專利名稱：霉酚酸免疫原及抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于產(chǎn)生抗體的免疫原性化合物，所述抗體對(duì)于霉酚酸(霉酚酸酯 /鹽)具有高度特異性，并且和霉酚酸的葡糖苷酸代謝物，尤其是?；咸擒账岽x物，基 本沒有交叉反應(yīng)性。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的為了測(cè)定霉酚酸的免疫測(cè)定方法利用來自免疫原的抗體，其中霉酚酸是衍 生于霉酚酸的羧酸(例如，通過Dade-Behring提供的EMIT測(cè)定)或者還原的霉酚酸羧酸 (即，Microgenics提供的CEDIA測(cè)定中使用的“霉酚酸醇”)。 由于霉酚酸分子在羧酸或還原的羧酸處連接著載體X，該分子的該末端從免疫系 統(tǒng)中被掩蔽，因此不能刺激對(duì)應(yīng)于免疫應(yīng)答中這個(gè)位點(diǎn)的表位的抗體互補(bǔ)位(antibody paratope)的形成。這些已知的免疫測(cè)定的麻煩在于對(duì)于?；咸擒账岽x物的不希望的 高交叉反應(yīng)性。霉酚酸的HPLC-UV和LC/MS測(cè)定也是眾所周知的。Roche已經(jīng)開發(fā)和著手一種使 用重組肌苷一磷酸脫氫酶(IMPDH)對(duì)霉酚酸進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制測(cè)定。Roche還公開了用 于非競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制免疫測(cè)定試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的藥物綴合物制備中的4’ -和5’ -霉酚酸衍生 物，該設(shè)計(jì)方案采用針對(duì)該藥物以及IMPDH的抗體。但是，由4’ -和5’ -霉酚酸衍生物制 備得到的免疫原并沒有在現(xiàn)有技術(shù)中公開。和上述的背景技術(shù)相比，本發(fā)明提供了相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的一些非顯而易見的優(yōu)點(diǎn) 和進(jìn)步。尤其是，發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到對(duì)于可用于抗體產(chǎn)生的霉酚酸免疫原進(jìn)行改進(jìn)的需求， 所述抗體對(duì)于霉酚酸原型藥物(parent drug)特別是對(duì)于霉酚酸的葡糖苷酸代謝物具有改 善的特異性。本發(fā)明描述了新的免疫原，其中霉酚酸的羧酸部分是游離的和未封閉的。羧酸部 分沒有跟現(xiàn)有技術(shù)中的免疫原一樣被掩蔽，因此其完全可以用于做為表位。這是通過通過 烷基側(cè)鏈的不同位置連接霉酚酸而實(shí)現(xiàn)的，所述位置即如下結(jié)構(gòu)中的4’和5’位
發(fā)明內(nèi)容

5'-MPA-免疫原 游離羧酸4’>MPA-免疫原 游離羧酸其中L是連接基團(tuán)，包含1至40個(gè)排列成直鏈或支鏈的碳原子，飽和的或不飽和 的，并且包含至多2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子，條件是不多于2個(gè)雜原子可以依次連接且 X選自由多肽、多糖以及合成聚合物組成的組。


圖1表示霉酚酸5，-取代芳族NHS酯(10)，N-{2-[(E)-3-羧基-7-(4-羥基-6-甲 氧基-7-甲基-3-氧-1，3- 二氫異苯并呋喃-5-基)-5_甲基-庚-5-烯?；被鵠_乙 基}_對(duì)苯二甲酸單酰胺2，5- 二氧吡咯烷-1-基酯，的合成示意圖。圖2表示霉酚酸5’-取代芳族NHS酯(10)的KLH綴合物(11)和BSA綴合物(12) 的合成示意圖。圖3表示5，-位馬來酰亞氨基連接的霉酚酸(14)，(E)-2-({2-[3-(2，5-二氧-2， 5- 二氫-吡咯-1-基)_丙?；被鵠_乙基氨基甲?；鶀_甲基)-6-(4_羥基-6-甲氧 基-7-甲基-3-氧-1，3- 二氫異苯并呋喃-5-基)-4-甲基-己-4-烯酸，的合成示意圖。圖4表示5’-位連接的霉酚酸-琥珀酰亞氨基_硫基丙酰基-BSA綴合物(15)的 合成示意圖。圖5表示5’-位連接的霉酚酸琥珀酰亞氨基-硫基丁脒基_KLH(16) (S'-position linked mycophenolic acid succinimidyl sufanylbutyrimidoyl-LH)的合成不意圖。圖6表示4，- (2，5- 二氧-吡咯烷-1-基-氧羰基-4”-苯基_1 ”-羰基氨基-乙 基-2-氨基羰基甲基)_MPA(18)的4’ -位連接KLH綴合物(19)；和BSA綴合物(20)的合 成示意圖。發(fā)明詳述需要注意的是術(shù)語如“優(yōu)選”、“通?！保汀暗湫汀痹诒旧暾?qǐng)中沒有被用于去限定本 發(fā)明的范圍或者去隱含著某些特征對(duì)于本發(fā)明的結(jié)構(gòu)或功能而言是決定性的、本質(zhì)上的， 或者甚至重要的。更確切地說，這些術(shù)語僅僅想要強(qiáng)調(diào)可以或可以不在本發(fā)明的具體實(shí)施 方案中使用的可替代的或附加的特征。為了描述和定義本發(fā)明的目的，需要注意的是術(shù)語“基本上”在本申請(qǐng)中被用于表 示固有的不確定性程度，其可以歸因于任何定量比較、數(shù)值、測(cè)量值或其它表現(xiàn)形式。術(shù)語 “基本上”在本申請(qǐng)中也被用于表示定量表示可以和所提到的參考值不同而不會(huì)導(dǎo)致爭(zhēng)論 主題的基本功能變化的程度。本發(fā)明提供用于產(chǎn)生對(duì)于霉酚酸具有高特異性的抗體的免疫原，其不會(huì)與霉酚酸 的葡糖苷酸代謝物，尤其是下式所述的?；咸擒账岽x物，進(jìn)行反應(yīng) G =葡糖苷酸附圖分別描述了通過活性酯化學(xué)制備霉酚酸-4’ _和5’ _免疫原的優(yōu)選實(shí)施方案 (如圖1，2和6)。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是通過馬來酰亞胺硫醇化學(xué)制備免疫原(如圖3-5)。通過5’ _或4’ _位連接基團(tuán)綴合到載體上的霉酚酸表示對(duì)于免疫系統(tǒng)而言最佳 的霉酚酸分子，包括末端羧酸。對(duì)于霉酚酸免疫原來說，5’-和4’-位取代是新的。一般來 說，通過在非末端位置對(duì)烷基側(cè)鏈進(jìn)行衍生化而制備得到的免疫原是不常見的，尤其對(duì)于 霉酚酸而言，用作交叉反應(yīng)性抗體的問題的解決方案不會(huì)是顯而易見的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有下式的化合物 其中L是連接基團(tuán)，包含1至40個(gè)排列成直鏈或支鏈的碳原子，飽和的或不飽和 的，并且包含至多2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子，條件是不多于2個(gè)雜原子可以依次連接并 且X選自由多肽、多糖以及合成聚合物組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及應(yīng)答緊上述化合物產(chǎn)生的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有下式的化合物 其中L是連接基團(tuán)，包含1至40個(gè)排列成直鏈或支鏈的碳原子，飽和的或不飽和 的，并且包含至多2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子，條件是不多于2個(gè)雜原子可以依次連接并 且X選自由多肽、多糖以及合成聚合物組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及應(yīng)答緊上述化合物產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供針對(duì)由本發(fā)明免疫原產(chǎn)生的MPA的抗體。為了產(chǎn)生抗 體，免疫原能夠通過將凍干免疫原再水合而形成免疫原的溶液或懸浮而準(zhǔn)備好用于注射入 宿主動(dòng)物中。做為選擇，免疫原可以以事先制備的液體溶液或緩沖液中的懸浮液形式使用。 免疫原溶液然后與佐劑例如Freimd's組合以形成免疫原混合物。免疫原可以在各種部位、 使用多種劑量、一次或多次在很多周內(nèi)給藥。使用本發(fā)明的免疫原制備多克隆抗體可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何常規(guī) 技術(shù)。通常來說，宿主動(dòng)物例如兔子、山羊、小鼠、天竺鼠、或馬被注射免疫原混合物。進(jìn)一 步的注射是采用針對(duì)抗體滴度進(jìn)行評(píng)價(jià)直到確定已經(jīng)達(dá)到優(yōu)化滴度為止的血清。宿主動(dòng)物 然后被放血從而得到適當(dāng)體積的特異性抗血清。在需要的情況下，在抗血清被認(rèn)為適合在測(cè)定中使用之前可以通過凈化步驟清除不希望的物質(zhì)，例如非特異性抗體。單克隆抗體可以通過如下獲得使用聚乙二醇融合方法，例如描述在Methodsin Enzymology 73 (Part B)，pp3_46，1981中描述的技術(shù)，使來自如上所述被免疫的小鼠中的 小鼠淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交。為了使本發(fā)明可以更容易被理解，參見下述的實(shí)施例，其旨在解釋本發(fā)明，但不限 制本發(fā)明的范圍。在下述的實(shí)施例中，黑體字形式的帶下標(biāo)數(shù)字是指在附圖中的相應(yīng)結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施方案實(shí)施例1、霉酚酸甲酯⑵的制備向5. 0g(15. 6mmol)霉酚酸在無水甲醇中的溶液中加入100 □ L的濃硫酸。這種透 明褐色的溶液在氬氣氛下室溫?cái)嚢?8h。得到的反應(yīng)混合物在減壓下濃縮得到褐色-白色 粉末。其被溶解于150mL的二氯甲烷中，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌(3xl00mL)，接著用100mL 水洗滌。收集二氯甲烷層，干燥(無水Na2S04)，然后濃縮得到4.72g(14. lmmol)的霉酚酸 甲酯這)，為淺褐色粉末。實(shí)施例2、5’ _叔丁氧羰基甲基_霉酚酸甲酯⑶的制備將26mL(26mmol)的雙(三甲基甲硅烷基)氨基化鈉溶液(在THF中的1.0M溶 液)在氬氣氛下在干冰/丙酮浴中冷卻到_78°C。向該冷卻溶液中加入2. 6mL(22mmol)的 二甲基亞丙基脲(DMPU)，然后在-78°C攪拌15分鐘。將2.86g(8. 56mmol)的霉酚酸甲酯 (幻在45mL新蒸餾的THF中的溶液逐滴加入到該反應(yīng)混合物中。反應(yīng)混合液在_78°C攪拌 1小時(shí)，反應(yīng)混合物的顏色由淺黃色變?yōu)榻埸S色。向反應(yīng)混合物中加入1.9mL(912mmol)的 溴乙酸叔丁基酯，反應(yīng)混合物在_78°C攪拌3小時(shí)。反應(yīng)用20mL的飽和氯化銨溶液猝滅， 得到的混合物升溫到室溫。加入另外200mL的飽和氯化銨溶液，反應(yīng)混合物用3x200mL的 乙酸乙酯進(jìn)行萃取。合并得到的有機(jī)層用300mL的飽和氯化銨洗滌，干燥(無水Na2S04)， 濃縮。粗產(chǎn)物通過使用在乙酸乙酯中的30%己烷進(jìn)行硅膠柱層析純化，得到3. 87g的半固 態(tài)物質(zhì)。該產(chǎn)物的一部分(1.45g)通過使用含有0. 三氟乙酸的乙腈/水的梯度體系的 RP-HPLC[Rainin C_18 (0DS) 21. 4mm x 250mm]多次進(jìn)行純化。合并包含產(chǎn)物的餾分并蒸除
乙腈。殘余物進(jìn)行凍干得到669mg(1.49mm0l，47%)的5，-叔丁氧羰基甲基-霉酚酸甲酯 ⑶。實(shí)施例3、5’ -羧基甲基-霉酚酸甲酯⑷的制備向300mg(0. 67mmol)的5，-叔丁氧羰基甲基-霉酚酸甲酯⑶中加入15mL的三 氟乙酸的二氯甲烷溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?. 5小時(shí)，濃縮。殘余物通過使用在乙酸乙酯 中的20%甲醇的硅膠柱層析進(jìn)行純化，得到25011^(0.63讓01，95% )的5，-羧基甲基-霉 酚酸甲酯⑷。實(shí)施例4、5’ _(琥珀酰亞胺基-N-氧)羰基甲基-霉酚酸甲酯 的制備向在2mL新蒸餾的THF中的200mg(0. 51mmol)的5，-羧基甲基-霉酚酸甲酯⑷ 中，加入244mg(2. 12mmol)的N-羥基琥珀酰亞胺和437mg(2. 12mmol)的二環(huán)己基碳二亞 胺?；旌衔镌谑覝?cái)嚢?h。過濾掉沉淀的二環(huán)己基脲，濾液用制備RP-HPLC(Waters Delta Pak C-18 50x250mm，水 / 乙腈/0. 1% TFA)進(jìn)行純化。合并包含產(chǎn)物的餾分，即刻凍干，得到129mg(52%，0. 26mmol)的5，-(琥珀酰亞氨基-N-氧)羰基甲基_霉酚酸甲酯 。實(shí)施例5、5’ -(N-2-叔丁氧基羰基氨基乙基)氨基羰基甲基_霉酚酸甲酯⑥的 制備向680mg(l. 73mmol)的5，-羧基甲基-霉酚酸甲酯⑷中加入75mL新蒸餾的二 氯甲烷。向反應(yīng)混合物中加入516mg(3.25mmol)的N-(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯在 新蒸餾的二氯甲烷中的20ml溶液。得到的混合物在室溫下攪拌，加入503mg(2.62mmol)的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18h。反應(yīng)混合 物用2xl00mL的水、2xl00mL的飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，接著用100mL水洗滌。分離出有機(jī) 層，干燥(無水Na2S04)，濃縮。殘余物通過使用在乙酸乙酯中的10%甲醇進(jìn)行硅膠柱層析 純化，得到472!^(0.88讓01，51%)的5’-(N-2-叔丁氧羰基氨基乙基)氨基羰基甲基-霉 酚酸甲酯坦)，為無色膠狀物質(zhì)。實(shí)施例6、由5’_(琥珀酰亞胺基-N-氧)羰基甲基-霉酚酸甲酯 制備 5’ -(N-2-叔丁氧羰基氨基乙基)氨基羰基甲基-霉酚酸甲酯⑥的替換方式制備125mg(0.25mmol)的5’ -(琥珀酰亞胺基_N_氧)羰基甲基-霉酚酸甲酯
(5)在5mL新蒸餾的二氯甲烷中的溶液。向反應(yīng)混合物中加入59□ L(0. 38mmol)的叔丁 基-N_(2-氨基乙基)氨基甲酸酯在2mL 二氯甲烷中的溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌，然 后加入73 □ L(5. 2mmol)的三乙胺。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18h，得到的反應(yīng)混合物用 水，飽和碳酸氫鈉洗滌，接著用水洗滌。有機(jī)層進(jìn)行干燥(Na2S04)，濃縮。殘余物用硅膠柱 層析進(jìn)行純化得到5’ -(N-2-叔丁氧羰基氨基乙基)氨基羰基甲基-霉酚酸甲酯但)。實(shí)施例7、5’ -(N-2-氨基乙基)氨基羰基甲基-霉酚酸甲酯三氟醋酸鹽(Z)向55mg(0. 102mmol)的5’ _(N_2_叔丁氧羰基氨基乙基)羰基甲基-霉酚酸甲酯
(6)在4mL新蒸餾的二氯甲烷中的溶液中加入4mL的三氟醋酸。得到的混合物在室溫下攪 拌15分鐘，然后減壓濃縮得到定量產(chǎn)率的56mg(0. 102mmol)的5’ -(N_2_氨基乙基)氨基 羰基甲基-霉酚酸甲酯三氟醋酸鹽(§)，為淺黃色膠狀物質(zhì)。實(shí)施例8、5’ -(N-2-氨基乙基)氨基羰基甲基-霉酚酸⑧向1.63g(2.97mm0l)的5，_(N_2_氨基乙基)氨基羰基甲基-霉酚酸甲酯三氟醋 酸鹽(7)中加入22mL的THF、22mL的甲醇、以及3. 5g(83mmol)的氫氧化鋰一水合物在48mL 水中的溶液。反應(yīng)混合物室溫下攪拌18h，濃縮盡可能地除去THF和甲醇。向得到的反應(yīng)混 合物中，加入磷酸調(diào)節(jié)PH值到5，然后含水的反應(yīng)混合物用6 X 50mL的氯仿進(jìn)行萃取。合并 有機(jī)層，干燥(Na2S04)，濃縮得到5’ -(N-2-氨基乙基)氨基羰基甲基-霉酚酸⑧。實(shí)施例9、對(duì)苯二甲酸雙-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基)酯(9)的制備向15g(73. 8mmol)的對(duì)苯二甲酰氯中加入300mL的二氯甲烷?；旌衔镌跉鍤夥障?0°C攪拌10分鐘。向反應(yīng)混合物中加入30g(0.26mol)的N-羥基琥珀酰亞胺，然后在0°C滴 加30mL(0. 22mol)的三乙胺?；旌衔锷郎刂潦覝?天。過濾掉固體，殘余物用200mL的二 氯甲烷洗滌。殘余物重新懸浮在300mL的二氯甲烷并攪拌10分鐘。過濾出固體，然后干燥 得到24. lg(66mmol)的⑨，為白色粉末。實(shí)施例10、霉酚酸5’ -取代芳族NHS酯，N_ {2_[ (E) _3_羧基_7_ (4_羥基_6_甲 氧基-7-甲基-3-氧-1，3- 二氫-異苯并呋喃-5-基)-5-甲基-庚-5-烯?；被鵠-乙 基}“對(duì)苯二甲酸單酰胺2，5- 二氧-吡咯烷-1-基酯(叢)
在室溫制備500mg (1. 18mmol)的霉酚酸胺⑧在15mL的無水DMF中的溶液。向該 磁力攪拌的溶液中加入360 □ L(3. 5mmol)的三乙胺。該溶液逐滴加入到428mg(1. 18mmol) 的對(duì)苯二甲酸二 NHS酯在10mL新蒸餾的THF中的溶液中。反應(yīng)混合物在氬氣氛下室溫?cái)?拌18h，然后減壓濃縮。粗產(chǎn)物通過使用梯度流動(dòng)相由含有0. 1% TFA的乙腈-水的RP-制 備HPLC進(jìn)行純化。包含產(chǎn)物的所有餾分凍干得到所需的NHS酯(邊)。實(shí)施例11、霉酚酸免疫原(11)的制備將180mg血藍(lán)蛋白(KLH，Pierce chemical)在7ml的50mM磷酸鉀中的溶液 (pH7. 5)在冰浴中冷卻。向該溶液中逐滴加入10. 5mL的二甲亞砜(DMS0)，將反應(yīng)溫度保持 在低于室溫。向該蛋白溶液中逐滴加入54mg(0. 08mmol)的(邊)在1. 5mL DMF中的溶液。混 合物在室溫?cái)嚢?8h。得到的綴合物被放入滲析管(10，000MW截止)中，然后在70%DMS0在 50mM磷酸鉀的1L溶液(pH7. 5，變化3次，每次至少3小時(shí))、50% DMS0在50mM磷酸鉀中的 1L溶液(至少3h)、30%DMS0在50mM磷酸鉀中的1L溶液(至少3h)、10% DMS0在50mM磷 酸鉀的1L溶液(至少3h)室溫下滲析，然后在4°C用50mM磷酸鉀(pH7. 5)變化6次(每次 1L，每次至少6h)。蛋白濃度通過使用BioRad Coomassie藍(lán)蛋白測(cè)定進(jìn)行確定(Bradford， M.，Anal. Biochem. 72，248，1976)?？傻觅嚢彼嵝揎椀某潭韧ㄟ^ TNBS 方法(Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14，328-34，1988)進(jìn)行確定。實(shí)施例12、霉酚酸BSA綴合物的制備(11)將800mg牛血清白蛋白(BSA)在8mL的50mM磷酸鉀中的溶液(pH7. 5)在冰浴中 冷卻。向該溶液中逐滴加入12mL DMS0，反應(yīng)混合物保持低于室溫。向反應(yīng)混合物中逐滴 加入20mg(0. 030mmol)的霉酚酸衍生物(叢)在lmL無水DMF中的溶液。在室溫?cái)嚢?8h， 得到的綴合物被放入滲析管(10，000MW截止)中，于室溫在70% DMS0在50mM磷酸鉀中的 1L溶液(pH7.5，變化3次，每次至少3小時(shí))、50%DMS0在50mM磷酸鉀中的1L溶液(至 少3h)、30 % DMS0在50mM磷酸鉀中的1L溶液(至少3h)、10 % DMS0在50mM磷酸鉀中的 1L溶液(至少3h)滲析，然后在4°C用50mM磷酸鉀(pH7. 5)變化6次(每次1L至少6h)。 蛋白濃度使用 BioRad Coomassie 藍(lán)測(cè)定進(jìn)行確定(Bradford，M.，Anal. Biochem. 72，248， 1976)。實(shí)施例13、馬來酰亞胺基連接的霉酚酸(E) 2-({2-[3-(2，5-二氧-2，5-二氫-吡 咯-1-基)_丙?；被鵠_乙基氨基甲?；鶀_甲基)-6-(4_羥基-6-甲氧基-7-甲 基-3-氧-1，3- 二氫-異苯并呋喃-5-基)-4-甲基-己-4-烯酸(li)的制備制備200mg (0. 47mmol)的霉酚酸胺⑧在8mL的無水DMF中的溶液。向該溶液中 加入165 □ L(l. 18mmol)的三乙胺。向該溶液中逐滴加入139mg (0. 52mmol) 3-馬來酰亞胺 基-丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯在8mL新蒸餾的THF中的溶液。反應(yīng)混合物在氬氣氛下室 溫?cái)嚢?8h，然后減壓濃縮。粗產(chǎn)物用硅膠柱層析進(jìn)行純化得到所需的馬來酰亞胺基連接的 霉酚酸(li)。實(shí)施例14、霉酚酸-琥珀酰亞胺基_硫丙?；?BSA綴合物(邊)牛血清白蛋白(0. 5g)溶于含有ImMEDTA的50mL的50mM磷酸鉀中。向反應(yīng)混合 物中加入1. 24mL的N-琥珀酰亞胺基S-乙酰硫丙酸酯(SATP)在DMS0中的溶液(在DMS0 中15mg/ml)。反應(yīng)混合物在室溫靜置lh。得到的溶液在三天的時(shí)間里使用50mM磷酸鉀 (pH7. 5) [10，000MW截止]滲析得到BSA-SATP溶液，其在_20°C下儲(chǔ)存以備將來使用。蛋白
8濃度使用 BioRad Coomassie 藍(lán)蛋白測(cè)定進(jìn)行確定(Bradford，M.，Anal. Biochem. 72 :248， 1976)。向5mL的BSA-SATP (9mg/mL)中加入850 □ L下述緩沖液；50mM磷酸鉀、25mM的 EDTA、0. 5M的NH20H、pH7. 2。渦旋該混合物，在室溫靜置2h以去除對(duì)S-乙?；糠值谋Ｗo(hù)。得到的溶液使用3PD 10柱脫鹽，得到5. 5mL包含相應(yīng)脫保護(hù)的硫丙酰-BSA的蛋 白質(zhì)溶液。該溶液冷卻至0°c，逐滴加入4mL的DMS0。向該蛋白溶液中加入10mg(0.017mmol) 的霉酚酸-馬來酰亞胺基衍生物(11)在0. 5mL DMS0中的溶液?；旌衔镌谑覝?cái)嚢?4h。向 該蛋白溶液中加入400 □ L的5mg/mL乙基馬來酰亞胺在DMS0中的溶液，在室溫?cái)嚢?4h。 得到的綴合物被放入滲析管(10，000麗截止)中，在30% DMS0在50mM磷酸鉀中的1L溶 液(pH7. 5，變化3次，每次至少3小時(shí))、20% DMS0在50mM磷酸鉀中的1L溶液(至少3h)、 10%DMS0在50mM磷酸鉀中的1L溶液(至少3h)中滲析，然后在4°C用50mM磷酸鉀(pH7. 5) 變化6次(每次1L每次至少6h)。蛋白濃度通過BioradCoomassie藍(lán)蛋白測(cè)定進(jìn)行確定 (Bradford, M.，and Anal. Biochem. 72 :248，1976)。實(shí)施例15、霉酚酸琥珀酰亞胺基-硫基丁脒基(sulfanylbutyrimidoyD-KLHO^)血藍(lán)蛋白(KLH，60mg，Pierce chemical)在100mM磷酸鈉緩沖液pH7. 2的條件下 重構(gòu)。2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(2-IT，13. 5mg)作為固體加入到該蛋白溶液中，然后在無光室 溫和氬氣氛條件下攪拌該反應(yīng)lh。硫醇化的KLH使用預(yù)先用100mM磷酸鈉緩沖液(pH6. 5) 平衡的S印hadex PD-10柱除鹽。確定每個(gè)KLH分子的硫醇載量。(MW5，000，000)。向6ml 的KLH-(SH)n[4. 7mg/mL]中逐滴加入21mg(036mmol)霉酚酸-琥珀酰亞胺(14)在lmL的 DMF中的溶液，混合物在室溫?cái)嚢?8h。得到的綴合物被放入滲析管(10，000MW截止)中， 在含有20% DMF的1L的PBS緩沖液(180mM NaCl, 10mM磷酸鈉，pH7. 2]中滲析。(3次，每 次至少6h)。然后在4°C用1L的PBS緩沖液pH7. 2處理得到KLH綴合物溶液(邊)。蛋白 濃度通過使用Biorad Coomassie藍(lán)蛋白測(cè)定進(jìn)行確定(Bradford，M.，Anal. Biochem. 72 248，1976)。實(shí)施例16、4’ -(N-2-氨基乙基)_氨基羰基-MPAOI)41mg (0. 1084mmol)的 4，-羧甲基 _MPA(合成方法如在 US6, 811，998 B2，實(shí)施例 43 中所述)，溶解在0. 82ml的THF中，加入8. 77 □ 1的吡啶和15. 3 □ 1的三氟乙酸酐?；旌?物攪拌3小時(shí)，然后加入0. 1084mmol乙二胺在820 □ 1吡啶中的溶液?；旌衔镌谑覝叵聰?拌16小時(shí)，之后通過RP-HPLC在梯度流動(dòng)相為在0. 含水TFA中的乙腈進(jìn)行純化，得到三 氟乙酸鹽形式的產(chǎn)物。實(shí)施例17、4，_(2，5- 二氧-吡咯烷基-氧羰基_4”_苯基_1”_羰基氨基-乙 基-2-氨基羰基甲基)-MPA (18)在室溫制備630mg(l. 18mmol)的4，- (N_2_氨基乙基)-氨基羰基-MPA三氟醋酸 鹽在15mL的無水DMF中的溶液。向該磁力攪拌的溶液中加入360 □ L(3. 5mmol)的三乙胺。 該溶液被逐滴加入到428mg(l. 18mmol)的對(duì)苯二甲酸二 NHS酯在10mL新蒸餾的THF中的 溶液中。反應(yīng)混合物在氬氣氛下室溫?cái)嚢?8h，然后減壓濃縮。粗產(chǎn)物通過使用梯度流動(dòng)相 由含有0. 1% TFA的乙腈-水組成的RP-制備HPLC進(jìn)行純化。包含產(chǎn)物的所有餾分即刻冷 凍，然后凍干得到所需的NHS酯。實(shí)施例18、MPA-4，-KLH免疫原(邊)
KLH免疫原通過和5’-免疫原(U)相似的方式制備，其中將上述的4’-活化的半 抗原(叢)替代5’ -活化的半抗原(邊)。實(shí)施例19、MPA-4，-BSA綴合物(迎)BSA綴合物通過和5’-綴合物(叢)相似的方式制備，其中將上述的4’-活化的半 抗原(叢)替代5’ -活化的半抗原(邊)。雖然已經(jīng)詳細(xì)并參考具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是顯然在不背離在附加的權(quán) 利要求書中定義的本發(fā)明的范圍下，修飾和變化是可能的。更具體的說，盡管本發(fā)明的一些 方面在這里被認(rèn)為是優(yōu)選或特別好的，但是考慮的是本發(fā)明并無需限制在本發(fā)明的這些優(yōu) 選方面。
權(quán)利要求
具有下式的化合物其中L是連接基團(tuán)，其包含排列成直鏈或支鏈的1至40個(gè)碳原子，飽和的或不飽和的，并且包含至多2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子，條件是不多于2個(gè)雜原子可以依次連接且X選自由多肽、多糖以及合成聚合物組成的組。FPA00001172067600011.tif
2.應(yīng)答權(quán)利要求1所述的化合物產(chǎn)生的抗體。
3.具有下式的化合物 其中L是連接基團(tuán)，其包含排列成直鏈或支鏈的1至40個(gè)碳原子，飽和的或不飽和的， 并且包含至多2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)和0-20個(gè)雜原子，條件是不多于2個(gè)雜原子可以依次連接且X選 自由多肽、多糖以及合成聚合物組成的組。
4.應(yīng)答權(quán)利要求3所述的化合物產(chǎn)生的抗體。
全文摘要
本發(fā)明描述了可用于產(chǎn)生抗體的免疫原性化合物，其對(duì)于霉酚酸具有高度特異性，其同霉酚酸的葡糖苷酸代謝物，尤其是和?；咸擒账岽x物，不發(fā)生反應(yīng)或基本沒有交叉反應(yīng)性。
文檔編號(hào)C07D307/88GK101855217SQ200880115816
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日
發(fā)明者M·戈沙爾, R·許, S·拉希德 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司