專利名稱：木瓜蛋白酶抗原表位、抗木瓜蛋白酶抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，涉及一種木瓜蛋白酶抗原表位、抗 木瓜蛋白酶抗體。本發(fā)明還涉及分別含有所述抗原表位或抗體的組合物、以及所述抗體在 檢測木瓜蛋白酶中的用途。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶(papain)(酶分類號EC 3. 4. 2 2)屬于半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteases, CPs)，也是重要的蛋白水解酶。木瓜蛋白酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在人類、 狗、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅、蚊子、線蟲、擬南芥和水稻中具有保守的結(jié)構(gòu)(SEQ ID NO 1)。研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶通常以酶原的形式存在于細(xì)胞之中，通過分子內(nèi)或分子間 蛋白水解而被激活，通過其活性中心半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)作為親核試劑催化多肽鏈內(nèi) 部的α -肽鍵的水解，作用于蛋白質(zhì)中L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸殘基羧 基參與形成的肽鍵，能切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，生成分子量較小的多肽，屬于肽鏈內(nèi)切酶 (Structure-function relationships in class CAl cysteine peptidase propeptides, 2003, Bernd ffiederanders, Institute of Biochemistry, Vol. 50, No.3/2003,691 713)。在水稻中，木瓜蛋白酶由位于第7號染色體上的基因0s07g0480900 (GenBank中的 ID號為NP_001059639. 1)編碼，編碼框長1131bp(SEQ ID NO :2)，編碼的木瓜蛋白酶(SEQ ID NO 3)具有376個(gè)氨基酸。然而，迄今為止，在水稻生長發(fā)育過程中表達(dá)的木瓜蛋白酶基因的功能研究目前 并不清楚。并且在現(xiàn)有技術(shù)中，通常制備的多克隆抗體特異性不高，用于檢測目標(biāo)物質(zhì)會存 在準(zhǔn)確性不足的問題。另一方面，如果用木瓜蛋白酶制備抗原的話，無論是從重組表達(dá)還是 化學(xué)合成，全長的氨基酸序列有376個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重建是一個(gè)很困難的工 作，再現(xiàn)與生物體內(nèi)相同的空間構(gòu)象仍然是現(xiàn)階段蛋白質(zhì)學(xué)研究的難點(diǎn)。一般來說抗原表 位合成簡易，準(zhǔn)確性高，成本低廉，空間構(gòu)象容易再現(xiàn)，因此有必要開發(fā)一種具有代表木瓜 蛋白酶本身的抗原表位(antigenic determinant, AD)(又稱抗原決定簇，是指抗原分子中 決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán))來代替全長蛋白。盡管目前已經(jīng)有用于預(yù)測抗原表位的軟件，例如ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件，但是預(yù)測得 到的抗原表位中會有30%左右的非有效抗原表位，即不能特異性地代表抗原的抗原表 位，或者不能引發(fā)免疫應(yīng)答(Chang HT, Liu CH, Pai Tff. Estimation and extraction of B-cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches.J MolRecognit. 2008 Nov-Dec ；21 (6) :431_41)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明人在通過BEPIT0PE軟件預(yù)測得到多個(gè)抗原表位序列 的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和不懈的努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)測的32個(gè)抗原表位中有一個(gè)抗原表位序列HGVTPFSDLTREE(SEQ ID NO 4)是最有效的抗原表位，并且其具有良好的抗原特 異性，并且制備了能與該蛋白酶特異免疫結(jié)合的抗體，該抗體具有足夠的靈敏性和準(zhǔn)確性。 由此提供了下述發(fā)明本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種木瓜蛋白酶抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為了增加與載體的交聯(lián)性，在上述抗原表位 的C末端添加了 一個(gè)半胱氨酸(半胱氨酸提供二硫鍵與載體交聯(lián))，得到序列為 HGVTPFSDLTREEC(SEQ ID NO 5)的抗原表位。半胱氨酸也可以加在多肽的N末端，得到序列為CHGVTPFSDLTREE(SEQ ID NO 6) 的抗原表位。末端加1個(gè)半胱氨酸就可以了。如果在同一端加多個(gè)半胱氨酸，導(dǎo)致成本上升，并 且二硫鍵密度太大，而實(shí)際上也不需要這么多二硫鍵。另外不宜在N末端和C末端都加半 胱氨酸，因?yàn)橐粋€(gè)抗原表位和一個(gè)載體結(jié)合，如果在兩端分別加1個(gè)半胱氨酸，半胱氨酸與 載體結(jié)合后，抗原表位少了游離端，反而不利于產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的抗原表位可以通過常規(guī)的肽合成技術(shù)化學(xué)合成得到，也可以在適當(dāng)?shù)乃?主中表達(dá)得到；優(yōu)選的是化學(xué)合成。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其包含SEQ ID NO :4或SEQID NO :5或SEQ ID NO :6所示的木瓜蛋白酶抗原表位，任選地，可以含有免疫佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐 劑、或者弗氏不完全佐劑等。本發(fā)明的還一方面涉及一種木瓜蛋白酶抗原表位-載體復(fù)合物；其中，所述木瓜 蛋白酶抗原表位為本發(fā)明的木瓜蛋白酶抗原表位，所述載體可以是鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)、 BSA、或酪蛋白等。本發(fā)明的還一方面涉及一種抗木瓜蛋白酶抗體，所述抗木瓜蛋白酶抗體能夠特異 性地結(jié)合SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所示的木瓜蛋白酶抗原表位。所 述抗木瓜蛋白酶抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。本發(fā)明的抗木瓜蛋白酶多克隆抗體可以得自各種常規(guī)制備多克隆抗體的動(dòng)物，例 如山羊，兔子，大鼠，小鼠等。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以根據(jù)SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5或SEQ ID NO: 6所示的木瓜蛋白酶抗原表位制備單克隆抗體，具體操作可以參見本領(lǐng)域的技術(shù)手冊，也可 以參考文獻(xiàn)例如 Nature 1975Kohler&Milstein Vol 256，p495。本發(fā)明的還一方面涉及一種含有抗木瓜蛋白酶多克隆抗體的血清(簡稱多抗血 清)，其通過使用SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6所示的抗原表位免疫動(dòng)物 制得。本發(fā)明的還一方面涉及一種抗木瓜蛋白酶多克隆抗體制備方法，包括將SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所示的木瓜蛋白酶抗原表位作為抗原免疫動(dòng)物的步 驟。任選地，所述免疫步驟可以加入佐劑，例如氫氧化鋁、弗氏完全佐劑、或者弗氏不完全佐
劑，等等。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗木瓜蛋白酶多克隆抗體制備方法，包括如下步 驟
1)將SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6所示的木瓜蛋白酶抗原表位 作為抗原免疫動(dòng)物；2)取血，離心收集多抗血清；和3)純化步驟2)中的多抗血清，得到抗木瓜蛋白酶多克隆抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種組合物，其包含本發(fā)明的抗木瓜蛋白酶多克隆抗體。本發(fā)明的還一方面涉及一種木瓜蛋白酶檢測劑，其包含本發(fā)明的抗木瓜蛋白酶多 克隆抗體。其中由于木瓜蛋白酶在多個(gè)物種中是保守的(見下面的SEQ ID N0:1)，而且本 發(fā)明中作為抗原表位的SEQ ID NO :4存在于保守序列中(參見SEQ ID NO :1中加框的序 列)，因此本發(fā)明的多克隆抗體不僅可以檢測水稻中的木瓜蛋白酶，也可以檢測其它多個(gè)物 種(例如人類、狗、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅、蚊子、線蟲、擬南芥等)中的木瓜蛋白酶。MAAAPARLXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXIRQVTDGGYWPPGLLPEAQFAAFVRRHGREYSGPEEYXXXX
xxxxxxxxxxxxxxxxdptar|hgVTPFSDLTREE|fearltglaadvgddvrrrpmpsaapateeevsglpasfd
WRDRGAVTDVKMQGACGSCWAFSTTGAVEGANFLATGNLLDLSEQQLVDCDHTCDAEKKTECDSGCGGGLMTNAYAY LMSSGGLMEQSAYPYTGAQGTCRFDANRVAVRVANFTVVAPPXXXXXXXXAQMRAALVRHGPLAVGLNAAYMQTYVG GVSCPLVCPRAWVNHGVLLVGYGERGFAALRLGHRPYWIIKNSffGKAffGEQGYYRLCRGRNVCGVDTM (SEQ ID NO 1)其中，X代表任意氨基酸，加邊框的序列為SEQ ID NO :4。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的抗木瓜蛋白酶多克隆抗體在制備檢測木瓜蛋白 酶的藥物中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種檢測木瓜蛋白酶的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的 抗木瓜蛋白酶多克隆抗體的步驟。具體地，包括如下步驟1)將待測樣品與本發(fā)明的抗木瓜蛋白酶多克隆抗體孵育，使所述的抗木瓜蛋白酶 多克隆抗體與待測樣品中的木瓜蛋白酶特異性結(jié)合，由此形成免疫復(fù)合物；和2)檢測是否存在免疫復(fù)合物。上述檢測木瓜蛋白酶的方法可以檢測木瓜蛋白酶的有無、對其進(jìn)行半定量(例如 western blot方法)；在有木瓜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，還可以通過ELISA方法對木瓜蛋白 酶進(jìn)行定量檢測。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述木瓜蛋白酶為水稻的木瓜蛋白酶。具體的，所述 水稻為水稻93-11。發(fā)明的有益效果1)本發(fā)明提供的多克隆抗體，特異性高；2)本發(fā)明提供的木瓜蛋白酶抗原合成簡易，準(zhǔn)確性高。本發(fā)明提供的抗原表位是 經(jīng)軟件預(yù)測選出的抗原表位片段后化學(xué)合成的，片段短小，容易合成，空間構(gòu)象再現(xiàn)容易。3)本發(fā)明提供的多克隆抗體可用于所有檢測木瓜蛋白酶存在與否的試劑。4)本發(fā)明提供的多克隆抗體可對水稻中木瓜蛋白酶在不同時(shí)空、不同生長條件下 的表達(dá)情況進(jìn)行分析研究，將為進(jìn)一步解釋木瓜蛋白酶乃至半胱氨酸蛋白酶的功能和作用 機(jī)理、以及木瓜蛋白酶抑制劑的研究提供重要的線索。


圖1 使用抗木瓜蛋白酶多克隆抗體1對木瓜蛋白酶在水稻不同組織的免疫印跡 檢測結(jié)果。圖2 多抗1檢測的木瓜蛋白酶的一級質(zhì)譜圖。圖3 多抗1檢測的木瓜蛋白酶的二級質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理 解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 候選抗原表位1的預(yù)測水稻木瓜蛋白酶對應(yīng)的基因在GenBank中的基因ID是NP_001059639. 1。讀碼框 序列如下ATGGCTGCTGCACCTGCACGGCTCGTCGTCCTTGTCCTCGTGGCGGTCGTCGTCGTCGTCGGCGGCGAC GGCGACGCCGGCGTCATCCGGCAGGTGACGGACGGCGGGTACTGGCCGCCGGGGCTGCTCCCGGAGGCCCAGTTCGC GGCGTTCGTGCGGCGGCACGGGCGGGAGTACTCCGGGCCGGAGGAGTACGCGCGGCGGCTGCGCGTGTTCGCCGCCA ACCTCGCCCGCGCCGCGGCGCACCAGGCGCTCGACCCGACCGCGCGCCACGGCGTCACCCCGTTCTCCGACCTCACC CGGGAGGAGTTCGAGGCGCGCTTGACGGGCCTCGCCGCCGACGTTGGCGACGACGTCCGGAGGCGGCCGATGCCGTC CGCCGCGCCGGCCACGGAGGAGGAGGTGTCCGGCCTCCCCGCCAGCTTCGACTGGCGTGACAGGGGCGCCGTGACCG ACGTCAAGATGCAGGGCGCGTGCGGCTCCTGCTGGGCCTTCAGCACCACCGGCGCCGTCGAGGGCGCCAACTTCCTC GCCACCGGCAACCTCCTCGACCTCAGCGAGCAGCAGCTCGTCGACTGCGACCACACGTGCGACGCGGAGAAGAAGAC GGAGTGCGACAGCGGGTGCGGCGGCGGGCTGATGACGAACGCCTACGCCTACCTGATGAGCTCGGGGGGGCTGATGG AGCAGAGCGCGTACCCATACACGGGCGCGCAGGGGACGTGCCGGTTCGACGCCAACCGGGTCGCCGTCCGCGTCGCC AACTTCACCGTCGTCGCGCCGCCGGGCGGCAACGACGGCGACGGCGACGCGCAGATGCGGGCGGCGCTGGTGCGGCA CGGCCCGCTAGCCGTGGGTCTGAACGCGGCGTACATGCAGACGTACGTGGGCGGGGTGTCGTGCCCGCTGGTGTGCC CGCGCGCGTGGGTGAACCACGGCGTGCTCCTCGTCGGCTACGGCGAGCGTGGGTTCGCGGCGCTGCGGCTGGGCCAC CGCCCCTACTGGATCATCAAGAACTCGTGGGGGAAGGCGTGGGGGGAGCAGGGCTACTACCGGCTCTGCCGCGGCCG CAACGTCTGCGGCGTCGACACCATGGTCTCCGCCGTCGCTGTCGCCCCGCCGCCGCCGTGA (SEQ ID NO 2)所編碼的水稻木瓜蛋白酶全長序列如下MAAAPARLVVLVLVAVVVVVGGDGDAGVIRQVTDGGYWPPGLLPEAQFAAFVRRHGREYSGPEEYARRL RVFAANLARAMHQALDPTARjHGVTPFSDLTREEtFEARLTGLAADVGDDVRRRPMPSAAPATEEEVSGLPASFDffR DRGAVTDVKMQGACGSCWAFSTTGAVEGANFLATGNLLDLSEQQLVDCDHTCDAEKKTECDSGCGGGLMTNAYAYLM SSGGLMEQSAYPYTGAQGTCRFDANRVAVRVANFTVVAPPGGNDGDGDAQMRAALVRHGPLAVGLNAAYMQTYVGGV SCPLVCPRAffVNHGVLLVGYGERGFAALRLGHRPYWIIKNSWGKAffGEQGYYRLCRGRNVCGVDTMVSAVAVAPPPP (SEQ ID NO :3，其中加框的序列為SEQ ID NO 4)然后根據(jù)SEQ ID NO :3，用ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件對水稻木瓜蛋白酶基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn) 行抗原表位的預(yù)測。本實(shí)施例中使用了 ΒΕΡΙΤ0ΡΕ軟件提供的五種方法StandarcUKarplus、Emini> Amphiphi、Pellequer,cons_Sta_Kar_Emi_Amp_Pel,PJf
有參數(shù)選擇默認(rèn)。具體方法可以參考Odorico M, Pellequer J L. BEPITOPE :predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins[J]. J Mol Recognit, 2003,16(1) :20-22o一共預(yù)測得到了 32個(gè)候選的抗原表位，選出抗原表位峰值較高的片段 HGVTPFSDLTREE(SEQ ID NO 4)。然后該片段在水稻蛋白質(zhì)庫(RAP-DB數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址http//rapdb. dna. affrc. go.jp/)進(jìn)行唯一性檢索(蛋白序列比對)，確定了該片段在水稻蛋白質(zhì)庫中的唯一性。實(shí)施例2 抗原表位1的化學(xué)合成實(shí)施例1中得到的候選抗原表位1的兩端沒有半胱氨酸，為了實(shí)現(xiàn)與載體的交聯(lián)， 合成的序列需加入半胱氨酸，因此要合成的多肽序列為01GVTPFSDLTREE(SEQ ID NO :6)。對SEQ ID NO 6所示的多肽序列進(jìn)行化學(xué)合成(由吉爾生化公司合成)，得到木 瓜蛋白酶的抗原表位1。實(shí)施例3 抗原表位I-KLH復(fù)合物的制備采用戊二醛連接法，將實(shí)施例2中合成的抗原表位1的N端與交聯(lián)載體蛋白-鑰 孔戚血藍(lán)素(KLH)交聯(lián)，得到抗原表位I-KLH復(fù)合物。具體實(shí)施步驟如下將5mg合成多肽加入7mg KLH中，邊震蕩邊緩慢加入新鮮配制的3g/L戊二醛溶液 lml，室溫孵育2h。以pH8. 5的硼酸緩沖液透析24h，得到抗原表位I-KLH復(fù)合物。實(shí)施例4 多抗血清1的制備取l-2mg實(shí)施例3中制備的抗原表位I-KLH復(fù)合物，免疫新西蘭大白兔，每隔14 天加強(qiáng)免疫一次 ’第2次加強(qiáng)免疫后7天，耳靜脈取血，分離血清(5000rpm離心IOmin)，收 集上清，測效價(jià)。同時(shí)按照相同的步驟，用抗原表位1 (SEQ ID NO 6)作為對照。具體步驟如下取l-2mg實(shí)施例3中制備的抗原表位I-KLH復(fù)合物與等量的完全福氏佐劑充分乳 化，形成油水包，于兔頸部和背部皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)約100 μ g。2周后加強(qiáng)免疫，劑量同 前，用不完全福氏佐劑充分乳化后，于兔背部皮下多點(diǎn)注射；以后隔2周加強(qiáng)免疫1次；從 第2次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫7天后，經(jīng)耳靜脈取血測定抗體的效價(jià)。其中，耳靜脈取血進(jìn)行效價(jià)檢測(ELISA法)的步驟如下在96孔板上，每孔加入50μβ/πι1磷酸酪氨酸ΙΟΟμ 1，4°C過夜后，進(jìn)行包被，洗滌。 將按照前述方法制備的耳靜脈血的多抗血清稀釋為1 100，1 500,1 2500,1 3200， 1 12800，1 25600，每孔各加100μ 1，37°C保溫30min，洗滌。各加入1 100稀釋的羊抗 兔I 8酶結(jié)合物10(^1，371保溫301^11，洗滌。加入11^(3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺)10(^1， 20min后，加2mol/l的H2SO4終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀測定A490nm值，高于免疫前血清10倍 的為陽性。經(jīng)過2次加強(qiáng)免疫后，效價(jià)檢測的結(jié)果如下多抗血清1 (抗原表位I-KLH復(fù)合物免疫)> 51200 (抗原表位1_KLH復(fù)合物有免 疫原性的最大稀釋倍數(shù)是51200)；裸肽免疫(抗原表位1，SEQ ID NO 6)得到的多抗血清> 12800 (僅僅由抗原表位1組成的裸肽具有免疫原性的最大稀釋倍數(shù)是12800)。上述結(jié)果已經(jīng)符合要求，遂于末次加強(qiáng)免疫7天后頸動(dòng)脈放血，收集血樣。將收集 的血樣在3-4°C下靜置3-4小時(shí)，然后5000rpm離心10分鐘，收集血清，得到多抗血清1 (耳 靜脈檢測效價(jià)符合要求后，頸動(dòng)脈取的血樣不必再檢測效價(jià))。無菌分裝保存于-80°C備用。實(shí)施例5 抗木瓜蛋白酶多克隆抗體1 (多抗1)的制備將實(shí)施例4中制備的多抗血清1進(jìn)行純化，制得多克隆抗體1 (多抗1)。將抗原表位￡HGVTPFSDLTREE(SEQ ID NO 6)多肽與溴化氰活化的S印harose 4B 偶聯(lián)，制備多肽親和層析柱。將制備的多抗血清1加入到以上制備的層析柱中，放置于4°C孵育過夜后，洗脫抗 體，即得到抗木瓜蛋白酶多克隆抗體(多抗1)。實(shí)施例6 多抗1對木瓜蛋白酶的特異性檢驗(yàn)選取新鮮的水稻93-11 (獲自國家雜交水稻工程技術(shù)中心)苗期地上部、分蘗期葉 片、孕穗期劍葉、開花期劍葉、成熟期劍葉、苗期地下部、分蘗期莖、開花期穗子、成熟期種子 (共9個(gè)部位)，分別提取總蛋白質(zhì)。總蛋白質(zhì)樣品的制備用液氮研磨上述新鮮水稻組織至粉末狀，分裝到預(yù)冷離心 管中，每300μ 1粉末加入800μ 1蛋白質(zhì)裂解液(62. 5mmol/L ρΗ7· 4 Tris .HCl，10%甘油， 2% SDS,20mmol/LNaF,2mmol/L EDTA，lmmol/L PMSF,5% β -巰基乙醇)，迅速混勻并置于 冰上，冰水混合物中孵育10分鐘，約每2分鐘震蕩混勻1次。4°C，12000r/mi η離心15分 鐘。取上清，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，-70°C保存。得到水稻總蛋白。Western 印記將提取的上述水稻蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE (12 % )，檢測時(shí)，Marker (Transgen Biotech，貨號DM 201)和上述9個(gè)部位的水稻總蛋白的上樣量從左至右依次為為10μ 1、 7μ 1、8μ 1、7μ 1、6μ 1、6μ 1、6μ 1、10μ 1、3μ 1、5μ 1(圖 1)。SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5 %的脫脂奶粉封閉PVDF膜。使用實(shí)施例5 中制備的多抗1，以1 1000稀釋后室溫孵育3小時(shí)，TTBS(2mmol/L Tris · HCl pH7. 6， 13. 6mmol/L NaCl，0. 1% Tween-20)洗膜3次，每次5分鐘。之后加入以1 15000稀釋的 兔源多抗(廠家貨號中杉ZB2301)，室溫孵育1小時(shí)，TTBS洗膜3次，每次5分鐘。加ECL Pluc顯色劑顯色，暗室曝光5分鐘。結(jié)果如圖1所示，抗體有特異性，即只有1-2條明顯的 主帶，分子量接近預(yù)期。需要說明的是，盡管水稻全蛋白中可能有很多分子量與其相似的蛋白，但是與多 抗1特異性結(jié)合的就只有木瓜蛋白酶一個(gè)。關(guān)于特異性的預(yù)測SEQ ID N0:6經(jīng)過http;// rice, ρlantbiology· msu. edu/blast. shtml (與實(shí)施例 1 中的 http；//rapdb. dna. affrc. go. jp/作用相同，目的是再次檢驗(yàn)唯一性)的檢查，確定此多肽序列特異，該序列在水稻總 蛋白中唯一確定木瓜蛋白酶。此外，為了進(jìn)一步證明檢測到的的確是木瓜蛋白酶，將上述9個(gè)表位分別提取的 總蛋白進(jìn)行第二次SDS-PAGE電泳，得到SDS膠，然后在上面選取與western blot上的目標(biāo) 條帶對應(yīng)的條帶，用Trypsin酶消化后打質(zhì)譜，通過對一級質(zhì)譜圖(圖2)和二級質(zhì)譜圖(圖 3)的聯(lián)合搜索，可以推測是木瓜蛋白酶。。
盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根 據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
一種木瓜蛋白酶抗原表位，其由SEQ ID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所示的氨基酸序列組成。
2.一種組合物，其中含有權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶抗原表位，任選地，還含有用于 免疫的佐劑。
3.—種木瓜蛋白酶抗原表位-載體復(fù)合物，其中，所述木瓜蛋白酶抗原表位為權(quán)利要 求1所述的木瓜蛋白酶抗原表位，所述載體選自鑰孔戚血藍(lán)素、BSA、以及酪蛋白。
4.一種抗木瓜蛋白酶抗體的制備方法，包括使用權(quán)利要求1的木瓜蛋白酶抗原表位或 者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3的復(fù)合物的步驟；任選地，所述抗木瓜蛋白酶抗體是 單克隆抗體或者多克隆抗體；具體地，所述制備方法包括如下步驟1)將權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或者權(quán)利要求3 的復(fù)合物免疫動(dòng)物得到的血樣進(jìn)行離心，得到多抗血清；和2)純化步驟1)中的多抗血清，得到抗木瓜蛋白酶多克隆抗體。
5.一種多抗血清，其由權(quán)利要求1的木瓜蛋白酶抗原表位或者權(quán)利要求2的組合物或 者權(quán)利要求3的復(fù)合物免疫動(dòng)物制得。
6.一種抗木瓜蛋白酶抗體，其能夠特異地結(jié)合權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶抗原表 位，任選地，其為多克隆抗體或者單克隆抗體。
7.一種組合物，其包含權(quán)利要求6所述的抗木瓜蛋白酶抗體。
8.—種木瓜蛋白酶檢測劑，其包含權(quán)利要求6所述的抗木瓜蛋白酶抗體。
9.權(quán)利要求6所述的抗體在制備檢測木瓜蛋白酶的藥物中的用途。
10.一種檢測木瓜蛋白酶的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求6所述的抗木瓜蛋白酶 多克隆抗體的步驟；具體地，所述木瓜蛋白酶為水稻的木瓜蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及木瓜蛋白酶抗原表位、抗木瓜蛋白酶抗體及其用途。具體地，所述木瓜蛋白酶抗原表位具有SEQ ID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所示的序列。本發(fā)明還涉及一種抗木瓜蛋白酶多克隆抗體，所述多克隆抗體與上述抗原表位特異性結(jié)合。所述多克隆抗體具有高的特異性和效價(jià)。本發(fā)明還涉及所述多克隆抗體的制備方法和用途、含有該多克隆抗體的組合物、以及檢測木瓜蛋白酶的方法。
文檔編號C07K14/795GK101948511SQ201010279578
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者侯明明, 林梁, 王憲云, 白輝, 陳創(chuàng)彬 申請人:深圳華大基因科技有限公司