專利名稱：貽貝酶解多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種貽貝酶解多肽，本發(fā)明還涉及該貽貝酶解多肽的制備方法及其在抗前列腺癌上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多肽在生物體內(nèi)可作為神經(jīng)遞質(zhì)、白細(xì)胞介素和細(xì)胞生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)，具有維持生物體生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝等活性功能?，F(xiàn)有研究表明，來(lái)源于生物體的多肽具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗高血壓等活性功能，尤其是抗腫瘤活性已受到各國(guó)研究人員的關(guān)注。目前，有關(guān)天然肽和合成肽的抗腫瘤活性已有大量報(bào)道，并有部分多肽作為抗腫瘤藥物已應(yīng)用于臨床；食物蛋白來(lái)源的多肽對(duì)于其抗菌、抗氧化、抗高血壓活性研究頗多，而對(duì)其抗腫瘤活性的相關(guān)報(bào)道較少。海洋生物蛋白種類繁多，來(lái)源廣泛，作為活性肽的一個(gè)重要來(lái)源，已受到越來(lái)越多的關(guān)注。貽貝作為海洋生物的一個(gè)重要組成部分，隸屬于海洋軟體動(dòng)物門(Mollusca)雙殼綱(Bivalvia)貽貝目(Mytiloida)，在我國(guó)北方稱海紅，江浙稱為淡菜，富產(chǎn)于浙江嵊泗周圍海域。貽貝富含粗蛋白、脂肪和碳水化合物，此外還含有鈣、磷、鐵、維生素等多種微量元素。已有研究表明，貽貝提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝、降血壓、降血脂、提高免疫力等活性功能，可參考專利號(hào)為ZL200510110096.8的中國(guó)發(fā)明專利《厚殼貽貝的提取物、制造方法及其用途》(授權(quán)公告號(hào)CN100467030C)，該專利公開(kāi)了厚殼貽貝的提取物在流感上的應(yīng)用。類似的還可以參考專利號(hào)為ZL200510024391. 1的中國(guó)發(fā)明專利《一種可提高免疫力功能的厚殼貽貝提取物》(授權(quán)公告號(hào)為CN100486593C)；申請(qǐng)?zhí)枮?00910101136. O的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)《厚殼貽貝脂溶性提取物及其制備方法和用途》(公開(kāi)號(hào)CN101606951A)。 但至今未見(jiàn)有關(guān)貽貝酶解產(chǎn)物對(duì)前列腺癌細(xì)胞作用的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種貽貝酶解多肽。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種貽貝酶解多肽的制備方法。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種貽貝酶解多肽的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種貽貝酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Leu Tyr。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種貽貝酶解多肽，其特征在于采用如下步驟制備①取貽貝肉，制成均漿，調(diào)節(jié)PH值9. 5 10，料液比為1 2 1 3，添加堿性蛋白酶，加酶量為1500 2000U/g，酶解時(shí)間為6 8小時(shí)，酶解溫度為45 50°C，滅酶后離心，取上層清液；②將上述的清液經(jīng)過(guò)超過(guò)濾，收集分子量I以下的水解液，濃縮并冷凍干燥；
③DEAE-kpharoseFF離子柱交換柱色譜分離，將步驟②中的冷凍干燥后產(chǎn)物通過(guò)DEAE-kpharoseFF離子柱交換柱，0. 1 Imol/LNaCL梯度洗脫，洗脫速度1 1. 5mL/ min,蛋白檢測(cè)儀280nm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥，將干燥后得到的各個(gè)峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對(duì)該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥；④采用kphadex G_25凝膠柱色譜分離，將步驟③所得的具有最高抗腫瘤活性的冷凍干燥后產(chǎn)物過(guò)kphadex G-25凝膠柱，流動(dòng)相為蒸餾水，流速為1. 5 2mL/min，蛋白檢測(cè)儀^Onm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥并用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)；⑤高效液相色譜純化，將步驟④中得到的具有最高抗腫瘤活性冷凍干燥后產(chǎn)后過(guò)反相高效液相柱，色譜柱為hrbax SB C18(250mmX9. 4mm, 5 μ m)；柱溫為室溫；流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫0 20min，乙腈濃從0%變化到95%，洗脫速度2. 5 3. OmL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌上的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用；所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用最佳的蛋白酶和優(yōu)選的工藝對(duì)貽貝進(jìn)行酶解純化，將所得的目標(biāo)肽應(yīng)用于抗前列腺癌細(xì)胞上產(chǎn)生了很強(qiáng)的細(xì)胞抑制增殖作用， 為抗前列腺癌提供了一條可行性研究途徑；整體工藝簡(jiǎn)單，投入較少，易于推廣應(yīng)用。


圖1為各種蛋白酶的酶解物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率的柱狀圖。圖2為堿性蛋白酶不同分子量酶解物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率的柱狀圖。圖3為堿性蛋白酶分子量I以下組分的DEAE Sepharose FF層析圖譜。圖4為圖3中峰2的kphadex G-25凝膠層析圖譜。
圖5為圖4中峰2-2的RT-HPLC圖譜。圖6為圖5中目標(biāo)肽的RT-HPLC圖譜。圖7為正常DU-145細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖8為貽貝多肽作用24h后DU-145細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖9為貽貝多肽作用4 后DU-145細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖10為正常PC-3細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖11為貽貝多肽作用24h后PC-3細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。圖12為貽貝多肽作用4 后PC-3細(xì)胞形態(tài)HE染色后顯微照片。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。1 材料1. 1動(dòng)物貽貝(Mytilus edulis)購(gòu)自舟山市場(chǎng)(經(jīng)浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定)，去殼后，-20°C冷藏備用。
1. 2細(xì)胞株人前列腺癌細(xì)胞DU-145和PC-3均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。1.3主要試劑胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、萄聚糖凝膠 SephadexG-25和DEAE SepharoseFF陰離子交換柱均購(gòu)自于北京亞太恒信生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；F12粉末培養(yǎng)基和MTT均購(gòu)自美國(guó)SIGMA 公司；二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)AMRESC0公司；乙腈購(gòu)自寧波海曙恒隆實(shí)驗(yàn)器材有限公司；其余試劑均為分析純。1. 4主要儀器BSA124S型電子天平(德國(guó)，Sartorius AG公司)；DS-1型高速組織搗碎機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；CF16RXII高速冷凍離心機(jī)(日立HITACHI公司)；自動(dòng)部分收集器(BSZ-40-LCD)、蛋白檢測(cè)儀(HD-21-88)(上海琪特分析儀器有限公司)；SSW型微電腦電熱恒溫槽(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；依利特P1201型高效液相色譜儀 (大連依利特分析儀器有限公司)；MSC300超濾杯(超濾膜3KDa和5KDa)(上海摩速科學(xué)器材有限公司)。ZHJH-C1209C型超凈工作臺(tái)(上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)forma 3111型(X)2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。2 方法2. 1酶解工藝流程選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶4種蛋白酶分別對(duì)貽貝肉進(jìn)行酶解，各種蛋白酶的酶解條件見(jiàn)表1，酶解過(guò)程依次如下貽貝洗凈；去殼取肉；勻漿；0. 5mol/LNa0H和0. lmol/LHCl溶液調(diào)PH值；加酶水解；滅酶(90°C，加熱15min)；離心(5000r/min，20min)；取上清液；冷凍干燥；MTT法抗腫瘤活性初步測(cè)定。表1幾種蛋白酶的酶解條件
酵種類料液比(W/V)PH溫度(°C)加酶量(U/g)酶解時(shí)間(h)
Trypsin1:295020008Alcalase1:2105015008 Papain1:36.55520008
Pepsin_L3_4^_45_2000_8_2. 2細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌DU-145和PC-3細(xì)胞(原購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存)，用含10%小牛血清的F12完全培養(yǎng)基于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2. 3細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。配制PBS溶液(pH值為7. 2) 和一定濃度的酶解多肽溶液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200 μ L，于5% CO2, 37°C貼壁4h，然后分別加入酶解多肽溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)不加藥對(duì)照組，置5% CO2, 37°C培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)結(jié)束加入180 μ LMTT和20 μ L PBS 繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄96孔板的液體，加入150 μ L的DMS0，充分混合。置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在 490nm測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)(IR)，按下列公式計(jì)算。IR=[(對(duì)照組A值-藥物組A值)/對(duì)照組A值]X 100 %2. 4抗腫瘤活性肽的初步分離取蛋白酶水解貽貝肉得到的上清液，分別用截留分子量為IOKjK和;3K的超濾膜進(jìn)行超濾，得到分子量為IOK以上、5K-10KJK-5K和I以下的水解液。冷凍干燥后采用MTT法分別測(cè)定各組分對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制率，初步確定具有較強(qiáng)抗腫瘤活性多肽的分子量范圍。對(duì)該分子量范圍的水解液經(jīng)超濾進(jìn)行大量收集，濃縮并冷凍干燥，作進(jìn)一步的分離純化。2. 5 DEAE-SepharoseFF離子交換柱色譜分離將上述步驟得到的活性最強(qiáng)部分過(guò) DEAE-S印haroseFF 離子交換柱，分別用 PBS (PH 為 7. 4)、0. lmol/LNaCL、0. 3mol/LNaCL、 0. 5mol/LNaCL和Imol/LNaCL溶液進(jìn)行階段洗脫，洗脫速度為lml/min，蛋白檢測(cè)儀280nm 進(jìn)行檢測(cè)，分別收集各洗脫峰，并冷凍干燥。將干燥后得到的各個(gè)峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對(duì)該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥，作為進(jìn)一步純化所用樣品。2.6 Sephadex G_25凝膠柱色譜分離由上述步驟得到的活性最強(qiáng)組分過(guò) Sephadex G-25凝膠柱(80cmX 2. 6cm)，流動(dòng)相為蒸餾水，流速為2mL/min，蛋白檢測(cè)儀 280nm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥。將干燥后得到的各個(gè)峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對(duì)該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥，作為高效液相所用樣品。2. 7高效液相色譜(HPLC)純化及純度檢測(cè)純化色譜條件色譜柱為hrbax SB C18(250mmX9. 4mm, 5 μ m)；柱溫為室溫；流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫0 20min，乙腈濃度同0%變化到95% ；洗脫速度3. OmL/m in ；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。純度檢測(cè)色譜條件色譜柱為Hypersil BDS C18(250mmX4. 6mm, 5 μ m)；柱溫為室溫；梯度洗脫0 20min，乙腈濃度由0%變化到95% ；洗脫速度0. 8mL/m in ；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。2. 8目標(biāo)肽的氨基酸序列檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)得到該貽貝酶解多肽，包含如下氨基酸序列:Asp Leu Tyr02. 9細(xì)胞形態(tài)觀察采用HE染色方法。將DU-145和PC_3細(xì)胞接種在帶有蓋玻片的六孔板上，細(xì)胞爬片24h后，加入20mg/ml的目標(biāo)肽，分別培養(yǎng)24h和4 后，將蓋玻片取出，95%酒精固定15min。PBS洗2次，蘇木素進(jìn)行染色，自來(lái)水充分水洗，伊紅復(fù)染，自來(lái)水浸洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。3 結(jié)果3.1蛋白酶種類的確定4種蛋白酶對(duì)貽貝肉酶解所得到的酶解物對(duì)DU-145細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用，其中堿性蛋白酶酶解物對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制活性最強(qiáng)，濃度為20mg/ml，作用4 后，抑制率為觀.4% (見(jiàn)圖1)。堿性蛋白酶水解液經(jīng)超濾膜超濾后得到的4個(gè)組分在濃度為20mg/ml，作用4 后，3K以下組分對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率最大，為30. 3% (見(jiàn)圖 2)。3. 2抗PCa活性肽的分離3K以下組分經(jīng)DEAE-kpharose FF離子交換柱洗脫后，共得到4個(gè)峰組分(見(jiàn)圖3)，其中峰2抗腫瘤活性最強(qiáng)，當(dāng)濃度為20mg/ml，對(duì)DU-145細(xì)胞作用4 后，抑制率為 41.2%。峰2經(jīng)kphadex G_25凝膠柱洗脫后得到3個(gè)峰組分(見(jiàn)圖4)，其中峰2_2的抗腫瘤活性最強(qiáng)，在濃度為20mg/ml，對(duì)DU-145細(xì)胞作用4 后，抑制率為46. 5% 3. 3抗PCa 活性肽的純化及純度測(cè)定峰2-2經(jīng)化計(jì)狀SB Cw純化后，最終得到1個(gè)多肽，即為本實(shí)驗(yàn)所純化的目標(biāo)肽，見(jiàn)圖5。將該肽過(guò)Hypersil BDS C18色譜柱檢測(cè)其純度，在保留時(shí)間約為15min時(shí)出現(xiàn)單一峰，見(jiàn)圖6，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所得到的目標(biāo)肽純度較高，為單一組分。3. 4目標(biāo)肽對(duì)DU-145和PC-3細(xì)胞增殖抑制作用將目標(biāo)肽設(shè)置5mg/ml、10mg/ml、 15mg/ml、20mg/ml和25mg/ml五個(gè)濃度組，分別測(cè)定作用24h、48h和72h后，對(duì)DU-145和 PC-3細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，目標(biāo)肽對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制活性比PC-3細(xì)胞強(qiáng)，對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制活性均呈現(xiàn)時(shí)效和量效關(guān)系(表2)。表2貽貝酶解多肽對(duì)人前列腺癌DU-145和PC-3細(xì)胞增殖的影響(χ士s，η = 3)
權(quán)利要求
1.一種貽貝酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Leu Tyr0
2.一種如權(quán)利要求1所述貽貝酶解多肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟①取貽貝肉，制成均漿，調(diào)節(jié)PH值9.5 10，料液比為1 2 1 3，添加堿性蛋白酶，加酶量為1500 2000U/g，酶解時(shí)間為6 8小時(shí)，酶解溫度為45 50°C，滅酶后離心， 取上層清液；②將上述的清液經(jīng)過(guò)超濾，收集分子量3K以下的水解液，濃縮并冷凍干燥；③DEAE-kpharoseFF離子柱交換柱色譜分離，將步驟②中的冷凍干燥后產(chǎn)物通過(guò) DEAE-SepharoseFF離子柱交換柱，0. 1 Imol/LNaCL梯度洗脫，洗脫速度1 1. 5mL/min, 蛋白檢測(cè)儀280nm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥，將干燥后得到的各個(gè)峰組分采用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對(duì)該峰大量收集，濃縮并冷凍干燥；④采用kphadexG-25凝膠柱色譜分離，將步驟③所得的具有最高抗腫瘤活性的冷凍干燥后產(chǎn)物過(guò)kphadex G_25凝膠柱，流動(dòng)相為蒸餾水，流速為1. 5 2mL/min，蛋白檢測(cè)儀 280nm進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各洗脫峰分別進(jìn)行收集，濃縮后冷凍干燥并用MTT法進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)；⑤高效液相色譜純化，將步驟④中得到的具有最高抗腫瘤活性冷凍干燥后產(chǎn)后過(guò)反相高效液相柱，色譜柱為hrbax SB C18 (250mmX 9. 4mm, 5 μ m)；柱溫為室溫；流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫0 20min，乙腈濃從0%變化到95%，洗脫速度2. 5 3. OmL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。
3.權(quán)利要求2或3所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌上的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2或3所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2或3所述的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用。
全文摘要
一種貽貝酶解多肽，其特作在于包含如下氨基酸序列Asp Leu Tyr。采用如下步驟制備①取貽貝肉，制成均漿，添加堿性蛋白酶，滅酶后離心，取上層清液；②將上述的清液經(jīng)過(guò)超過(guò)濾，收集分子量3K以下的水解液，濃縮并冷凍干燥；③DEAE-SepharoseFF離子柱交換柱色譜分離；④采用Sephadex G-25凝膠柱色譜分離；⑤高效液相色譜純化。本發(fā)明還公開(kāi)了通過(guò)上述步驟制備所得的貽貝酶解多肽在抗前列腺癌上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用最佳的蛋白酶和優(yōu)選的工藝對(duì)貽貝進(jìn)行酶解純化，將所得的目標(biāo)肽應(yīng)用于抗前列腺癌細(xì)胞上產(chǎn)生了很強(qiáng)的細(xì)胞抑制增殖作用，為抗前列腺癌提供了一條可行性研究途徑。
文檔編號(hào)C07K2/00GK102558296SQ20101061094
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者丁國(guó)芳, 莊黛娜, 徐銀峰, 李 榮, 楊最素, 楊永芳, 許丹, 郁迪, 鄭玉寅, 閆海強(qiáng), 黃芳芳 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院