專利名稱：水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因OsABCG15、重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因
還涉及水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因0sABCG15的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻(iferza是主要糧食作物之一，全世界約有一半人口以稻米為主食。 在我國(guó)，水稻播種面積為全國(guó)糧食作物播種面積的30%，而總產(chǎn)量卻占糧食作物產(chǎn)量的42% 以上，其重要原因就是水稻雜種優(yōu)勢(shì)的成功應(yīng)用。Jones早在1926年就發(fā)現(xiàn)了水稻雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象。但水稻為自交結(jié)實(shí)作物，難以獲得大量的、純度高的雜交種，阻礙了水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用的進(jìn)程，直到1970年我國(guó)李必湖發(fā)現(xiàn)野敗不育株。1973年“雜交水稻之父”袁隆平的研究團(tuán)隊(duì)，經(jīng)過(guò)刻苦專研，實(shí)現(xiàn)了三系配套，并于1976年開始大面積推廣雜交水稻，使水稻雜種優(yōu)勢(shì)成為現(xiàn)實(shí)。直到現(xiàn)在，不育系仍是水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑。目前，人們主要通過(guò)質(zhì)核互作不育系(三系法)和溫光敏不育系(兩系法)來(lái)實(shí)現(xiàn)水稻的雜種優(yōu)勢(shì)。然而，由于質(zhì)核互作不育系配組不自由，可利用的親本有限，種子生產(chǎn)比兩系法復(fù)雜，溫光敏不育系的育性受自然溫光條件影響，大面積制種風(fēng)險(xiǎn)大等原因，使得水稻的雜種優(yōu)勢(shì)無(wú)法通過(guò)這兩種不育系得到充分體現(xiàn)。正?？捎镜幕ㄋ幒突ǚ弁獗诰哂刑囟y飾，主要由脂類等物質(zhì)形成，在抵御生物和非生物逆境，提高授粉效率，花粉與柱頭的相互識(shí)別和信號(hào)交流，生殖隔離等方面有重要作用。普通核雄性不育具有如下特點(diǎn)由一對(duì)隱性基因控制，任何品系都能夠轉(zhuǎn)育成不育系，任何品系都能夠作為其恢復(fù)系，敗育徹底，不受環(huán)境影響等。這些特點(diǎn)有利于充分發(fā)揮水稻雜種優(yōu)勢(shì)。因此，大力發(fā)掘普通核不育基因和研究其調(diào)控機(jī)理，對(duì)于進(jìn)一步提供水稻廣量和品質(zhì)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因
具有轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)以形成花藥、花粉壁特定紋飾的功能，是小孢子發(fā)育成可育花粉的必須基因，該基因功能缺失會(huì)導(dǎo)致雄性不育，產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有重要作用，技術(shù)方案為
所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因編碼如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列，或者SEQ ID NO. I所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸且具有與水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積蛋白0sABCG15功能相同的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步，所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因OsABCGI5的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。本發(fā)明的目的之二在于提供水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因0sABCG15的重組表達(dá)載體，其技術(shù)方案為
含有所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因OsABCG15的重組表達(dá)載體。進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體是在pCAMBIA1301載體多克隆酶切位點(diǎn)處連入SEQ ID NO. 31所示核苷酸序列。本發(fā)明的目的之三在于提供水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因0sABCG15的應(yīng)用，技術(shù)方案為
所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因OsABCG15在水稻育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明公開了水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因
該基因主要通過(guò)影響水稻花粉發(fā)育中的脂類運(yùn)輸，對(duì)花粉及其外壁發(fā)育、育性方面具有重要作用，基因突變、基因敲除或抑制表達(dá)等使其喪失功能后，導(dǎo)致花藥和花粉壁的紋飾形成和脂類沉積無(wú)法進(jìn)行，從而導(dǎo)致小孢子降解，獲得新的水稻雄性不育系， 可以用來(lái)生產(chǎn)雜交種子，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用；本發(fā)明還公開了 0sABCG15基因的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體能夠?qū)⑺拘坌圆挥祷謴?fù)為可育系，具有廣泛的應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖I為本發(fā)明突變體和正常的近等基因系II-32B花藥和花粉形態(tài)學(xué)觀察圖 ((Sp表示染色花粉，Ac表示花藥殘?jiān)?)。圖2為本發(fā)明0sABCG15座位定位和突變位點(diǎn)示意圖。圖3為本發(fā)明OsABCGI5互補(bǔ)植株的花藥形態(tài)和花粉碘染圖。圖4為本發(fā)明osabcgl5突變體和近等基因系II-32B花藥組織切片和掃描電鏡圖(圖A、B、C和D花藥組織切片圖，A和B為野生型，C和D為突變體；E、F、G和 H為掃描電鏡圖，E和F為花藥電鏡掃描圖，E為野生型，F(xiàn)為osabcgl5突變體，G和H為絨絨氈層電鏡掃描圖；G為野生型，H為突變體；DC: 二分體，T:絨氈層，C:花藥空腔)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。術(shù)語(yǔ)“花藥表皮和花粉壁脂類沉積的基因”指編碼具有運(yùn)輸脂類到花藥表皮和花粉壁的ABC-2型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸序列，堿基序列如SEQ ID NO. 2中第1-2067位所示的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO. 2序列的編碼框第1-2067位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO. 2中第1-2067位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. I所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO. 2中從核苷酸第I 一 2067位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 2中從核苷酸第I 一 2067位的核苷酸序列的同源性至少 70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的調(diào)控花藥和花粉壁脂類積累的相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 2中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地 1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/ 或3 ’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5 個(gè)以內(nèi))核苷酸。術(shù)語(yǔ)“花藥表皮和花粉壁脂類沉積的蛋白”指具有運(yùn)輸脂類到花藥表皮和花粉壁的ABC-2型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的、具有SEQ ID NO. I序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然影響花藥表皮和花粉壁脂類沉積的ABC-2型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SEQ ID NO. I序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能；在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。實(shí)施例中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本實(shí)施例的水稻花藥表皮和花粉壁脂類轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)多肽時(shí)，可以將該蛋白的編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成調(diào)控水稻花藥表皮和花粉壁脂類轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)載體。相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本實(shí)施例所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分尚得到有關(guān)序列。除了用重組法產(chǎn)生之外，實(shí)施例中蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行?？梢苑謩e化學(xué)合成本實(shí)施例蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。實(shí)施例I、osabcgl5突變體植株的獲得和形態(tài)學(xué)的觀察
秈稻縉恢I號(hào)突變體，命名為osabcgl5突變由本實(shí)驗(yàn)室保存，用II-32B作輪回親本，與突變體雜交和隔代回交，最終將突變體保存下來(lái)，該不育材料同II-32B為一對(duì)近等基因系。突變體與II-32B雜交，F(xiàn)l代全部為可育，自交F2代中出現(xiàn)分離，其中正常植株為567，突變株為187，比例符合3:l(x 2 = O. 0071<x0. 05 = 3. 84)，表明該雄性不育突變體表型由一個(gè)單核基因突變?cè)斐?。?duì)osabcgl5突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察II-32B稻穗結(jié)實(shí)后下垂(圖IA左)，而突變體小穗不結(jié)實(shí)呈直立狀(圖IA 右)；II-32B花藥包含成熟花粉呈現(xiàn)為黃色(圖IB上)，osabcgl5突變體花藥為白色(圖 IB下)；II-32B花粉碘染為黑色(圖IC上)，osabcgl5突變花藥中無(wú)花粉，在碘液中搗碎后只有花藥殘?jiān)?圖IC下)。實(shí)施例2、OsABCG15基因的定位和克隆一、定位群體
將OSabcgl5突變體與粳稻日本晴雜交，自交獲得F2代，選擇雄性不育植株為定位群體。二、提取水稻DNA
親本采用改進(jìn)的CTAB法進(jìn)行提取，包括如下步驟取葉片O. 1-0. 2克(約半片)放到小研缽中，加入適量的液氮，立刻研磨至粉狀，裝入2ml離心管，加入700 μ L 100°C預(yù)熱的 I. 5 X CTAB溶液于離心管中，小心混勻后放入65°C水浴，20分鐘后取出離心管，加入等體積氯仿/異戊醇，猛烈混勻，13000rpm離心10分鐘，取上清于新管中，加入900 μ L無(wú)水乙醇混勻后-20°C放半小時(shí)以上。將析出的DNA離心，HOOOrpm離心10分鐘。去掉上清，將沉淀用 ImL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇清洗一次，離心干燥，溶于200 μ L TE溶液中，4°C冰箱保存。定位群體的單株DNA采用改進(jìn)的堿煮法提取，包括如下步驟剪碎嫩葉片l_2cm2放入O. 5ml離心管，加入100 μ L濃度為O. 125Μ的NaOH溶液，沸水浴30秒，然后加入50 μ L濃度為I. OM 的Tris-HCl (ρΗ8· 0)，最后加入100 μ L濃度為O. 125Μ的HC1，沸水浴2分鐘后4°C冰箱保存?zhèn)溆?。三、群體分離分析初定位
設(shè)計(jì)137對(duì)多態(tài)性標(biāo)記，其中包括42對(duì)SSR引物和95對(duì)InDel分子標(biāo)記引物。其中SSR引物根據(jù)已發(fā)表的序列合成(具體參見http://www. gramene. org. microsat/ssr. html)，其他InDel分子標(biāo)記設(shè)計(jì)是根據(jù)比較粳稻日本晴和秈稻9311兩品系的已公布的核酸序列，對(duì)差異的部分設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證2個(gè)親本粳稻日本晴和秈稻osabcgl5突變體之間的多態(tài)性。將設(shè)計(jì)的137對(duì)引物分別擴(kuò)增水稻雄性不育植株和水稻親本基因組DNA，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0 μ L體系中，I μ L模板,IyL IOpmol/μ L上游引物,I μ LlOpmol/μ L下游引物，
Iμ L IOXBuffer (Mg2 + ), I μ L 2mM dNTP，0. I μ L Taq，3· 9 μ L 水；PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的PAGE膠電泳，銀染方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，137對(duì)標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，Chr6Ind (-37-1)引物(如表I所示)對(duì)親本與F2代選擇雄性不育植株存在差異，表明6號(hào)染色體上的標(biāo)記Chr6Ind (-37-1)與基因座位有明顯的連鎖關(guān)系。四、精細(xì)定位
用不育單株對(duì)6號(hào)染色體上的標(biāo)記Chr6Ind(-37-l)附近有差異SSR標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)RM3628引物對(duì)(如表I所示)和RM5371引物對(duì)(如表I所示)分別有6個(gè)和38個(gè)的重組子而且重組子不相互包含，這說(shuō)明基因座位應(yīng)位于RM3628和RM5371兩個(gè)分子標(biāo)記之間。為了對(duì)基因進(jìn)一步精細(xì)定位，將用于定位的突變株擴(kuò)大到近2157株，又在RM3628和RM5371間設(shè)計(jì)了 20對(duì)SSR引物，6對(duì)InDel引物和23對(duì)STS引物，20對(duì)SSR 引物中RM20356、RM20361、RM20366、RM275和RM275引物對(duì)存在差異，6對(duì)InDel引物中 Chr6Ind(-30)、Chr6Ind(_7)和 Chr6Ind(4)引物對(duì)存在差異，23 對(duì) STS 引物中 Chr6STS20、 Chr6STS13和Chr6STS15引物對(duì)存在差異。用有差異的引物對(duì)定位群體進(jìn)行分析，最終將 OsABCG15基因定位在Chr6Ind (-30 )和Chr6STS13之間，如圖2A所示。經(jīng)分析表明，該區(qū)域只包含I個(gè)編碼基因，該基因編碼ABC-2型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，編碼該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，與擬南芥雄性不育基因勝β 7同源，通過(guò)對(duì)該基因的兩次測(cè)序，發(fā)現(xiàn)突變體在該基因的第4個(gè)外顯子處發(fā)生一個(gè)堿基的替換 (A變?yōu)镃),如圖2B所示?；蚨ㄎ凰脴?biāo)記的序列如表I所示。表I基因定位分子標(biāo)記及其引物序列
權(quán)利要求
1.水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因其特征在于所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因編碼如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列，或者SEQ ID NO. I所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸且具有與水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積蛋白0sABCG15功能相同的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因其特征在于 所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因0sABCG15的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.含有權(quán)利要求I或2所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因0sABCG15的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因0sABCG15的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是在PCAMBIA1301載體多克隆酶切位點(diǎn)處連入SEQ ID NO. 31所示核苷酸序列。
5.權(quán)利要求I或2所述水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因在水稻育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積基因OsABCG15，該基因編碼如SEQIDNO.1所示氨基酸序列，或者SEQIDNO.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸且具有與水稻花藥表皮和花粉壁脂類沉積蛋白OsABCG15功能相同的蛋白質(zhì)，還公開了OsABCG15基因的重組表達(dá)載體，本發(fā)明公開的OsABCG15基因編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)以形成花藥、花粉壁特定紋飾的功能，是小孢子發(fā)育成可育花粉的必須基因，該基因功能的缺失會(huì)導(dǎo)致花藥和花粉外壁的保護(hù)層不能形成，產(chǎn)生水稻雄性不育。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102586278SQ20121006342
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者呂俊, 張毅, 楊昆, 武麗娜, 王忠偉, 管玉圣, 趙勇, 黃遠(yuǎn)新 申請(qǐng)人:西南大學(xué)