專利名稱：：一種多肽固相合成比法盧定粗品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多肽固相合成領(lǐng)域，尤其涉及比法盧定(Bivalirudin)粗品的固相合成方法。
背景技術(shù)：
：在肽合成的技術(shù)方面取得了突破性進(jìn)展的是R.BruceMerrifield，他設(shè)計(jì)了一種肽的合成途徑并定名為固相合成途徑。首先將一個(gè)氨基被封閉基團(tuán)保護(hù)的氨基酸共價(jià)連接在固相載體上；在去保護(hù)劑的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個(gè)氨基酸就接到了固相載體上了。然后氨基被封閉的第二個(gè)氨基酸的羧基通過(guò)試劑活化，羧基被DCC活化的第二個(gè)氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度。最后脫去保護(hù)基，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。凝血酶抑制劑被認(rèn)為是很有前途的抗血栓藥通過(guò)凝血酶進(jìn)行的蛋白水解過(guò)程是血液凝結(jié)控制的關(guān)鍵所在?？鼓谋确ケR定(bivalirudin)，即所謂的"二價(jià)水蛭素(himlog)"。水蛭素是一種獲自吸血水蛭一醫(yī)用水蛭///n^ome^"'"fl/"的有效治療性凝血酶肽抑制劑，其包含20個(gè)氨基酸。US20070093423A公開(kāi)了一種多肽固相合成比法盧定的方法，其采用固液相合成方法，其操作繁瑣，使用的切割劑中含有酸性物質(zhì)、乙二硫醇等物質(zhì)。該方法的成本較高，產(chǎn)生的雜質(zhì)多，產(chǎn)品純度有限。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種多肽固相合成比法盧定的新方法，其成本低廉、得到的比法盧定純度高，尤其可以去除HPLC主峰前雜質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種多肽固相合成中的去保護(hù)劑。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種去保護(hù)劑在多肽固相合成中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種五氟苯酚的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，所述的方法包括步驟(1)將Fmoc-氨基酸樹(shù)脂或Fmoc-多肽樹(shù)脂和去保護(hù)劑混合，除去Fmoc保護(hù)基；(2)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹(shù)脂上的氨基酸或多肽進(jìn)行縮合；(3)重復(fù)步驟(i)—(2)，得到如式n所示的多肽樹(shù)脂；和(4)在切割劑的存在下，使多肽樹(shù)脂上的多肽和樹(shù)脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環(huán)脒(DBU);優(yōu)選，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0一20%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—8%3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GIu-Tyr-Leu式IBoc陽(yáng)D-Phe'-Pro2陽(yáng)Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly"-Asp(OtBu)11.Phel2-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)"-Ile15-Pro16-GIu(OtBu)'7-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19丄6112°曙樹(shù)脂式II在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟(1)將樹(shù)脂或連接有氨基酸或多肽的樹(shù)脂和保護(hù)氨基酸混合，形成Fraoc-氨基酸樹(shù)脂或Fmoc-多肽樹(shù)脂；優(yōu)選，所述的樹(shù)脂是Wang樹(shù)脂；(2)Fmoc-氨基酸樹(shù)脂或Fmoc-多肽樹(shù)脂和去保護(hù)劑混合，除去Fmoc保護(hù)基；(3)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹(shù)脂上的氨基酸或多肽進(jìn)行縮合；(4)重復(fù)步驟(2)—(3)，得到如式II所示的多肽樹(shù)脂；和(5)在切割劑的存在下，使多肽樹(shù)脂上的多肽和樹(shù)脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環(huán)脒(DBU);優(yōu)選，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0一20%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—8%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)_酮(H00BT)D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu式IBoc-D-Phe'-ProZ隱Arg(Pbf)3-Pro4-GlyS-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly'0-Asp(O迅u)11.Phe'2-GIu(OtBu)"-Glu(OtBu)'4-Ile'5-Pro'6-Glu(OtBu)'乙Glu(OtBu)"-Tyr(tBu)'9-Leu2。-樹(shù)脂式II在另一優(yōu)選例中，所述的去保護(hù)劑含有5—15%哌啶和1一7%二環(huán)脒(DBU);更佳地，所述去保護(hù)劑還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0.5—10%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、2—5%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)和步驟(2)中所述的樹(shù)脂上的氨基酸是亮氨酸；步驟(2)中所述帶有Boc的氨基酸是Boc-D-Phe-0H。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中將Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚以及縮合劑混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-0H和樹(shù)脂上的多肽進(jìn)行縮合。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)中所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N，-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-;i-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-1-基)-N,N,N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲基嗎啉(麗M)、(苯并三唑-l-基-氧)三吡咯垸轔六氟磷酸(PyB0P)、l一羥基苯并三唑(H0Bt)。在另一優(yōu)選例中，步驟(4)中所述的切割劑中的各物質(zhì)配比為95—60三氟乙酸(TFA):5—10三異丙基硅烷(TIS):5—30水。在另一優(yōu)選例中，所述切割液用冰水浴或其它致冷劑冷卻至0±2°C。在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(2)重復(fù)1一3次。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種多肽固相合成中的去保護(hù)劑，所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環(huán)脒(DBU);更佳地，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0_20%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—10%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。在另一優(yōu)選例中，所述的去保護(hù)劑中含有5—15%哌啶和1一7%二環(huán)脒(DBU);更佳地，所述去保護(hù)劑還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0.5—10%1—羥基苯并三唑(HOBt)、0.2—5%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種去保護(hù)劑在多肽固相合成中的應(yīng)用，所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環(huán)脒(DBU)，所述的多肽中含有-Asn-Gly-結(jié)構(gòu)；更佳地，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0—20%l—羥基苯并三唑(H0Bt)、0—10%3-羥基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種五氟苯酚的用途，用于多肽固相合成中，將保護(hù)氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和樹(shù)脂上的氨基酸或多肽縮合的步驟。在另一優(yōu)選例中，所述步驟是將1.5—6.0當(dāng)量保護(hù)氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，以及1.5—6.0當(dāng)量的縮合劑，和連接有氨基酸或多肽的樹(shù)脂混合12—36小時(shí)；所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N，-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-l-基)-N，N，N,N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸(PyB0P)、l一羥基苯并三唑(H0Bt)、N-甲基嗎啉(麗M)。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種多肽固相合成比法盧定的新方法，其成本低廉、得到的比法盧定純度高，尤其可以去除HPLC主峰前雜質(zhì)。具體實(shí)施方式發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了在多肽固相合成比法盧定的過(guò)程中，如果使用含有DMF、哌啶、DBU、H0Bt、H00BT的去保護(hù)劑，可以使雜質(zhì)最小化，尤其是DBU其對(duì)主峰前雜質(zhì)的影響非常重要。進(jìn)一步地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在多肽固相合成過(guò)程中，針對(duì)-Asn-Gly-結(jié)構(gòu)，使用含有哌啶、DBU、H00BT和H0Bt中的一種或多種物質(zhì)組成的保護(hù)劑尤其有效。另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在多肽固相合成比法盧定的過(guò)程中，針對(duì)縮合步驟，可加入含有HOBt/DIC或TBTU/腿M的縮合劑，并且在縮合過(guò)程中進(jìn)行監(jiān)測(cè)；而針對(duì)縮合精氨酸(Arg)的步驟，其中還需含有五氟苯酚，可以有效降低成本。本發(fā)明中所使用的縮寫(xiě)的含義列于下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PyB0P(苯并三唑-l-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸如本文所用，"去保護(hù)劑"是指可以將連接在氨基酸上的氨基保護(hù)劑去除的化學(xué)試劑，所述的氨基保護(hù)劑可以使本領(lǐng)域熟知的，例如但不限于，F(xiàn)moc，Boc;優(yōu)選地，本發(fā)明的去保護(hù)劑含有以其總體積計(jì)，含有3—20%哌啶和0.5—10%二環(huán)脒(DBU);優(yōu)選，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0—20%1—羥基苯并三唑(HOBt)、0—10%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。如本文所用，"縮合劑"是指使一個(gè)氨基酸的氨基和另一個(gè)氨基酸的羧基縮合形成肽鍵的化學(xué)試劑，可以使本領(lǐng)域熟知的，例如但不限于，碳二亞胺、ByP0B、HATU、TBTU。如本文所用，"切割劑"是指將同樹(shù)脂鍵合的多肽和樹(shù)脂分離的化學(xué)試劑，可以使本領(lǐng)域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HC1溶液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明多肽固相合成比法盧定的制備方法包括以下步驟第一步，將Fmoc-亮氨酸(Fmoc-Leu)鍵合到樹(shù)脂上。所使用的樹(shù)脂可以使本領(lǐng)域所熟知的，優(yōu)選Wang樹(shù)脂，更優(yōu)選Wang樹(shù)脂的替代率為1.O-l.4mmol/g。第二步，使用本發(fā)明的去保護(hù)劑脫除Fnioc基團(tuán)，即用本發(fā)明的去保護(hù)劑洗滌第一步所獲得的Fmoc-Leu-樹(shù)脂以去除Fmoc基團(tuán)。第三步，是將Fmoc-氨基酸和樹(shù)脂上的氨基酸縮合，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，是將氨基酸根據(jù)式I所示的多肽自C端向N端逐一縮合，直至在樹(shù)脂上鍵合有如式I所示的多肽。第四步，在切割劑存在下，使多肽樹(shù)脂上的如式I所示多肽和樹(shù)脂分離，得到比法盧定。所述切割劑中含有TFA、TIS和水。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，第一步中將1.8—3.0倍的Fmoc_Leu-0H和Wang樹(shù)脂反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，第三步是將l.5-4.5倍樹(shù)脂當(dāng)量的Fmoc-氨基酸，1.5-3.0倍樹(shù)脂當(dāng)量的H0Bt用lmL/g樹(shù)脂量的DMF溶解后排加入到樹(shù)脂中，再加入2.0-6.0倍樹(shù)脂當(dāng)量的DIC或TBTU反應(yīng)90鐘后。將上述溶液在l(TC下，再用DMF將上述溶液稀釋至4mL/g樹(shù)脂的體積，反應(yīng)6小時(shí)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第三步中有關(guān)Fmoc-Arg(Pbf)-0H的縮合步驟是這樣進(jìn)行的1.5-6.0當(dāng)量的Fmoc-Arg(Pbf)-0H和五氟苯酚，用3毫升每克樹(shù)脂量的DMF或KSCN溶解后，再加入1.5-6.0當(dāng)量的縮合劑，如DIC或HATU或TBTU或PyB0P，攪拌90分鐘，將上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到樹(shù)脂中，攪拌反應(yīng)12-36小時(shí)。本發(fā)明通過(guò)上述四步得到的比法盧定，產(chǎn)率可以是90—125%，其純度可以達(dá)到77-93%。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，還可以將第四步得到的比法盧定進(jìn)行沉降，是將第四步得到的如式I的多肽和MTBE或乙醚混合，形成多肽沉淀；較佳地，是用冰水浴或本領(lǐng)域熟知的其它致冷劑將MTBE或乙醚冷卻至零下10至0'C，用另一種醚洗滌、分離。將沉淀混合物過(guò)濾或離心分離沉淀，得到純化的比法盧定，其純度可達(dá)到90%或以上。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、大大節(jié)約成本通過(guò)比較樹(shù)脂、特殊氨基酸的合成等方面的傳統(tǒng)工藝和本發(fā)明的工藝，可以降低成本約50%。2、降低雜質(zhì)，提高純度現(xiàn)有技術(shù)中比伐盧定粗品中純度約77-93%左右，其中主峰前雜質(zhì)可控制在〈1%。3、危險(xiǎn)系數(shù)降低采用少量乙醚，大大提高了生產(chǎn)的安全性。乙醚閃點(diǎn)-45'C,沸點(diǎn)34.6°C,為極易燃化學(xué)物品。甲基叔丁基醚閃點(diǎn)-28°C，沸點(diǎn)55.3'C。4、環(huán)保，產(chǎn)生廢棄物少本發(fā)明的生產(chǎn)工藝完全為固相合成法，因此幾乎為無(wú)水生產(chǎn)，洗滌用的有機(jī)溶劑可回收循環(huán)再利用，產(chǎn)生廢棄物少。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計(jì)。本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。本發(fā)明實(shí)施例中所用HPLC方法為<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明中比法盧定出峰時(shí)間約23.7分鐘，主要雜質(zhì)為23-23.3分鐘,實(shí)施例1制備比法盧定1步驟一Fmoc-亮氨酸鍵合步驟2.0equivalentmolFmoc-亮氨酸，經(jīng)2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化與Wang樹(shù)脂(替代率1.2-1.4mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反應(yīng)。步驟二Fmoc脫除步驟用15%哌啶/5%DBU的DMF溶液30分鐘脫除Fmoc基團(tuán)。再用DMF洗滌樹(shù)脂1遍；甲醇洗滌樹(shù)脂3遍；DMF洗滌樹(shù)脂3遍。Fmoc-氨基酸(Boc-D-Phe-0H最后一個(gè)氨基酸縮合)縮合步驟2.0-3.0倍樹(shù)脂當(dāng)量的Fmoc-氨基酸，1.5倍樹(shù)脂當(dāng)量的H0Bt用3mL/g樹(shù)脂量的DMF溶解后加入到樹(shù)脂中，再加入3.0倍樹(shù)脂當(dāng)量的DIC.反應(yīng)90鐘后，用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控，控制溫度到10oC，再用DMF將上述溶液稀釋至4mL/g樹(shù)脂的體積，反應(yīng)6小時(shí)。Fmoc-Arg(Pbf)-OH縮合步驟1.5當(dāng)量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚用1毫升每克樹(shù)脂量的DMF溶解后，再加入6.0當(dāng)量的HATU，攪拌90分鐘，將上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-0Pfp酯/DMF溶液加入到樹(shù)脂中，控制溫度到5-8oC,攪拌反應(yīng)48小時(shí)。用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控.合成完畢洗滌步驟完成多肽序列的所有氨基酸縮合后，樹(shù)脂用甲醇洗滌2遍，再用DMF洗滌3遍，最后用洗滌3遍。然后樹(shù)脂在真空下干燥直至很重。最后包裝好樹(shù)脂，并根據(jù)樹(shù)脂增重計(jì)算合成產(chǎn)率。步驟三切割液配制在一個(gè)合適大小的容器里將三氟乙酸(TFA)/三乙丙基硅烷(TIS)/水，按80:10:10(體積比)的配比混合，配制切割液。再將上述切割液用冰水浴或其它致冷劑冷卻至0土2°C。切割將多肽樹(shù)脂慢慢加入到冷卻好的切割液中，維持混合液溫度在5°C以下，在此溫度下攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)。過(guò)濾分離混合液，收集所有濾液，去除樹(shù)脂。沉降將甲基叔丁基醚(MTBE)冷卻至-100C，將過(guò)濾后多肽溶液加入其中形成多肽沉淀。將得到的固體沉淀用冷的乙醚洗滌3次。每次洗滌時(shí)，用足夠覆蓋離心袋或者過(guò)濾器中的固體沉淀的乙醚，并用刮鏟混合固體沉淀和乙醚，然后再次用用離心機(jī)分離沉淀，得到比法盧定I。產(chǎn)品干燥將如式I所示的比法盧定I多肽固體轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的容器中，在真空干燥箱或者干燥器中室溫干燥6小時(shí)以上。稱量多肽固體，并將其裝入一個(gè)合適的容器。產(chǎn)品純度85%，主峰前雜質(zhì)(保留時(shí)間23.2分鐘)含量小于1%，最大單一雜質(zhì)(保留時(shí)間26.3分鐘)含量小于2.5%。實(shí)施例2制備比法盧定2Fmoc-亮氨酸鍵合步驟3.0equivalentmolFmoc-亮氨酸經(jīng)2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化與Wang樹(shù)脂(替代率1.0-1.2mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反應(yīng)。樹(shù)脂上未反應(yīng)的基團(tuán)由苯甲酰氯/三乙胺封閉。步驟二Fmoc脫除步驟用5倍樹(shù)脂床層體積的10。/6哌啶/7。/。DBU/3。/。HOOBT的匿F溶液30分鐘脫除Fmoc基團(tuán)。再用5倍樹(shù)脂床層體積的DMF洗滌樹(shù)脂1遍；5倍樹(shù)脂床層體積的甲醇洗滌樹(shù)脂3遍；5倍樹(shù)脂床層體積的DMF洗滌樹(shù)脂3遍。Fmoc-氨基酸(Boc-D-Phe-0H最后一個(gè)氨基酸縮合)縮合步驟1.5-2.0倍樹(shù)脂當(dāng)量的Fmoc-氨基酸，3.0倍樹(shù)脂當(dāng)量的HOBt用5mL/g樹(shù)脂量的DMF溶解后加入到樹(shù)脂中，再加入3.0倍樹(shù)脂當(dāng)量的TBTU/麗M.反應(yīng)90鐘后，小時(shí)用茚三酮顯色法(Kaiser)監(jiān)控反應(yīng)是否結(jié)束，繼續(xù)反應(yīng)。Fmoc-Arg(Pbf)-0H縮合步驟6.0當(dāng)量的Fmoc-Arg(Pbf)-0H和五氟苯酚用4毫升每克樹(shù)脂量的DMF溶解后，再加入1.5當(dāng)量的DIC，攪拌90分鐘，將上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到樹(shù)脂中，攪拌反應(yīng)18小時(shí)。合成完畢洗滌步驟完成多肽序列的所有氨基酸縮合后，樹(shù)脂用5倍樹(shù)脂體積的甲醇洗滌2遍，再用5倍體積的DMF洗滌3遍，最后用5倍樹(shù)脂體積的甲醇洗滌3遍。然后樹(shù)脂在真空下干燥直至很重。最后包裝好樹(shù)脂，并根據(jù)樹(shù)脂增重計(jì)算合成產(chǎn)率。步驟三切割液配制在一個(gè)合適大小的容器里將三氟乙酸(TFA)/三乙丙基硅烷(TIS)/水，按90:5:5(體積比)的配比混合，配制切割液。再將上述切割液用冰水浴或其它致冷劑冷卻至0±2°C。多肽樹(shù)脂和切割液混合，維持混合液溫度在5°C以下。反應(yīng)2-3小時(shí)。過(guò)濾，收集所有濾液。沉降乙醚冷卻至_10°(:，將多肽溶液加入其中，形成多肽沉淀。用過(guò)濾或離心分離沉淀。將得到的固體沉淀用冷的甲基叔丁基醚洗滌3次。每次洗滌時(shí)，用足夠覆蓋離心袋或者過(guò)濾器中的固體沉淀的甲基叔丁基醚，并用刮鏟混合固體沉淀和甲基叔丁基醚，然后再次用用離心機(jī)分離沉淀，得到比法盧定n。產(chǎn)品干燥將如式I所示的比法盧定多肽II固體轉(zhuǎn)移到一個(gè)合適的容器中，在真空干燥箱或者干燥器中室溫干燥6小時(shí)以上。稱量多肽固體，并將其裝入一個(gè)合適的容器。產(chǎn)品純度87%，主峰前雜質(zhì)(保留時(shí)間23.5分鐘)含量0.63%，最大單一雜質(zhì)(保留時(shí)間27.l分鐘)含量2.1%。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。權(quán)利要求1.一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將Fmoc-氨基酸樹(shù)脂或Fmoc-多肽樹(shù)脂和去保護(hù)劑混合，除去Fmoc保護(hù)基；(2)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹(shù)脂上的氨基酸或多肽進(jìn)行縮合；(3)重復(fù)步驟(1)-(2)，得到如式II所示的多肽樹(shù)脂；和(4)在切割劑的存在下，使多肽樹(shù)脂上的多肽和樹(shù)脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二環(huán)脒(DBU)；優(yōu)選，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0-20％1-羥基苯并三唑(HOBt)、0-8％3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)<tablesid="tabl0001"num="0001"><table><tgroupcols="2"><colspeccolname="c001"colwidth="91%"/><colspeccolname="c002"colwidth="9%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu</entry><entrymorerows="1">式I</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-樹(shù)脂</entry><entrymorerows="1">式II</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的去保護(hù)劑含有5一15%哌啶和1一7%二環(huán)脒(DBU);優(yōu)選，所述去保護(hù)劑還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0.5—10%1—羥基苯并三唑(H0Bt)、2—5%3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(H00BT)。3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)和步驟(2)中所述的樹(shù)脂上的氨基酸是亮氨酸；步驟(2)中所述帶有Boc的氨基酸是Boc-D-Phe-0H。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中將Fmoc-Arg(Pbf)-0H和五氟苯酚以及縮合劑混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-0H和樹(shù)脂上的多肽進(jìn)行縮合。5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0_(苯并三唑-1-基)-N,N，N,N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲基嗎啉(NMM)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸(PyB0P)、l一羥基苯并三唑(H0Bt)。6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的切割劑中的各物質(zhì)配比為95—60三氟乙酸(TFA):5—IO三異丙基硅烷(TIS):5—30水。7.—種多肽固相合成中的去保護(hù)劑，其特征在于，所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環(huán)脒(DBU);優(yōu)選，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0—20%1—羥基苯并三唑(HOBt)、0—腦3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。8.—種去保護(hù)劑在多肽固相合成中的應(yīng)用，其特征在于，所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3—20%哌啶和0.5—10%二環(huán)脒(DBU)，所述的多肽中含有-Asn-Gly-結(jié)構(gòu)；優(yōu)選，所述的去保護(hù)劑中還含有選自下述的一種或多種物質(zhì)0—20%l—羥基苯并三唑(HOBt)、0—10%3-羥基-1，2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。9.一種五氟苯酚的用途，其特征在于，用于多肽固相合成中，將保護(hù)氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和樹(shù)脂上的氨基酸或多肽縮合的步驟。10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述步驟是將1.5—6.0當(dāng)量保護(hù)氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，以及1.5_6.0當(dāng)量的縮合劑，和連接有氨基酸或多肽的樹(shù)脂混合12—36小時(shí)；所述的縮合劑選自下述的一種或多種N，N，-二異丙基碳二亞胺(DIC)、0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-1_基)-N，N,N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、(苯并三唑-l-基-氧)三吡咯烷鱗六氟磷酸(PyBOP)、1—羥基苯并三唑(HOBt)、N-甲基嗎啉(NMM)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種多肽固相合成比法盧定(Bivalirudin)粗品的制備方法，所述的方法包括步驟(1)將Fmoc-氨基酸樹(shù)脂或Fmoc-多肽樹(shù)脂和去保護(hù)劑混合，除去Fmoc保護(hù)基；(2)在縮合劑的存在下，使帶有Fmoc或Boc的氨基酸和樹(shù)脂上的氨基酸或多肽進(jìn)行縮合；(3)重復(fù)步驟(1)-(2)，得到如式II所示的多肽樹(shù)脂；和(4)在切割劑的存在下，使多肽樹(shù)脂上的多肽和樹(shù)脂分離，得到如式I所示的比法盧定；所述去保護(hù)劑以其總體積計(jì)，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二環(huán)脒(DBU)。文檔編號(hào)C07K1/04GK101555274SQ20091005131公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2009年5月15日優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日發(fā)明者劉亞?wèn)|,張國(guó)慶,張若平,白俊才申請(qǐng)人:上海昂博生物技術(shù)有限公司