專利名稱：一種干擾素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種干擾素的純化方法。本發(fā)明在純化工藝中采用了反相填料的精細(xì)分離純化步驟。同現(xiàn)有技術(shù)相比較，可以大幅度的提高干擾素的純度、比活、穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，主要是通過(guò)細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們?cè)谕?種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。干擾素根據(jù)抗原特異性和分鐘結(jié)構(gòu)的不同，分為α、β、Y等型別，而在一特定的干擾素型別內(nèi)，再根據(jù)氨基酸序列或組成方面的差異，劃分出不同的亞型，比如=HuIFN (人干擾素)α1、α2等。而在一特定的干擾素亞型內(nèi)，根據(jù)個(gè)別氨基酸的變異，以a、b、c在亞型后面進(jìn)彳丁標(biāo)記，比如HuIFNa -la, a -2a, α -2b等。HuIFNa已經(jīng)可以通過(guò)基因重組生物工程技術(shù)進(jìn)行量產(chǎn)。但其純化工藝經(jīng)過(guò)多年研究始終難以解決其純度問(wèn)題，比活下降明顯，如現(xiàn)有技術(shù)“重組人干擾素_26的提取和純化”微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展2004年第32卷第I期采用離子交換層析柱DEAEsepharose (FF)A 柱，柱形)(K30/50，以及 sephacryll00/50)(K 層析柱，S-100 填料，經(jīng)過(guò)兩次層析得到，經(jīng)過(guò)測(cè)定，其比活1. 2X108IU/mg，蛋白純度為95%。重組人a2b型干擾素的純化與鑒定《生物工程學(xué)報(bào)》1994年第I期5頁(yè)61-65頁(yè)采用單克隆抗體親和層析一步純化法對(duì)大腸桿菌表達(dá)的重組人a2b型干擾素進(jìn)行了純化，然后利用凝膠過(guò)濾高壓液相層析、SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳和N端2 5個(gè)氨基酸的序列測(cè)定等方法對(duì)純化產(chǎn)品進(jìn)行了鑒定。表明一步純化的重組人a2b達(dá)到95%，其比活性為2. 54X 10 8 IU / mg。本發(fā)明經(jīng)過(guò)對(duì)不同純化工藝的研究，篩選出一種純化方法，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是在純化工藝中采用了陰離子柱層析，陽(yáng)離子柱層析，反相填料柱層析三步分離純化步驟。包括步驟a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，獲得復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子柱層析，得到陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物；f、對(duì)陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人干擾素。同現(xiàn)有技術(shù)相比較，采用本專利的反相填料精細(xì)分離，rhIFN電泳純度由90%提高到98%, HPLC純度由90%提高到98%，其比活由O. 9X 107IU/mg提高至Ij 3. 5X IO8IU/mg。_30°C條件下穩(wěn)定性由原有的3個(gè)月提高到12個(gè)月。可見，采用本發(fā)明的重組人干擾素的純化工藝，可以大幅度的提高rhIFN的純度、比活、穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種干擾素的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；C、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，獲得復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子柱層析，得到陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物；f、采用反相填料柱層析處理上步的陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)脫鹽處理，得到干 擾素。其中，所述干擾素選自干擾素α-la，干擾素a _2a，干擾素a _2b，優(yōu)選的是干擾素a -2b ο其中步驟a_c屬于現(xiàn)有技術(shù)，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的方法獲得。本發(fā)明所述的步驟d_f屬于純化步驟，屬于本發(fā)明的技術(shù)方案，其中，優(yōu)選的技術(shù)方案如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L PH8. 2 Tris-HCl緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min。平衡8_10倍柱床體積。樣品預(yù)處理將復(fù)性產(chǎn)物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調(diào)其PH值為8. 2，然后用注射用水將其體積稀釋四倍，即為上樣液。上樣上樣時(shí)泵流速為8. 0-49. 9ml/min。上樣結(jié)束后用平衡液平衡2_4個(gè)柱床體積。洗脫使用預(yù)洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min，洗脫2_4個(gè)柱床體積。然后將進(jìn)液管換至洗脫液(20mmol/L pH7. 8NaH2P04-Na2HP04緩沖液、O.1MNaCL)中，開始目標(biāo)峰洗脫，收集OD28tl大于O. 3洗脫峰。陽(yáng)離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L PH4. 5 HAc-NaAc緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積。上樣上樣液為上步得到的A280大于O. 3的洗脫液，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min，開始上樣。上樣結(jié)束后，換至平衡液中，平衡2-4個(gè)柱床體積，至記錄筆回至基線。用預(yù)脫液(20mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 15 MNaCL緩沖液)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min,至雜質(zhì)峰洗下為止。換至洗脫液(50mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 2MNaCL緩沖液)進(jìn)行洗脫目的峰，收集A280大于O. 3的洗脫峰。反相填料層析采用C18 高效液相色譜柱(WTARES PREPLC4000, WTARES C18 柱，25mm*100mm*3)，流動(dòng)相A為6%乙腈，O. P/oTFA (三氟乙酸)，流動(dòng)相B為30%乙腈，O. 1%TFA (三氟乙酸)，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目標(biāo)峰，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或冷凍干燥的方法去除乙腈和TFA，即為純化的rhIFN,取樣檢測(cè)。經(jīng)取樣檢測(cè)，經(jīng)反相填料層析分離純化的樣品其電泳純度與HPLC純度均大于98%，經(jīng)測(cè)定其比活可達(dá)到3.5X108IU/mg。該樣品在_30°C條件下放置12個(gè)月，該樣品電泳純度和活性均無(wú)顯著性變化。穩(wěn)定性可以保證12個(gè)月。其他質(zhì)量控制項(xiàng)目均符合藥典要求。采用本發(fā)明的的生產(chǎn)工藝，可以大幅度的提高rhIFN的純度、比活、穩(wěn)定性。本發(fā)明的工藝方法是經(jīng)過(guò)篩選獲得的，篩選過(guò)程如下層析方式的選擇針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)設(shè)計(jì)了 5種層析方式，用這5種方式對(duì)復(fù)性溶液進(jìn)行純化，然后進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種干擾素的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；C、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，獲得復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子柱層析，得到陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物；f、采用反相填料柱層析處理上步的陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)脫鹽處理，得到干擾素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其中，所述干擾素選自干擾素α-la，干擾素a-2a， 干擾素a -2b ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其中，所述干擾素是干擾素a-2b。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其中，所述對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理方法如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L PH8. 2 Tris-HCl緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積，樣品預(yù)處理將復(fù)性產(chǎn)物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調(diào)其PH值為8. 2，然后用注射用水將其體積稀釋四倍，即為上樣液，上樣上樣時(shí)泵流速為8. 0-49. 9ml/min，上樣結(jié)束后用平衡液平衡2_4個(gè)柱床體積，洗脫使用預(yù)洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為30.0-49.91111/1^11，洗脫2-4個(gè)柱床體積，然后將進(jìn)液管換至洗脫液(20臟01/1 pH7. 8 NaH2P04-Na2HP04緩沖液、O.1MNaCL)中，開始目標(biāo)峰洗脫，收集OD28tl大于O. 3洗脫峰。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其中，所述對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子柱層析，方法如下陽(yáng)離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L PH4. 5 HAc-NaAc緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/ min，平衡8_10倍柱床體積，上樣上樣液為上步得到的A280大于O. 3的洗脫液，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/ min,開始上樣，上樣結(jié)束后，換至平衡液中，平衡2-4個(gè)柱床體積，至記錄筆回至基線，用預(yù)脫液(20mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 15 MNaCL緩沖液)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為 30. 0-49. 9ml/min,至雜質(zhì)峰洗下為止,換至洗脫液(50mmol/L PH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 2 MNaCL緩沖液)進(jìn)行洗脫目的峰，收集A280大于O. 3的洗脫峰。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其中，所述采用反相填料柱層析處理上步的陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物，方法如下反相填料層析采用 C18 高效液相色譜柱(WTARES PREPLC4000, WTARES C18 柱，25mm*100mm*3)，流動(dòng)相A為6%乙腈，O. 1%TFA(三氟乙酸)，流動(dòng)相B為30%乙腈，O. 1%TFA(三氟乙酸)，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目標(biāo)峰，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或冷凍干燥的方法去除乙腈和TFA，即為純化的rhIFN。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干擾素的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，獲得復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子柱層析，得到陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物；f、采用反相填料柱層析處理上步的陽(yáng)離子柱層析產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)脫鹽處理，得到干擾素。
文檔編號(hào)C07K1/18GK103014101SQ20121056982
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者段志強(qiáng), 楊棟, 陳玉軍, 龐睿, 鄭立運(yùn), 王晴, 吳貴海, 趙鈺, 白宇, 張崇遠(yuǎn), 楊超 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物工程有限公司