǎn)品提供物質(zhì)條件；為使用常規(guī)血清學(xué)方法難以區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬成為可能；為我國根除豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)技術(shù)保障。
文檔編號C07K16/08GK1724569SQ200510027330
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日
發(fā)明者劉永德, 徐建雄, 葉陳梁, 汪毅 申請人:上海交通大學(xué)