從生物分子制劑中去除殺病毒劑的制作方法
【專利摘要】提供了用于抗體層析純化的方法、組合物和試劑盒。在一些實施方式中，用由聚陽離子試劑處理的羥基磷灰石(HT)或氟基磷灰石(FT)純化抗體。在一些實施方式中，在純化之前用也作為殺病毒劑的聚陽離子試劑處理抗體。
【專利說明】從生物分子制劑中去除殺病毒劑
[0001]相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求2011年9月20日提交的美國臨時專利申請第61/536，886號的優(yōu)先權(quán)，該文的全部內(nèi)容通過引用納入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]可能需要對生物分子，如用于治療或診斷目的的抗體、其它治療性蛋白、病毒和病毒樣顆粒以及DNA質(zhì)粒進行純化。另外，由體內(nèi)或體外方法產(chǎn)生的天然和重組蛋白需要用殺病毒條件或化合物進行處理以確保接受基于這些蛋白的治療的患者的安全。許多殺病毒劑是高度毒性的。殺病毒治療的并發(fā)癥是殺病毒劑本身可能與處理的蛋白產(chǎn)物形成穩(wěn)定結(jié)合。這些結(jié)合可能使得從蛋白制劑中完全去除殺病毒劑變得困難或不可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了 2階段(例如，至少2階段)的病毒滅活方法。在一些實施方式中，該方法包括在一定條件下孵育包括目標(biāo)分子的生物樣品與帶正電或中性的殺病毒劑使得樣品中可能存在的病毒滅活；隨后在一定條件下使目標(biāo)分子與磷灰石支承物接觸導(dǎo)致目標(biāo)生物分子與支承物結(jié)合，使得目標(biāo)生物分子與磷灰石結(jié)合并且使大多數(shù)的殺病毒劑流過支承物；用第一洗滌緩沖液洗滌結(jié)合目標(biāo)分子的支承物，其中第一洗滌緩沖液包括至少一種第二殺病毒劑，其中該第二殺病毒劑的濃度足夠使可能存在的病毒滅活，并且解離帶正電或中性的殺病毒劑與目標(biāo)分子的絡(luò)合物，從而去除可能存在的至少一部分殘留的殺病毒劑；并且從支承物上洗脫目標(biāo)生物分子，使得目標(biāo)生物分子基本不含帶正電或中性的殺病毒劑。
[0006]在一些實施方式中，帶正電或中性的殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶(ethacridine)、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
`[0007]在一些實施方式中，所述方法還包括在洗滌和洗脫之間使支承物與第二洗滌緩沖液接觸。在一些實施方式中，相比第一洗滌緩沖液，第二洗滌緩沖液具有較低的電導(dǎo)率并且不含離液劑。
[0008]在一些實施方式中，磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。在一些實施方式中，磷灰石至少在接觸和洗滌期間是天然形式的。
[0009]在一些實施方式中，磷灰石至少在接觸和洗滌期間是金屬-衍生形式的。在一些實施方式中，金屬是二價或三價陽離子。一些實施方式中，金屬選自鈣、鐵和鋅。
[0010]在一些實施方式中，磷灰石至少在接觸和洗滌期間是聚陽離子-衍生形式的。在一些實施方式中，聚陽離子選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
[0011]在一些實施方式中，第一洗滌緩沖液包括氯化鈉、精氨酸、鹽酸胍、尿素、表面活性劑或其組合。在一些實施方式中，第一洗滌緩沖液包括氯化鈉和尿素、氯化鈉和鹽酸胍、或氯化鈉和精氨酸。
[0012]在一些實施方式中，第二殺病毒劑是氯化鈉或離液劑。在一些實施方式中，離液劑是精氨酸、胍或尿素。
[0013]在一些實施方式中，第一洗滌緩沖液包括足夠高的電導(dǎo)率和/或足夠量的離液劑以洗脫殺病毒劑同時基本不洗脫目標(biāo)生物分子。
[0014]在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子在pH4時是不穩(wěn)定的。
[0015]在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子是蛋白。在一些實施方式中，蛋白是抗體。在一些實施方式中，抗體是IgG或IgM抗體。
[0016]在一些實施方式中，洗脫包括使支承物與包括磷酸鈉的溶液接觸。
[0017]本發(fā)明還提供從生物分子制劑中去除帶正電或中性的殺病毒劑的方法。在一些實施方式中，所述方法包括在一定條件下使包括目標(biāo)生物分子和殺病毒劑的生物分子制劑與磷灰石支承物接觸，導(dǎo)致目標(biāo)生物分子與支承物結(jié)合，使得目標(biāo)生物分子與磷灰石結(jié)合并且大多數(shù)的殺病毒劑流過支承物；并且從支承物上洗脫目標(biāo)生物分子使得目標(biāo)生物分子基本上不含殺病毒劑。
[0018]在一些實施方式中，在接觸步驟之后使殘留的殺病毒劑與支承物上的目標(biāo)生物分子結(jié)合，并且所述方法還包括在接觸和洗脫之間用第一洗滌緩沖液洗滌支承物，從而洗脫至少大部分的殘留的殺病毒劑同時使得基本上所有的蛋白目標(biāo)保持結(jié)合在支承物上。
[0019]在一些實施方式中，所述第一洗滌緩沖液包括氯化鈉、精氨酸、鹽酸胍、尿素、表面活性劑或其組合。在一些實施方式中，第一洗滌緩沖液包括氯化鈉和尿素、氯化鈉和鹽酸胍、或氯化鈉和精氨酸。在一些實施方式中，第一洗滌緩沖液包括足夠高的電導(dǎo)率和/或足夠量的離液劑以洗脫殺病毒劑同時基本不洗脫目標(biāo)生物分子。
[0020]在一些實施方式中，所述方法還包括在洗滌和洗脫之間使支承物與第二洗滌緩沖液接觸，該第二洗滌緩沖液相比`第一洗滌緩沖液具有較低電導(dǎo)率并且不含離液劑。
[0021 ] 在一些實施方式中，磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
[0022]在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子是蛋白。在一些實施方式中，蛋白是抗體。在一些實施方式中，抗體是IgG或IgM抗體。
[0023]在一些實施方式中，殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
[0024]在一些實施方式中，在接觸之前或期間，使磷灰石與足量的聚陽離子接觸以封閉磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得殺病毒劑基本不與磷灰石支承物結(jié)合。
[0025]在一些實施方式中，所述聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
[0026]在一些實施方式中，在接觸之前或期間，使磷灰石與足量的二價或三價陽離子接觸以封閉磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得殺病毒劑基本不與磷灰石支承物結(jié)合。在一些實施方式中，所述二價或三價陽離子選自鈣、鐵和鋅。
[0027]在一些實施方式中，洗脫包括使支承物與包含磷酸鈉的溶液接觸。
[0028]在一些實施方式中，接觸以及任選地洗滌的條件不包括破壞殺病毒劑和目標(biāo)生物分子之間結(jié)合的去污劑或疏水分子。
[0029]本發(fā)明還提供與目標(biāo)生物分子接觸的磷灰石層析支承物和帶正電或中性的殺病毒劑。在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子與磷灰石層析支承物結(jié)合。在一些實施方式中，磷灰石層析支承物還與足量的聚陽離子接觸以封閉磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得殺病毒劑基本不與磷灰石支承物結(jié)合。在一些實施方式中，聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
[0030]在一些實施方式中，磷灰石還與足量的二價或三價陽離子接觸以封閉磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得殺病毒劑基本不與磷灰石支承物結(jié)合。在一些實施方式中，二價或三價陽離子選自鈣、鐵和鋅。
[0031 ] 在一些實施方式中，磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
[0032]在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子是蛋白。在一些實施方式中，蛋白是抗體。在一些實施方式中，抗體是IgG或IgM抗體。
[0033]在一些實施方式中，固體支承物或與固體支承物接觸的溶液不包含破壞殺病毒劑和目標(biāo)生物分子的結(jié)合的去污劑或疏水分子。
[0034]在一些實施方式中，殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
[0035]本發(fā)明還提供了聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物。在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子與磷灰石層析支承物結(jié)合。在一些實施方式中，聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。在一些實施方式中，磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子是蛋白。在一些實施方式中，蛋白是抗體。在一些實施方式中，抗體是IgG或IgM抗體。
[0036]本發(fā)明還提供純化樣品中的生物分子的方法。在一些實施方式中，所述方法包括使樣品與聚陽離子衍生 的磷灰石固體支承物接觸；并且純化目標(biāo)生物分子。在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子與固體支承物結(jié)合并且隨后洗脫，任選地之后洗滌支承物從而從樣品中去除污染物。在一些實施方式中，目標(biāo)分子流過固體支承物同時來自樣品的至少一些污染物與固體支承物結(jié)合。在一些實施方式中，聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。在一些實施方式中，磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子是蛋白。在一些實施方式中，蛋白是抗體。在一些實施方式中，抗體是IgG或IgM抗體。
[0037]本發(fā)明還提供試劑盒。在一些實施方式中，試劑盒包括(i)磷灰石層析支承物，和(?)帶正電或中性的殺病毒劑。
[0038]在一些實施方式中，試劑盒還包括能夠封閉磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷的聚陽離子，使得殺病毒劑基本不與磷灰石支承物結(jié)合。在一些實施方式中，聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
[0039]在一些實施方式中，試劑盒還包括能夠封閉磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷的二價或三價陽離子，使得殺病毒劑基本不與磷灰石支承物結(jié)合。在一些實施方式中，所述二價或三價陽離子選自鈣、鐵和鋅。
[0040]在一些實施方式中，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
[0041]在一些實施方式中，殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
[0042]還提供了從樣品中純化目標(biāo)生物分子的方法。在一些實施方式中，所述方法包括使樣品與聚陽離子衍生的磷灰石支承物接觸；并且在接觸之后收集目標(biāo)生物分子。
[0043]在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子與聚陽離子衍生的磷灰石支承物結(jié)合，并且所述方法包括隨后從支承物上洗脫目標(biāo)生物分子。
[0044]在一些實施方式中，洗脫包括使支承物與增加梯度的磷酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽、單羧酸鹽和單羧酸兩性離子接觸。
[0045]在一些實施方式中，在目標(biāo)生物分子的洗脫之前從支承物上洗下至少一種來自樣品的污染物。
[0046]在一些實施方式中，從支承物上洗下目標(biāo)生物分子的同時，有至少一種來自樣品的污染物還保持與支承物結(jié)合。在一些實施方式中，目標(biāo)生物分子是抗體而污染物是DNA。
[0047]在一些實施方式中，所述方法還包括在使樣品與支承物接觸之后并且在目標(biāo)生物分子的洗脫之前的至少一個洗滌。在一些實施方式中，洗滌包括用包含至少0.5M鹽的溶液洗滌包括結(jié)合的目標(biāo)生物分子的支承物。在一些實施方式中，洗滌包括用包含離液劑的溶液洗滌包括結(jié)合的目標(biāo)生物分子的支承物。在一些實施方式中，洗滌包括用包含精氨酸的溶液洗滌包括結(jié)合的目標(biāo)生物分子的支承物。
[0048]在一些實施方式中，樣品中的至少一種污染物與聚陽離子衍生的磷灰石支承物結(jié)合并且目標(biāo)生物分子流過支承物且基本上不與聚陽離子衍生的磷灰石支承物結(jié)合。在一些實施方式中，污染物選自DNA、病毒、蛋白A和內(nèi)毒素。
[0049]在一些實施方式中，生物分子是蛋白或多核苷酸。在一些實施方式中，生物分子是蛋白。在一些實施方式中，生物分子是抗體。在一些實施方式中，抗體包括IgG、IgM或其抗原結(jié)合片段。
[0050]在一些實施方式中，聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺、聚組氨酸、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺、聚甲炔(polydimethrine)、聚甲基丙烯酰氨基丙基三甲基氨、聚二烯丙基二甲基氨、聚乙烯芐基三甲基氨；聚乙烯胍、聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶)、DEAE-葡聚糖和DEAE-纖維素。在一些實施方式中，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
[0051]還提供了聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物，其中聚陽離子選自聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺、聚組氨酸、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺、聚甲炔、聚甲基丙烯酰氨基丙基三甲基氨、聚二烯丙基二甲基氨、聚乙烯芐基三甲基氨；聚乙烯胍、聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶)、DEAE-葡聚糖和DEAE-纖維素。在一些實施方式中，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
[0052]還提供了包括聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物的試劑盒，其中聚陽離子選自聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺、聚組氨酸、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺、聚甲炔、聚甲基丙烯酰氨基丙基三甲基氨、聚二烯丙基二甲基氨、聚乙烯芐基三甲基氨；聚乙烯胍、聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶)、DEAE-葡聚糖和DEAE-纖維素。在一些實施方式中，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
[0053]附圖簡述
[0054]圖1是表示用殺病毒劑PEI處理的IgM抗體的純化的層析圖(曲線I)。試劑和條件如下:CHT? I型，40 μ m。ImLlmL/分鐘。平衡和洗滌I緩沖液:50mM Hepes, ρΗ7.0 ；洗滌 2:500mM 精氨酸，2Μ NaCl, 50mM Hepes, ρΗ7.0 ;洗滌 3:50mM Hepes, ρΗ7.0 ;洗脫緩沖液:10250mM磷酸鈉，ρΗ7.0 ;用500mM磷酸鹽清洗。如實施例中所述，通過注入5mL在50mM!fepes中的1% PE1-1300，pH7.0將CHT?轉(zhuǎn)化為聚陽離子衍生的CHT?，并且在顯示洗脫曲線`之前用平衡緩沖液洗滌CHT?柱。用平衡緩沖液平衡柱，并且將2mL的PE1-處理的IgM上清液加載到柱上。用洗滌1緩沖液將柱洗至基線；用洗滌2緩沖液洗滌，用洗滌3緩沖液洗滌，并且在10個柱體積線性梯度下洗脫至洗脫緩沖液。用500mM磷酸鹽清潔柱。用UV254和280nm曲線、電導(dǎo)率曲線和pH曲線來監(jiān)測結(jié)果。
[0055]圖2顯示表示從CHT? I柱上洗脫IgM的兩個對照層析圖，其洗脫條件與圖1相同，區(qū)別在于沒有用PEI處理CHT?(曲線2)或省略洗滌2 (曲線3)。
[0056]圖3是表示用殺病毒劑依沙吖啶處理的IgM抗體的純化的層析圖(曲線1)，如實施例中所述。在用依沙吖啶處理之前從IgM上清液中去除DNA。試劑和條件如下:用
0.00125%依沙吖啶處理的CHT? II型40微米柱，lmL5x50, lmL/分鐘。緩沖液如以上圖1所述，區(qū)別在于洗滌2不含精氨酸。用UV254、280和365nm曲線、電導(dǎo)率曲線和pH曲線來監(jiān)測結(jié)果。
[0057]圖4是表示用殺病毒劑依沙吖啶處理的IgM抗體純化的層析圖(曲線2)，如圖4所述，區(qū)別在于用0.00625%依沙吖啶處理CHT? II柱。
[0058]定義
[0059]定義術(shù)語使得本發(fā)明更易于理解。其它定義在詳細(xì)的說明書全文中列出。
[0060]“磷灰石固體支承物”是指其物理形式適于進行層析的鈣和磷酸鹽的礦物。例子包括但不限于羥基磷灰石和氟基磷灰石。這個定義被理解為包含天然和金屬陽離子衍生形式的磷灰石固體支承物。
[0061 ] “羥基磷灰石”是指包括具有結(jié)構(gòu)式Ca1(l (P04) 6 (0H) 2的磷酸鈣的不溶性羥基化礦物的層析支承物。其相互作用的主要模式是磷?；栯x子交換和鈣金屬親和力。
[0062]“氟基磷灰石”是指包括具有結(jié)構(gòu)式Ca1(l(P04)6F2的磷酸鈣的不溶性氟化礦物的層析支承物。其相互作用的主要模式是磷酰基陽離子交換和鈣金屬親和力。
[0063]“陶瓷”羥基磷灰石(CHT?)或“陶瓷”氟基磷灰石(CFT?)是指相應(yīng)礦物的市售形式(來自伯樂公司(Bio-Rad))，其中納米晶體團聚成顆粒并且在高溫下熔合以產(chǎn)生適于層析應(yīng)用的穩(wěn)定的陶瓷微球。陶瓷羥基磷灰石的商業(yè)例子包括但不限于CHT? I型和CHT? II型。氟基磷灰石的商業(yè)例子包括但不限于CFT? I型和CFT? II型。除非另有說明，否則，CHT?和CFT?是指包括但不限于約10、20、40和80微米的任意平均直徑的大致球形顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定羥基磷灰石或氟基磷灰石的選擇、類型和平均顆粒直徑。
[0064]“金屬-衍生的磷灰石固體支承物”是指在不含磷酸鹽緩沖液的情況下用二價金屬陽離子處理的磷灰石固體支承物，以產(chǎn)生其中通過結(jié)合金屬離子來中和帶負(fù)電的天然磷灰石磷酸鹽基團的表面，并且該金屬離子可用于參加與生物分子如蛋白、多核苷酸和病毒的配位相互作用。一個例子包括由鈣衍生的磷灰石。這使得表面留下天然鈣殘留和二級鈣殘留(secondary calcium residue)。由其它金屬衍生的磷灰石留下了混合金屬特征的表面:原始的鈣加上衍生的一種或多種金屬。
[0065]“陽離子聚合物修飾的磷灰石支承物”即“聚陽離子衍生的磷灰石支承物”是指已經(jīng)用帶正電的聚合物處理以產(chǎn)生一定表面的磷灰石固體支承物，在該表面中帶負(fù)電的天然磷灰石磷酸鹽基團被中和并且在聚合物上的過量帶正電基團使得整個表面帶凈正電。聚陽離子或“陽離子聚合物”是指含有3個或更多個正電荷的分子，并且在一些實施方式中，在單個分子內(nèi)包括4個或更多個，5個或更多個，6個或更多個，7個或更多個，8個或更多個，或者9個或更多個的正電荷。聚乙烯亞胺是能夠用于該目的的陽離子聚合物的一個例子。聚合物大小范圍可以是從幾百到超過100，000道爾頓?？梢杂糜诋a(chǎn)生相似效果的其它陽離子聚合物包括但不限于聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
[0066]“目標(biāo)分子”或“目標(biāo)生物分子”是指用于按照本發(fā)明方法純化的生物分子或生物來源的分子。目標(biāo)分子包括但不限于蛋白、多核苷酸、病毒和病毒樣顆粒。蛋白的例子包括但不限于抗體、酶、生長調(diào)節(jié)因子、凝血因子和磷蛋白。多核苷酸的例子包括DNA和RNA。病毒的例子包括包被和非包被的病毒。
[0067]“抗體”是指任何免疫球蛋白或其復(fù)合形式。該術(shù)語可以包括但不限于衍生自人或其它哺乳動物細(xì)胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM類的多克隆或單克隆抗體，包括天然或遺傳修飾的形式，如人源化、人、單鏈、嵌合、合成、重組、雜交、突變、移植和體外產(chǎn)生的抗體。“抗體”還可包括含有免疫球蛋白部分的融合蛋白?！翱贵w”還可包括抗體片段，如Fab、F{ah' ) 2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它組成,無論它們是否保留抗原結(jié)合功能。
[0068]“污染物”或“復(fù)合污染物”是指與待純化的目標(biāo)分子結(jié)合的不需要的組分。無論結(jié)合的機理如何，這種結(jié)合可以是共價或非共價的。污染物的例子包括但不限于抗病毒劑、蛋白、核酸、脂質(zhì)、各種細(xì)胞培養(yǎng)基組分和添加劑、金屬離子、硫氧還蛋白、硫化物和內(nèi)毒素。
[0069]“生物分子制劑”和“生物樣品”是指含有需要純化的生物來源的目標(biāo)分子(“生物分子”)的任意組合物。在一些實施方式中，待純化的目標(biāo)分子是抗體。
[0070]術(shù)語“去污劑”是指具有極性(水溶性)和非極性(疏水性)結(jié)構(gòu)域的兩親性、表面活性分子。去污劑與疏水性分子或分子結(jié)構(gòu)域強烈結(jié)合以賦予水溶性。去污劑的例子在US5, 883，256中描述。與US5，883，256中的去污劑的應(yīng)用相反，本發(fā)明通過與層析支承物的不同親和力解離目標(biāo)分子和殺病毒劑的絡(luò)合物。
[0071]術(shù)語“聚陽離子”`包含具有大量正電荷的分子。例如，該術(shù)語包括多胺如聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。其它示例性聚陽離子包括，例如聚乙烯亞胺。
[0072]“結(jié)合-洗脫模式”是指層析的一種操作方法，其中建立緩沖條件使得當(dāng)向配體(其任選地與固體支承物結(jié)合)加入樣品時，目標(biāo)分子以及任選地不需要的污染物與離子交換配體結(jié)合。隨后能通過改變條件使得目標(biāo)從支承物上洗脫下來實現(xiàn)目標(biāo)的分離。在一些實施方式中，在目標(biāo)洗脫之后，污染物還保持結(jié)合。在一些實施方式中，在目標(biāo)洗脫之前，污染物流穿或結(jié)合并被洗脫。
[0073]“流穿模式”是指層析的一種操作方法，其中建立緩沖條件使得待純化的目標(biāo)分子流穿包括離子交換配體的層析支承物，同時至少一些樣品污染物選擇性地保留，因此實現(xiàn)它們的去除。
【具體實施方式】
[0074]1.引言
[0075]用聚陽離子修飾磷灰石將磷灰石從鈣親和/陽離子交換混合模式支承物(本文稱為“天然形式”)轉(zhuǎn)化為鈣親和、陰離子交換混合模式支承物。對于天然形式的磷灰石，陽離子交換和鈣親和機制有時候是互相拮抗的。例如對于DNA，天然磷灰石磷?；栯x子交換基團排斥DNA上的帶負(fù)電的磷酸鹽基團。與天然磷灰石支承物結(jié)合的DNA仍然通過鈣親和實現(xiàn)，但是結(jié)合被弱化。相反，用聚陽離子修飾磷灰石支承物封閉了天然的磷?；栯x子交換基團并且代之以過量的來自修飾聚陽離子的正電荷形式的陰離子交換基團。在O到超過200mS/cm的電導(dǎo)率下，陰離子交換功能與鈣親和力協(xié)同工作以支持增強的酸性污染物分子的保留。這使得能夠在高鹽條件下使用聚陽離子衍生的磷灰石支承物作為陰離子交換劑并且提供了從IgG、IgM或其它抗體制劑中去除污染物如DNA的獨特能力。雖然原始的發(fā)現(xiàn)是在抗體純化的情況中，但發(fā)明人相信這些方法能用于其它生物分子的純化。
[0076]體內(nèi)或通過體外細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的天然和重組蛋白攜帶由病毒物種造成的污染的固有威脅，其可以是對治療疾病的治療性蛋白的接受者的直接威脅。因此必須處理這樣的產(chǎn)品來減少或去除二次病毒感染的威脅。一種常用的處理是將病毒暴露于低PH環(huán)境下一段時間，然后將制劑恢復(fù)到中性pH。另一種常用的處理是用殺病毒劑孵育含有該產(chǎn)品的制劑。這殺死了病毒但是在處理后需要額外的步驟來去除殺病毒劑。因為另外的操作步驟，殺病毒處理主要局限于不能耐受暴露于低pH的蛋白。
[0077]殺病毒劑的使用存在至少兩個限制。一個是殺病毒劑可與產(chǎn)物形成足夠穩(wěn)定以耐受簡單的去除過程的絡(luò)合物。這使得低水平的殘留殺病毒劑在處理的制劑中持續(xù)存在，由于殺病毒劑是固有毒性的，所以這是一個問題。另一個限制是并非所有的病毒物種都能通過常用的殺病毒處理被充分滅活。例如，已知TNBP和表面活性劑處理對于衣殼蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒沒有滅活效果。
[0078]本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)解決了這兩個限制。在使產(chǎn)物與磷灰石支承物結(jié)合之后，用解離殘留的第一階段殺病毒劑的試劑洗滌產(chǎn)物，該殺病毒劑可能已與產(chǎn)物形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。許多有效解離這些殺病毒劑的試劑本身是殺病毒劑并且提供第二階段的滅活步驟。
[0079]磷灰石支承物特別適合于該應(yīng)用，因為它們甚至能夠在高濃度的中性鹽如NaCl存在下，在離液劑如尿素、精氨酸、胍和表面活性劑存在下(這些全都提供了滅活病毒并且從蛋白產(chǎn)物中解離滅活劑如依沙吖啶等的組合能力)維持強蛋白結(jié)合的能力。
[0080]由于本文所述的方法能增強非病毒污染物如宿主蛋白、DNA和內(nèi)毒素的去除，所以該發(fā)現(xiàn)提供了額外的應(yīng)用。在這些情況下的增強來自于第二階段洗滌解離可能存在于產(chǎn)物和任意這些污染物類型之間的絡(luò)合物的能`力。
[0081]另外，已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，能夠使用磷灰石層析支承物從包括目標(biāo)生物分子的樣品中去除帶正電或中性的殺病毒劑，并且洗滌步驟也能作為單獨的抗病毒步驟，從而提供2-階段抗病毒步驟。當(dāng)產(chǎn)生用于人或動物給藥的生物衍生的分子時，許多藥物管理機構(gòu)要求一些不同的獨立的抗病毒步驟。通過調(diào)整用于去除殺病毒劑的一個或多個洗滌步驟以包含高鹽(和任選的離液劑)，洗滌步驟本身能夠發(fā)揮去除殘留殺病毒劑作用和作為抗病毒步驟，其原因在于高鹽(和離液劑)步驟具有抗病毒效果。事實上，從磷灰石對于某些病毒的親和力的角度來看，在一些情況下，可認(rèn)為該方法包括3個單獨的抗病毒機制。
[0082]還驚訝地發(fā)現(xiàn)能通過使抗體和殺病毒劑與磷灰石支承物接觸來從殺病毒劑中純化抗體，并且從支承物中洗脫結(jié)合的目標(biāo)生物分子使得該抗體基本不含殺病毒劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一定條件，在該條件下抗體與支承物結(jié)合而大多數(shù)的殺病毒劑不與支承物結(jié)合并從支承物上洗脫。例如，在一些情況下，使用金屬陽離子或聚陽離子衍生的磷灰石能產(chǎn)生這個結(jié)合性質(zhì)。如上述，根據(jù)需要，能夠用一個或多個本文詳述的洗滌步驟去除與目標(biāo)抗體絡(luò)合的殘留的殺病毒劑，可對這些步驟進行設(shè)計以具備單獨的抗病毒效果。例如，能夠通過用具有高電導(dǎo)率和/或足夠洗脫殺病毒劑但不洗脫生物分子的量的離液劑的緩沖液洗滌支承物來去除與結(jié)合到支承物的目標(biāo)生物分子保持結(jié)合的殘留的殺病毒劑。在一些實施方式中，然后通過用具有較低電導(dǎo)率并且不含離液劑的緩沖液洗滌支承物來洗脫結(jié)合的生物分子。雖然原始的發(fā)現(xiàn)是在抗體的情況中，但發(fā)明人相信這些方法能用于其它生物分子的純化。
[0083]I1.方法
[0084]本發(fā)明的方法使用磷灰石層析來從生物樣品(生物分子制劑)中純化目標(biāo)分子。通常，本發(fā)明的方法包括使包含目標(biāo)分子的樣品與聚陽離子衍生的磷灰石支承物接觸并且隨后收集從樣品的一個和多個其它組分中純化的目標(biāo)分子。在一些實施方式中，所述方法包括使包括目標(biāo)分子的樣品與聚陽離子衍生的磷灰石支承物接觸，從而非共價地將目標(biāo)分子與磷灰石支承物結(jié)合；任選地洗滌結(jié)合的目標(biāo)分子；并且從磷灰石支承物上洗脫目標(biāo)分子。示例性的聚陽離子包括，但不限于聚乙烯亞胺(PEI)、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺、聚組氨酸、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺、聚甲炔、聚甲基丙烯酰氨基丙基三甲基氨、聚二烯丙基二甲基氨、聚乙烯芐基三甲基氨、聚乙烯胍、聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶)、DEAE-葡聚糖和DEAE-纖維素。
[0085]在一些方面，本發(fā)明的方法包括使包含目標(biāo)生物分子的樣品(其中，已經(jīng)預(yù)先用帶正電或中性的殺病毒劑孵育目標(biāo)分子)與磷灰石固體支承物接觸，從而非共價地將目標(biāo)分子與磷灰石支承物結(jié)合；洗滌結(jié)合的目標(biāo)分子，其中要求或希望在病毒滅活并且目標(biāo)分子基本上保持結(jié)合在磷灰石支承物上的條件下去除殘留的絡(luò)合的殺病毒劑；然后從磷灰石支承物上洗脫目標(biāo)分子(基本不含殺病毒劑)。
[0086]所述方法可包括起始的孵育步驟，其中在本領(lǐng)域已知的合適條件下用生物分子制劑孵育殺病毒劑合適的時間，使得殺病毒劑結(jié)合、破壞或干擾制劑中存在的病毒。在孵育之后，使得含有殺病毒劑的制劑直接或在一個或多個初始純化步驟之后與本文所述的磷灰石層析支承物接觸。將會理解，可將用殺病毒劑孵育的樣品直接加到磷灰石支承物上或在目標(biāo)分子與磷灰石支承物接觸之前通過一個或多個純化或其它步驟來實現(xiàn)。
[0087]接觸步驟
[0088]在一些實施方式中，在使含有目標(biāo)生物分子的樣品與磷灰石支承物(例如，磷灰石柱)接觸之前，平衡柱內(nèi)的化學(xué)環(huán)境。以它們的天然形式存在的磷灰石支承物通常包括大量的帶負(fù)電的磷酸根(p04_)部分，主要由其產(chǎn)生磷灰石對于某些分子的親和力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用陽離子源處理磷灰石支承物從而封閉磷酸根部分的負(fù)電荷能產(chǎn)生一定的條件，在該條件中盡管目標(biāo)生物分子仍然結(jié)合聚陽離子處理的磷灰石支承物，但是其它樣品組分(例如，帶正電或中性的組分)并不顯著結(jié)合陽離子處理的磷灰石支承物。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用陽離子源處理磷灰石支承物從而封閉磷酸根部分的負(fù)電荷能產(chǎn)生一定的條件，在該條件中盡管目標(biāo)生物分子仍然結(jié)合陽離子處理的磷灰石支承物，但是殺病毒劑(通常是帶正電或中性的)并不顯著結(jié)合陽離子處理的磷灰石支承物。因此，在一些實施方式中，用包含封閉磷灰石磷酸根部分的陽離子分子的溶液來預(yù)平衡磷灰石支承物。這是通過例如使包含陽離子分子的平衡緩沖液流過柱來實現(xiàn)的，以建立合適的pH、電導(dǎo)率和鹽濃度。
[0089]在一些實施方式中，用于封閉磷灰石磷酸根的陽離子分子是二價或三價陽離子，以產(chǎn)生“陽離子衍生的”磷灰石。示例性的二價或三價陽離子包括，但不限于鈣、鐵或鋅。在磷灰石磷酸根被二價或三價陽離子封閉的實施方式中，平衡緩沖液可包含合適的二價或三價陽離子鹽，但是通常不包含磷酸鹽或其它從磷灰石上去除(競爭去除)二價或三價陽離子的鹽。二價或三價陽離子的濃度應(yīng)該足夠封閉磷灰石表面上足夠量(例如，幾乎全部)的負(fù)電荷，使得中性或陽離子的殺病毒劑并不與陽離子衍生的磷灰石明顯結(jié)合。在一些實施方式中，二價或三價陽離子鹽的濃度為約2-5mM。其通常任選包含緩沖化合物來賦予充分的pH控制。緩沖化合物可包括但不限于MES、HEPES、BICINE、咪唑和Tris。在一些實施方式中，羥基磷灰石的平衡緩沖液的pH為約pH6.5-pH9.0。在一些實施方式中，氟基磷灰石的平衡緩沖液的PH為約pH5.0-pH9.0。
[0090]在一些實施方式中，在存在一種或多種緩沖化合物來賦予充分pH控制的情況下，用包含約2-10mM濃度的金屬陽離子鹽的溶液對磷灰石柱進行陽離子衍生。在一些實施方式中，例如，在存在20mM HEPES和20mM MES并且具有約7的pH條件下，通過施加包含5-10mM氯化鈣的平衡緩沖液來對磷灰石柱進行鈣衍生。
[0091]在一些實施方式中，通過聚陽離子的存在來對磷灰石柱進行衍生(例如，封閉磷灰石磷酸根)。示例性的聚陽離子包括，但不限于聚乙烯亞胺(PEI)、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。在磷灰石磷酸根由聚陽離子封閉的實施方式中，平衡緩沖液可包含合適的聚陽離子，但通常不包含磷酸鹽或其它從磷灰石中去除聚陽離子的鹽。
[0092]在一些實施方式中，在將樣品加入到柱之前，還可將包含目標(biāo)生物分子的樣品(可互換地稱為生物分子制劑)平衡至與柱平衡緩沖液相容的條件。這可包括，例如，調(diào)節(jié)pH、鹽濃度和其它化合物。
[0093]在一些實施方式中，包含目標(biāo)分子的樣品在與柱接觸之前先與殺病毒劑接觸。在一些實施方式中，使包含目標(biāo)分子的樣品與選自下組的殺病毒劑接觸:聚乙烯亞胺(PEI)、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯(TNBP)和亞甲藍。殺病毒劑的濃度取決于使用的特定試劑以及需要的病毒抑制程度。在一些實施方式中，樣品與0.01% PEI接觸。在一些實施方式中，樣品與0.001-0.010%依沙吖啶接觸。
[0094]在柱和生物分子制劑已經(jīng)被平衡之后，可使生物分子制劑與柱在允許目標(biāo)分子(其可能與殘留量的殺病毒劑絡(luò)合)與陽離子衍生的磷灰石結(jié)合的條件下接觸。通常，例如，蛋白與陽離子衍生的磷灰石強烈結(jié)合，并且因此能使用各種條件來使得目標(biāo)分子與陽離子衍生的磷灰石結(jié)合。
[0095]在一些實施方式中，用如上述的金屬陽離子或聚陽離子來對磷灰石固體支承物進行衍生，包括目標(biāo)分子的樣品包含帶正電的殺病毒劑。因此，當(dāng)生物樣品與金屬陽離子或聚陽尚子衍生的磷灰石接觸時，帶正電的殺病毒劑被帶正電的磷灰石排斥，從而使得殺病毒劑穿過柱。
[0096]任選的洗滌步驟
[0097]在一些實施方式(例如，需要去除殺病毒劑)中，在目標(biāo)分子結(jié)合到磷灰石固體支承物之后，在目標(biāo)分子基本保持與固體支承物的結(jié)合的條件下，能用一種或多種從目標(biāo)分子上移去絡(luò)合的殺病毒劑的試劑來洗滌結(jié)合的目標(biāo)分子，或去除其它污染物(例如，在目標(biāo)分子是抗體的情況中，DNA、內(nèi)毒素、殘留宿主細(xì)胞蛋白和浸出的蛋白A是不需要的污染物)。并不旨在限制本發(fā)明的范圍，發(fā)明人相信這些試劑通過弱化目標(biāo)分子與殺病毒劑之間的結(jié)合(例如，共價相互作用或非共價相互作用)來解離目標(biāo)分子與殺病毒劑。解離劑與磷灰石固體支承物聯(lián)合作用，其本身作用是從目標(biāo)分子解離或移去殺病毒劑。
[0098]在一些實施方式中，解離劑也作為殺病毒劑，導(dǎo)致第二階段的病毒滅活。例如，在一些實施方式中，用包含解離劑(其也是第二殺病毒劑)的溶液洗滌用第一殺病毒劑處理過的目標(biāo)生物分子。例如，在一些實施方式中，洗滌步驟包括以下一種洗滌步驟，其中包括選自氯化鈉或離液劑(例如，胍、精氨酸(參見例如Arakawa等，BiotechnOl.J.4(2):174-178 (2009))、尿素)或其組合的殺病毒劑。通常，在洗滌中使用足夠量的這些試劑來實現(xiàn)抗病毒效果，例如，來滅活至少50%、90%、95%、99%、99.9%或更多存在的病毒。
[0099]能使用各種試劑來移去或解離殺病毒劑。通常，該試劑是基本不干擾目標(biāo)分子與磷灰石柱結(jié)合的化合物(例如，對于鈣衍生的磷灰石柱，該試劑是對鈣沒有明顯親和力的試劑)。
[0100]在一些實施方式中，所述解離劑是離液劑。離液劑的例子包括，但不限于使氫鍵和疏水相互作用不穩(wěn)定的化合物或分子、增加非極性基團轉(zhuǎn)移到水或破壞水分子之間分子間作用力的物質(zhì)。離液劑的例子包括鹽酸胍、硫氰酸胍、高氯酸鋰、硫脲和尿素。值得注意的是，包括羥基磷灰石的磷灰石對離液劑是高度耐受的，但是給定蛋白的結(jié)合并不總是這樣。在沒有磷酸鹽的情況下，通過強鈣親和力結(jié)合的蛋白能夠耐受高鹽濃度。如果磷灰石被轉(zhuǎn)化為其鈣衍生或另一種陽離子衍生的形式，那么具有弱鈣親和力的蛋白就能夠耐受高鹽濃度。鹽耐受性使得蛋白結(jié)合甚至在例如強離液劑如2M胍條件下保持。
[0101]在一些實施方式中，解離劑選自精氨酸、尿素、胍、氯化鈉、無明顯鈣親和力的鹽(例如，NaCl、KCl、乙酸鈉、乙酸鉀、高氯酸鈉、高氯酸鉀、異硫氰酸鉀、胍鹽、氨基酸鹽和硫氰酸鹽)、有機溶劑、非離子或兩性離子表面活性劑、乙醇和異丙醇。
[0102]在一些實施方式中，該試劑是尿素。尿素也是抗病毒的并且所有形式的羥基磷灰石(衍生的或未衍生的)都能耐受尿素，因為尿素是非離子性的。
[0103]在一些實施方式中，試劑是氯化鈉。在足夠的濃度下，氯化鈉也能作為抗病毒劑。
[0104]在一些實施方式中`，該試劑是精氨酸。在一些實施方式中，該試劑是胍或其鹽。允許使用胍的任意條件也耐受精氨酸。一些使用者可能優(yōu)選精氨酸，因為其具有較溫和的效果，同時能通過其胍側(cè)基產(chǎn)生與胍相同的效果。然而對于能耐受暴露于胍的蛋白，優(yōu)選胍，因為在一些情況下胍是比精氨酸更有效的抗病毒劑。
[0105]在一些實施方式中，試劑是殺病毒有機溶劑。示例性的有機溶劑包括，但不限于乙二醇、丙二醇、醇類、DMSO和DMF。
[0106]在一些實施方式中，洗滌步驟包括使結(jié)合目標(biāo)分子的固體支承物與一種解離劑接觸。在一些實施方式中，洗滌步驟包括使結(jié)合目標(biāo)分子的固體支承物與2種、3種、4種或更多種不同的解離劑接觸。在一些實施方式中，洗滌步驟包括使結(jié)合目標(biāo)分子的固體支承物與包括2種或更多種不同的試劑的溶液接觸。如以下的實施例部分所示，與單獨使用每種解離劑相比，使用包括至少2種解離劑的溶液能增加從目標(biāo)分子解離絡(luò)合的殺病毒劑的效率。在一些實施方式中，2種或更多種不同的解離劑包括:精氨酸和氯化鈉，尿素和氯化鈉；鹽酸胍和鈉鹽酸鹽；尿素，氯化鈉和還原劑；鹽和有機溶劑；或鹽和表面活性劑。
[0107]在一些實施方式中，在從固體支承物上洗脫目標(biāo)分子之前，先從固體支承物上去除一種或多種解離劑。能通過例如用任意合適的不洗脫目標(biāo)生物分子的緩沖液(例如，“第二洗滌緩沖液”)洗滌固體支承物來從固體支承物上去除一種或多種試劑。例如，在一些實施方式中，能用約PH7的包括約50mM Hepes的緩沖液從磷灰石支承物上去除洗滌劑。
[0108]洗脫步驟[0109]在接觸之后可從磷灰石固體支承物上洗脫目標(biāo)分子，若發(fā)生了洗脫，則洗滌步驟如上述。在一些實施方式中，在洗滌步驟之后并且在目標(biāo)分子的洗脫期間或之前，將從中洗脫目標(biāo)分子的磷灰石固體支承物從金屬陽離子(例如，鈣)衍生的形式轉(zhuǎn)化為未衍生的形式。在一些實施方式中，在洗滌步驟之后并且在目標(biāo)分子的洗脫期間或之前，將從中洗脫目標(biāo)分子的磷灰石固體支承物從聚陽離子(例如，PEI)衍生的形式轉(zhuǎn)化為未衍生的形式。能通過使磷灰石固體支承物與例如磷酸鹽緩沖液接觸來將金屬陽離子衍生的磷灰石固體支承物或聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物轉(zhuǎn)化為未衍生的形式。在一些實施方式中，通過使磷灰石固體支承物與約PH7的包含約10mM磷酸鹽的緩沖液接觸來將衍生的磷灰石轉(zhuǎn)化為未衍生的條件。
[0110]在一些實施方式中，從中洗脫目標(biāo)分子的磷灰石固體支承物在目標(biāo)分子的洗脫期間保持金屬陽離子(例如，鈣)衍生的形式。
[0111]洗脫條件可包括，例如增加離子和/或緩沖液的濃度，從而與目標(biāo)分子競爭，使目標(biāo)分子脫離支承物。例如，在一些實施方式中，用磷酸鹽和/或氯化鈉梯度從天然形式的磷灰石洗脫目標(biāo)分子(即，使用磷酸鹽從陽離子衍生的形式轉(zhuǎn)化返回)，該梯度中緩沖液濃度升至例如至少250mM，例如250mM-l.5M，例如500mM-l.0M。任選地，pH保持在ρΗ5.0-10.0，例如5.5-8.5，例如ρΗ6.5-7.5。洗脫梯度可以是線性的或非連續(xù)的。
[0112]在一些實施方式中，在ρΗ6_8的pH下用線性梯度洗脫目標(biāo)分子至約250mM磷酸鈉。
[0113]在一些實施方式中，在洗脫步驟中對至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的結(jié)合到固體支撐物的目標(biāo)分子(在結(jié)合-洗脫模式中)進行洗脫。
[0114]在一些實施方式中，從固體支承物上洗脫的目標(biāo)分子基本不含污染物。本文所用的“基本不含”表示污染物是純化的目標(biāo)分子的10%或更少，例如，低于3%,2%U%>0.1%,0.001%或完全不含污染物。
`[0115]無論絡(luò)合的污染物是否已經(jīng)從目標(biāo)分子中解離，都可通過生成層析運行的洗脫曲線并且觀察在純化過程中產(chǎn)生的峰的圖案和/或尺寸來確定絡(luò)合的污染物從目標(biāo)分子上解離的程度。另外，當(dāng)目標(biāo)分子或污染物是DNA或蛋白時，能通過測量A260 (在260nm處吸收；DNA)和/或A280(在280nm處吸收；蛋白)曲線來評估從目標(biāo)分子中去除污染物的情況。在一些實施方式中，能通過測量A260、A280和A365(在365nm處吸收；依沙吖啶)曲線來評估去除殺病毒劑的情況。例如，按照本文所述的實施例產(chǎn)生洗脫曲線。
[0116]本文所述的方法能夠以任意規(guī)模實施(例如，每批料從毫克級到千克級的生物產(chǎn)物)并且能夠用于任意用途，例如用于研究、診斷、治療或其它應(yīng)用。
[0117]任選的額外步驟
[0118]本發(fā)明可與其它純化方法結(jié)合以實現(xiàn)更高水平的純化。一個或多個層析步驟可采用任意方法，包括但不限于尺寸排阻、親和、陰離子交換、陽離子交換、蛋白A親和、疏水相互作用、固化金屬親和層析或混合模式層析。一個或多個沉淀步驟可包含鹽或PEG沉淀，或用有機酸、有機堿或其它試劑沉淀。其它分離步驟可包括但不限于結(jié)晶、液體:液體分配或膜過濾。在本文所述的本發(fā)明方法之前或之后，本發(fā)明也可與另外的殺病毒處理結(jié)合。
[0119]II1.目標(biāo)生物分子
[0120]本發(fā)明提供了從生物樣品中純化目標(biāo)生物分子的方法。在一些實施方式中，生物樣品中的目標(biāo)生物分子與一種或多種殺病毒劑絡(luò)合。
[0121]本發(fā)明的目標(biāo)生物分子包含任意可用磷灰石層析純化的生物分子。目標(biāo)生物分子的例子包括但不限于蛋白(例如，抗體、酶、生長調(diào)節(jié)劑、凝血因子和磷蛋白)、多核苷酸(例如，DNA和RNA)、病毒和病毒樣顆粒。
[0122]在一些實施方式中，目標(biāo)分子是抗體或抗體片段。在一些實施方式中，抗體是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。在本發(fā)明中使用的抗體制劑能包含來自天然、合成或重組來源的未純化或部分純化的抗體。未純化的抗體制劑能夠來自多個來源，包括但不限于血漿、血清、腹水、牛奶、植物提取物、細(xì)菌裂解液、酵母裂解液或陳化的(conditioned)細(xì)胞培養(yǎng)基。部分純化的制劑可以來自已經(jīng)用至少一種層析、沉淀、其它分離步驟或前述的任意組合處理的未純化的制劑。
[0123]本發(fā)明還特別關(guān)注對低pH敏感的蛋白的純化，低pH是一種減少病毒的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。許多重組蛋白(包括但不限于凝血因子，包括因子VIII和血管假性血友病因子，以及IgM抗體)是高度不穩(wěn)定的并且不能耐受低pH處理，因此是本發(fā)明方法的良好候選，并且尤其是其中的洗滌步驟包括第二抗病毒劑。此外，一些目標(biāo)蛋白或其它生物分子太大而無法支持通過過濾方法減少非包被的病毒，因為病毒的流體力學(xué)半徑與目標(biāo)生物分子相同。這些生物分子因此也是用于本發(fā)明方法中的良好候選。
[0124]IV.殺病毒劑
[0125]在一些實施方式中，提供了從生物樣品中去除殺病毒劑的方法。在一些實施方式中，所述方法用于解離一種或多種與目標(biāo)分子結(jié)合的殺病毒劑來增強目標(biāo)分子的純化。在一些實施方式中，殺病毒劑帶正電。在一些實施方式中，殺病毒劑是中性的(不帶電)。在一些實施方式中，殺病毒劑是聚乙烯亞胺(PEI)、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、亞甲藍或磷酸三(正丁基)酯(TNBP)。
`[0126]V.試劑盒
[0127]在另一種實施方式中，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明所述方法的試劑盒。試劑盒能夠任選地包括書面說明書或電子說明書(例如，在CD-ROM或DVD上)以及包裝材料。在一些實施方式中，試劑盒包括磷灰石層析支承物(例如，金屬陽離子衍生的或聚陽離子衍生的磷灰石)和殺病毒劑。在本文方法的內(nèi)容中所述的其它試劑也能夠任選地包含在試劑盒中。
[0128]V1.磷灰石層析
[0129]本發(fā)明提供了用磷灰石固體支承物從生物樣品中純化目標(biāo)分子的方法。各種磷灰石固體支承物是市售可得的，其中的任意支承物都能夠在本發(fā)明的實踐中應(yīng)用。這些包括但不限于羥基磷灰石和氟基磷灰石。市售可得的例子包括，但不限于陶瓷羥基磷灰石(CHT?)或陶瓷氟基磷灰石(CFT?)。在一些實施方式中，磷灰石固體支承物是柱。
[0130]在一些實施方式中，磷灰石選自羥基磷灰石CHT? I型，20微米；羥基磷灰石CHT?I型，40微米；羥基磷灰石CHT? I型，80微米；羥基磷灰石CHT? II型，20微米；羥基磷灰石CHT? II型，40微米；羥基磷灰石CHTtmII型，80微米；氟基磷灰石CFT? I型，40微米；和氟基磷灰石CFT? II型，40微米。
[0131]在一些實施方式中，將CHT?或CFT?裝填在柱中。在一些實施方式中，將CHT?或CFT?裝填在約5_內(nèi)徑和約50_高度的柱中，用來評估各種試劑和試劑組合對于目標(biāo)分子-殺病毒劑絡(luò)合物的解離和目標(biāo)分子從生物分子制劑中的洗脫特性的影響。在一些實施方式中，將CHT?或CFT?裝填在支持制備型應(yīng)用所要求的任意尺寸的柱中。在一些實施方式中，根據(jù)特定應(yīng)用的要求，柱直徑可以是從1cm到超過lm，并且柱高度可以是從5cm到超過30cm。技術(shù)人員能確定合適的柱尺寸。
[0132]金屬陽離子衍生的磷灰石
[0133]在一些實施方式中，天然羥基磷灰石和/或氟基磷灰石通過在不存在磷酸鹽的情況下暴露于可溶性金屬陽離子而被轉(zhuǎn)化為金屬陽離子衍生的形式，從而改變磷灰石支承物的選擇性。適于天然磷灰石的衍生的金屬陽離子的例子包括，但不限于鎂、鋅、鐵、鈣、鎳、鈷、錳、銅和鉻。
[0134]在一些實施方式中，衍生的磷灰石是鈣衍生的磷灰石。鈣衍生大大消除了磷灰石磷酸鹽基團，代之以二級的鈣基團。鈣衍生增加了磷灰石對于磷酸化的分子的親和力，從而增加了支承物的絡(luò)合物解離潛力并且增加了感興趣的目標(biāo)分子的有效純化。
[0135]將天然磷灰石轉(zhuǎn)化為金屬陽離子(例如，鈣)衍生的形式的方法是本領(lǐng)域已知的并且如US2009/0187005和US2009/0186396所述，其通過引用全文納入本文。簡單地說，用包含約2-5mM濃度的鈣鹽的溶液來平衡磷灰石固體支承物，這時存在一種或多種緩沖化合物來賦予充分的pH控制。在一些實施方式中，鈣鹽的存在濃度為約ImM-約lOOmM，約ImM-約50mM，約ImM-約20mM或約2mM_約10mM。緩沖化合物可包括但不限于MES、HEPES、BICINE、咪唑和Tris。在一些實施方式中，通過向磷灰石支承物施加約pH7的包含約20mMHEPES、約20mM MES和約5mM鈣的緩沖液來對磷灰石進行鈣衍生。
[0136]本發(fā)明的磷灰石層析支承物可以其金屬陽離子(例如，鈣)衍生的形式進行洗脫，或者在洗脫之前可以其天然(例如，未衍生的)形式儲存。在一些實施方式中，金屬陽離子衍生的磷灰石通過暴露于磷酸鹽緩沖液而以其天然形式儲存，這時可通過常用于洗脫天然磷灰石支承物的方法進行洗脫。例如，鈣衍生的磷灰石可以在用磷酸鹽緩沖液洗滌后以天然磷灰石儲存。對于一些金屬陽離子衍生的磷灰石，衍生只是部分可逆的或不可逆的。在一些實施方式中，衍生的磷灰石(例如，鈣`衍生的磷灰石)通過向磷灰石支承物施加包括約10mM磷酸鹽的緩沖液而以其天然形式儲存。
[0137]聚陽離子衍生的磷灰石
[0138]在一些實施方式中，天然羥基磷灰石和/或氟基磷灰石通過在不存在磷酸鹽的情況下暴露于可溶型聚陽離子而被轉(zhuǎn)化為聚陽離子衍生的形式，從而改變磷灰石支承物的選擇性。適于天然磷灰石衍生的聚陽離子的例子包括，但不限于聚乙烯亞胺(PEI)和多胺如聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
[0139]在一些實施方式中，在轉(zhuǎn)化為聚陽離子衍生的形式之前，先將天然羥基磷灰石轉(zhuǎn)化為金屬陽離子衍生的磷灰石。這種轉(zhuǎn)化使得原本會因為高鹽洗滌而從天然或聚陽離子衍生的磷灰石上洗脫的蛋白保持結(jié)合在支承物上。
[0140]能夠使用將天然磷灰石轉(zhuǎn)化為聚陽離子衍生的形式的各種方法。通常，通過在不存在磷酸鹽的情況下，使磷灰石支承物與含有足夠量的聚陽離子的溶液接觸來產(chǎn)生聚陽離子衍生物，以去除磷灰石表面的磷酸根離子。例如，Y.Murakami, K.Sugo, M.Hirano,Τ.0kuyama, Talanta85 ；1298 (2011)描述了 PE1-羥基憐灰石衍生物。
[0141]磷灰石支承物的衍生通常包括在一定pH下使支承物與含有足夠量的聚陽離子的溶液簡單接觸，其中聚陽離子對于結(jié)合到磷灰石支承物具有足夠的陽離子性。例如，在一些實施方式中，將PEI或另一種聚陽離子滴定至約6.5-7.0的pH并且任選地用緩沖液如50mM!fepes稀釋至0.1%-2%的濃度。在一些實施方式中，隨后用緩沖液(例如，50mM Hepes,pH7.0)洗滌固體支承物，然后用IOmM磷酸鹽平衡。
[0142]聚陽離子的濃度應(yīng)該足夠封閉磷灰石磷酸根上的足夠量的負(fù)電荷，使得陽離子殺病毒劑不會明顯地與聚陽離子衍生的磷灰石結(jié)合。例如通過加載DNA樣品(例如，在50mMHepes中0.lmg/mL鮭魚精DNA，pH7.0)并且將在磷酸鹽梯度中進行DNA洗脫時的磷酸鹽濃度與在天然(未衍生的)磷灰石支承物柱中的洗脫磷酸鹽濃度進行比較，能夠確認(rèn)成功的衍生。DNA大多在約250-300mM磷酸鹽條件下從天然CHT中洗脫，但是大多直到300-500mM才會形成聚陽離子修飾的磷灰石。一般生物樣品中的細(xì)胞蛋白雖然含有一些聚陽離子多肽，但不足以封閉足夠量的磷灰石磷酸根來用于本文所述的目的。
[0143]衍生溶液通常包含緩沖化合物來賦予充分的pH控制。理想地，在所用pH條件(例如，約PH6-7.5，或例如，約6.5-7.0)下緩沖液是帶正電或兩性離子的，以避免緩沖液與聚陽離子的可能相互作用。緩沖化合物可包括但不限于MES、HEPES、組氨酸、組胺和咪唑。
[0144]實施例
[0145]提供以下實施例用于說明而非限制本發(fā)明的權(quán)利要求。
[0146]以下的實施例描述了從IgM制劑中去除絡(luò)合的殺病毒劑。在本文所述的發(fā)現(xiàn)之前，在低磷酸鹽濃度存在下，IgM大多在高NaCl濃度下從天然形式的磷灰石上洗脫，從而限制(雖然不是阻止)了它們在磷灰石支承物上的純化。通過使用鈣衍生的或聚陽離子衍生的磷灰石，使得能在高NaCl濃度下保持IgM的保留率(retention),使得NaCl的使用不受限制。其它沒有明顯鈣親和力的鹽能相似地使用而不受限制，任選地包括但不限于離液鹽如胍、高氯酸鹽和硫氰酸鹽。這些鹽能與上述其它解離劑聯(lián)合使用，例如精氨酸和尿素。
[0147]實施例1
[0148]這個實施例描述了使用本發(fā)明的方法從包括IgM的樣品中去除聚陽離子和殺病毒劑PEI。
[0149]通過注入50mM Hepes, pH7 中 PE1-1300 的 1%溶液，用 PEI 對 CHT? I 型 40 微米柱進行衍生。用50mM Hepes, pH7平衡衍生的CHT?。樣品含有IgM加上0.01% PE1-1300。將樣品加載在平衡的、PE1-衍生的CHT?柱上并且用平衡緩沖液洗至基線。然后用50mMHepes, pH7中500mM精氨酸，2MNaCl洗滌柱。然后用平衡緩沖液洗滌柱以去除精氨酸和NaCl。用10個柱體積的線性梯度洗脫IgM至250mM磷酸鈉，pH7.0。然后用500mM磷酸鹽，PH7.0來清潔柱。在254和280nm UV下監(jiān)測實驗。如圖1所示，基本從柱上去除了 PEIjB洗滌中在321mL處的高254峰所示。IgM在344_346mL處洗脫并且254/280比率表明相對來說不存在PEI。DNA在350mL處洗脫，如升高的254峰所示。
[0150]實施例2
[0151]不使用本發(fā)明來重復(fù)實驗，這次沒有用PEI處理CHT?。如圖2的曲線2所示，在376mL處的254洗滌峰小得多，表明在精氨酸，NaCl洗滌期間，相對來說從柱上去除了很少的PEI。在約396mL處也存在大量的污染物峰，如高254峰所示。在約399mL處洗脫IgM，但是包括254處的高吸收，表明在IgM部分中存在污染物。在約408mL處的DNA峰明顯小于實施例1中的DNA峰，明顯推測出洗脫的IgM的DNA含量必然較高。[0152]實施例3
[0153]不使用本發(fā)明來重復(fù)實施例1的實驗，這次用PEI處理CHT?，但是沒有精氨酸/NaCl洗滌。如圖2的曲線3所示，在約429mL處的洗滌峰顯示較低的245吸收峰，表明從柱上去除了明顯更少的PEI。IgM在約434mL處洗脫，而DNA在約439mL處洗脫。
[0154]實施例4
[0155]這個實施例描述了用本發(fā)明的方法從包括IgM的樣品中去除殺病毒劑依沙吖啶。
[0156]如實施例1所述用PEI對CHT? II型40微米柱進行衍生。樣品包含IgM，其中用
0.00125% (曲線1)或0.00625% (曲線2)依沙吖啶處理來除去DNA。如實施例1所述，平衡PEI衍生的CHT?并且用平衡緩沖液洗至基線。用50mM Hepes, pH7中2M NaCl (但是不含精氨酸)洗滌柱。然后用平衡緩沖液洗滌柱以去除NaCl。洗脫IgM并且如實施例1所述清潔柱。在254、280和365nmUV下監(jiān)測實驗。在365nm處依沙吖啶強烈吸收。
[0157]如圖3所示(曲線1)，大多數(shù)的依沙吖啶沒有結(jié)合柱，并且剩余的在NaCl洗滌開始時被消除，約277-279mL處。在NaCl洗滌的峰處洗脫PEI，如在約280_281mL處升高的254峰所示。245/280比率和平坦的365吸收表明，在287mL處開始相對來說不存在依沙吖啶和PEI。在461mL處洗脫IgM。如圖4所示(曲線2)，用由0.00625%依沙吖啶處理的IgM得到相似的結(jié)果。
[0158]上述的實施例證明本發(fā)明的方法能夠去除與抗體絡(luò)合的殺病毒劑和DNA污染物，得到相對純化的抗體制劑。
[0159]應(yīng)理解，本文所述`的實施例和實施方式僅用于說明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解據(jù)此作出的各種修改或改變，且它們包括在本申請的主旨和權(quán)益以及所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用全文納入本文以用于所有目的。
【權(quán)利要求】
1.一種2階段病毒滅活方法，所述方法包含 在一定條件下用帶正電或中性的殺病毒劑孵育包含目標(biāo)分子的生物樣品以滅活所述樣品中可能存在的病毒； 隨后在一定條件下使所述目標(biāo)分子與磷灰石支承物接觸導(dǎo)致所述目標(biāo)生物分子與所述支承物結(jié)合，使得所述目標(biāo)生物分子與所述磷灰石結(jié)合并且大多數(shù)的殺病毒劑流過所述支承物； 用第一洗滌緩沖液洗滌結(jié)合所述目標(biāo)分子的支承物，其中所述第一洗滌緩沖液至少包含第二殺病毒劑，其中所述第二殺病毒劑的濃度足夠滅活可能存在的病毒，并且足夠解離所述帶正電或中性的殺病毒劑與所述目標(biāo)分子的絡(luò)合物，從而去除至少一些可能存在的殘留的殺病毒劑；以及 從所述支承物上洗脫所述目標(biāo)生物分子，使得所述目標(biāo)生物分子基本不含所述帶正電或中性的殺病毒劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述帶正電或中性的殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述洗滌和洗脫之間使所述支承物與第二洗滌緩沖液接觸。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，相比所述第一洗滌緩沖液，所述第二洗滌緩沖液具有較低的電導(dǎo)率 并且不含離液劑。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述磷灰石至少在接觸和洗滌期間是天然形式的。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述磷灰石至少在接觸和洗滌期間是金屬衍生的形式的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述金屬是二價或三價陽離子。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述金屬選自鈣、鐵和鋅。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述磷灰石至少在接觸和洗滌期間是聚陽離子衍生的形式的。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一洗滌緩沖液包含氯化鈉、精氨酸、鹽酸胍、尿素、表面活性劑或其組合。
13.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一洗滌緩沖液包含氯化鈉和尿素、氯化鈉和鹽酸胍、或氯化鈉和精氨酸。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二殺病毒劑是氯化鈉或離液劑。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述離液劑是精氨酸、胍或尿素。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一洗滌緩沖液包含足夠高的電導(dǎo)率和/或足夠量的離液劑以洗脫所述殺病毒劑同時基本不洗脫所述目標(biāo)生物分子。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子在pH4條件下是不穩(wěn)定的。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子是蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述蛋白是抗體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述抗體是IgG或IgM抗體。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫包括使所述支承物與包含磷酸鈉的溶液接觸。
22.—種從生物分子制劑中去除帶正電或中性的殺病毒劑的方法，所述方法包含 在一定條件下使包含所述目標(biāo)分子和殺病毒劑的生物分子制劑與磷灰石支承物接觸導(dǎo)致所述目標(biāo)生物分子與所述支承物結(jié)合，使得所述目標(biāo)生物分子與所述磷灰石結(jié)合并且大多數(shù)的所述殺病毒劑流過所述支承物；以及從所述支承物上洗脫所述目標(biāo)生物分子，使得所述目標(biāo)生物分子基本不含所述殺病毒劑。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在所述接觸步驟之后殘留的殺病毒劑與支承物上的所述目標(biāo)生物分子結(jié)合，并且所述方法還包括在所述接觸和洗脫之間用第一洗滌緩沖液洗滌所述支承物，從而洗脫至少大部分的所述殘留的殺病毒劑同時使得基本上所有的所述蛋白目標(biāo)保持結(jié)合在所述支承物上。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一洗滌緩沖液包含氯化鈉、精氨酸、鹽酸胍、尿素、表面活性劑或其組合。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一洗滌緩沖液包含氯化鈉和尿素、氯化鈉和鹽酸胍、或氯化鈉和精氨酸。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一洗滌緩沖液包含足夠高的電導(dǎo)率和/或足夠量的離液劑以洗脫所述殺病毒劑同時基本不洗脫所述目標(biāo)生物分子。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述洗滌和洗脫之間使所述支承物與相比所述第一洗滌緩沖液具有較低電導(dǎo)率并且不含離液劑的第二洗滌緩沖液接觸。
28.如權(quán)利要求22-27中任一項所述的方法，其特征在于，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
29.如權(quán)利要求22-28中任一項所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子是蛋白。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述蛋白是抗體。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述抗體是IgG或IgM抗體。
32.如權(quán)利要求22-31中任一項所述的方法，其特征在于，所述殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
33.如權(quán)利要求22-32中任一項所述的方法，其特征在于，在所述接觸之前或期間，使所述磷灰石與足量的聚陽離子接觸以封閉所述磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得所述殺病毒劑基本不與所述磷灰石支承物結(jié)合。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
35.如權(quán)利要求22-32中任一項所述的方法，其特征在于，在所述接觸之前或期間，使所述磷灰石與足量的二價或三價陽離子接觸以封閉所述磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得所述殺病毒劑基本不與所述磷灰石支承物結(jié)合。
36.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述二價陽離子或三價陽離子選自鈣、鐵和鋅。
37.如權(quán)利要求22-36中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫包含使所述支承物與包含磷酸鈉的溶液接觸。
38.如權(quán)利要求22-37中任一項所述的方法，其特征在于，所述接觸以及任選地洗滌的條件不包含會破壞所述殺病毒劑與所述目標(biāo)生物分子之間結(jié)合的去污劑或疏水分子。
39.一種與目標(biāo)生物分子和帶正電或中性的殺病毒劑接觸的磷灰石層析支承物。
40.如權(quán)利要求39所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子與所述磷灰石層析支承物結(jié)合。
41.如權(quán)利要求39-40中任一項所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述磷灰石層析支承物還與足量的聚陽離子接觸以封閉所述磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得所述殺病毒劑基本不與所述磷灰石支承物結(jié)合。
42.如權(quán)利要求41所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
43.如權(quán)利要求39-40中任一項所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述磷灰石還與足量的二價或三價陽離子接觸以封閉所述磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷，使得所述殺病毒劑基本不與所述磷灰石支承物結(jié)合。
44.如權(quán)利要求43所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述二價陽離子或三價陽離子選自鈣、鐵和鋅。
45.如權(quán)利要求39-44中任一項所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
46.如權(quán)利要求39-45中任一項所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子是蛋白。
47.如權(quán)利要求46所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述蛋白是抗體。
48.如權(quán)利要求47所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述抗體是1gG或1gM抗體。
49.如權(quán)利要求39-40中任一項所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述磷灰石層析支承物不包含會破壞所述殺病毒劑與目標(biāo)生物分子結(jié)合的去污劑或疏水分子。
50.如權(quán)利要求39所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
51.一種聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物。
52.如權(quán)利要求51所述的聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物，其特征在于，目標(biāo)生物分子與所述磷灰石層析支承物結(jié)合。
53.如權(quán)利要求51所述的聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物，其特征在于，所述聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
54.如權(quán)利要求51所述的聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物，其特征在于，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
55.如權(quán)利要求40所述的聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子是蛋白。
56.如權(quán)利要求46所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述蛋白是抗體。
57.如權(quán)利要求56所述的磷灰石層析支承物，其特征在于，所述抗體是IgG或IgM抗體。
58.—種純化樣品中的生物分子的方法，所述方法包含 使所述樣品與如權(quán)利要求51所述的聚陽離子衍生的磷灰石固體支承物接觸；以及 純化目標(biāo)生物分子。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子與所述固體支承物結(jié)合并且隨后洗脫，任選地之后洗滌所述支承物，從而從所述樣品中去除污染物。
60.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)分子流過所述固體支承物同時來自所述樣品的至少一些污染物與所述固體支承物結(jié)合。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
62.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
63.如權(quán)力要求58所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)生物分子是蛋白。
64.如權(quán)利要求58所述的方法，其特征在于，所述蛋白是抗體。
65.如權(quán)利要求64所述的方法,其特征在于，所述抗體是IgG或IgM抗體。
66.—種試劑盒，所述試劑盒包括: (i)磷灰石層析支承物，和 (?)帶正電或中性的殺病毒劑。
67.如權(quán)利要求66所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含能夠封閉所述磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷使得所述殺病毒劑基本不與所述磷灰石支承物結(jié)合的聚陽離子。
68.如權(quán)利要求67所述的試劑盒，其特征在于，所述聚陽離子選自聚乙烯亞胺、聚乙醇胺、聚賴氨酸、聚精氨酸和聚烯丙胺。
69.如權(quán)利要求66所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含能夠封閉所述磷灰石內(nèi)的磷酸根部分的負(fù)電荷使得所述殺病毒劑基本不與所述磷灰石支承物結(jié)合的二價或三價陽離子。
70.如權(quán)利要求69所述的試劑盒，其特征在于，所述二價陽離子或三價陽離子選自鈣、鐵和鋅。
71.如權(quán)利要求66-70中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述磷灰石是羥基磷灰石或氟基磷灰石。
72.如權(quán)利要求66-71中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述殺病毒劑選自聚乙烯亞胺、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯銨、磷酸三(正丁基)酯和亞甲藍。
【文檔編號】C07K1/00GK103814048SQ201280045597
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月20日
【發(fā)明者】P·S·加農(nóng) 申請人:生物輻射實驗室股份有限公司