一種布舍瑞林的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種布舍瑞林的純化方法。具體而言，所述方法包括：以體積比5%—30%的甲醇水溶液溶解粗肽；將粗肽溶液進行梯度洗脫純化，以體積比0.1%—0.4%的硫酸和體積比0.1%—0.4%高氯酸的水溶液用三乙胺調pH值5.5—6.5后的溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B%：10%—40%洗脫；在十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱上采用色譜法將梯度洗脫后的樣品轉鹽和脫鹽，以0.1-0.6%（w/v）醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B%為3%—10%的梯度或等度沖洗15-30分鐘后，然后用醋酸水溶液乙腈體系洗脫。
【專利說明】一種布舍瑞林的純化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種布舍瑞林的純化方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種操作簡單、高收率、純度高、有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的布舍瑞林的純化方法。
【背景技術】
[0002]布舍瑞林是一種化學合成的由9個氨基酸組成的多肽，為天然促性腺激素釋放激素的類似物。具體地，布舍瑞林為天然促性腺激素釋放激素氨基酸序列第6位的甘氨酸被D-絲氨酸取代，10位的甘氨酰胺被乙酰胺(ethylamide)替換后得到的產(chǎn)物，其作用與天然促性腺激素釋放激素相比大大增強，其對黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，放的影響是促性腺激素釋放激素(LHRH)的20-170倍。主要用于晚期前列腺癌(D期)的姑息療法(緩解無法治愈患者的疼痛和癥狀)。
[0003]目前關于布舍瑞林的文獻主要為合成方面的，涉及到純化方面的很少。中國申請CN201010039548.9是采用反相色譜純化布舍瑞林，但其得到的產(chǎn)品純度不高，僅有98%左右，單個雜質也有1.46%，不能滿足藥品申報的要求。
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、高收率、純度高、有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的布舍瑞林的純化方法。本發(fā)明產(chǎn)品的純度可達99.0%以上，單個雜質不大于0.1%，純化收率可達80%以上。且可以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，單批次產(chǎn)量可達200克以上。可大幅提高產(chǎn)品的質量和降低成本。

【發(fā)明內容】

[0005]為實現(xiàn)上述目`的，綜合考慮布舍瑞林本身的性質，本發(fā)明提供了一種布舍瑞林的純化方法，包括以下步驟:
[0006]一以體積比5% — 30%的甲醇的水溶液溶解粗肽，得到粗肽溶液；
[0007]一將所得粗肽溶液進行色譜法梯度洗脫純化，以體積比0.1% — 0.4%的硫酸和體積比0.1% — 0.4%高氯酸的水溶液用三乙胺調pH值5.5—6.5后的溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%:10% — 40%洗脫，收集純化的布舍瑞林硫酸鹽溶液；
[0008]一用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱上采用反相高效液相色譜法將梯度洗脫后的樣品轉鹽和脫鹽，以0.1~0.6%(w/v)的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%:3%~10%梯度或等度沖洗15~30分鐘后。然后用醋酸水溶液乙腈體系脫鹽處理。
[0009]具體而言，本發(fā)明提出了一種布舍瑞林醋酸鹽的純化方法，純度高且收率好，達到產(chǎn)業(yè)化要求。
[0010]在一個實施方案中，本發(fā)明提供的一種布舍瑞林醋酸鹽的純化方法包括以下步驟:
[0011]步驟1):以5— 30體積％的甲醇的水溶液按照濃度20g/L — 50g/L溶解粗肽，用水將粗肽溶液中甲醇的體積比例稀釋到20%以下。步驟1)下文也表述為“前處理”。
[0012]所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未經(jīng)過精制處理的布舍瑞林粗肽或者純度不能滿足藥用的布舍瑞林，粗肽中布舍瑞林的純度在20%以上，采用例如中國申請CN201010039548.9的方法較難實現(xiàn)該濃度產(chǎn)品的高純度純化。
[0013]“粗肽溶液”是指粗肽經(jīng)過前處理后所得到的溶液，所使用的水為純凈水，并符合注射用水標準，優(yōu)選超純水；所使用的醋酸為分析純的冰醋酸，本發(fā)明的“乙腈”的純度級別優(yōu)選色譜純。
[0014]選擇體積比5% — 30%的甲醇水溶液混合溶劑系統(tǒng)是通過對比試驗考慮實際生產(chǎn)過程的操作方便得出的，不在該濃度的溶劑的溶解能力會變低，導致溶解樣品所需的溶解體積過大，不利于反相色譜的處理(會導致體積過載，純化效率低)。
[0015]將制備的粗肽的濃度控制在20g/L — 50g/L有利于純化效率，高于50g/L會導致后續(xù)的反相色譜純化時不掛色譜柱，低于20g/L會使純化效率低下。
[0016]用水將所得粗肽溶液中的甲醇的體積比例稀釋到20%以下，當甲醇的比例高于20%此范圍的溶劑會導致后續(xù)的反相色譜純化時不掛色譜柱，以至于反相色譜純化無法進行。
[0017] 步驟2):將所得粗肽溶液進行色譜法梯度洗脫純化，以0.1% — 0.4%的硫酸和
0.1% — 0.4%高氯酸水溶液(體積比，用三乙胺調pH值5.5—6.5，優(yōu)選6.0)為A相，乙腈為B相，梯度:B%:10% — 40%，收集純化的布舍瑞林硫酸鹽溶液；步驟2)下文也表述為“純化”。
[0018]選擇0.1%一0.4%的硫酸和0.1%一0.4%聞氯酸兩種酸用氨水調節(jié)后生成兩種緩沖鹽的A相是優(yōu)化選擇的結果，與中國申請CN200910126363采用0.1%TFA的方法相比具有更好的分離效果。流動相A中緩沖鹽的濃度低于所限定的范圍使流動相緩沖能力變弱，導致樣品不能完全洗脫且譜圖變形達不到分離的要求。大于此范圍，流動相A中緩沖鹽的濃度過高對色譜系統(tǒng)損傷較大，甚至會部分產(chǎn)生鹽析，導致無法純化。另外，流動相A的pH值也非常重要，不在5.5—6.5范圍達不到分離效果。
[0019]洗脫系統(tǒng)中A相和B相的比例是通過大量實驗篩優(yōu)選得到的，B%低于10%樣品不能沖洗下色譜柱，B%大于40%樣品會提前沖出，都不能進行純化。采用該溶劑系統(tǒng)純化，分離效果較現(xiàn)有技術會大幅提高，本步的收率90%左右，所得樣品的純度在99%以上，大大提高收率和純度，降低了生產(chǎn)成本。
[0020]所述步驟2)中所使用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度優(yōu)選為:5cmX 25cm, lOcmX 25cm、15cmX 25cm 或 30cmX 25cm。
[0021]步驟3)采用反相高效液相色譜法將布舍瑞林的硫酸鹽轉成醋酸鹽。步驟3)下文也表述為“轉鹽”。
[0022]所述“反相高效液相色譜”的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，在一個優(yōu)選的實施方案中，轉鹽的方法包括:將步驟2)所得布舍瑞林硫酸鹽溶液上樣后，用以體積比為0.1~
0.6%的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%:3%~10%梯度或等度沖洗15~30分鐘后，含體積比3% —10%乙腈的醋酸銨溶液沖洗15 — 30分鐘，其中所用的醋酸銨溶液本身的濃度為0.1% — 0.6% (w/v)，優(yōu)選0.3% (w/v);然后用醋酸水溶液(A相)和乙腈(B相)體系洗脫，所述醋酸水溶液的濃度為0.05%—0.2% (w/v)，優(yōu)選為0.1% (w/v)。該洗脫步驟所采用的乙腈濃度梯度為B% (乙腈)40%-80%以上，收集布舍瑞林溶液，濃縮，冷凍干燥后得醋酸布舍瑞林醋酸鹽。
[0023]所述步驟3)中所使用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度優(yōu)選為:5cmX 25cm, lOcmX 25cm、15cmX 25cm 或 30cmX 25cm。
[0024]本發(fā)明提供的純化布舍瑞林方法操作可行、純度高(可達99.0%以上且最大單一雜質小于0.1%)、收率高(純化收率可達80%以上)，達到產(chǎn)業(yè)化要求(一批次可獲得400克以上的精妝)。
[0025]本發(fā)明采用反相色譜辦法進行純化處理，適用于純度在20%以上的粗肽樣品的純化，較中國申請CN200910126363具有很大的質量優(yōu)勢。本發(fā)明得到的布舍瑞林純度較高可達99.0%以上，單雜控制在不大于0.1%，醋酸根也能控制在歐洲藥典規(guī)定的3%~7%。本發(fā)明的純化方法大幅提高了產(chǎn)品的質量，且較現(xiàn)有技術的純化成本大大降低，收率也大幅提聞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為示出了布舍瑞林的純化色譜圖。
【具體實施方式】
[0027]參照以下實施例可以更好地理解本發(fā)明。但是，應理解，以下實施例僅用于舉例說明目的，而不應被理解為以任何方式限制本發(fā)明的保護范圍。
[0028]實施例
[0029]實施例1
[0030]1)前處理:用體積比5%的甲醇的水溶液按照20g/L的濃度溶解化學合成法得到的粗肽，攪拌使樣品完全溶解后用Φ 0.45 μ的偏氟濾膜過濾，收集濾液。用水將粗肽溶液中的甲醇的體積比例稀釋到10%以下備用。其中所述粗肽是采用常規(guī)方法(例如深圳翰宇藥業(yè)的專利CN201010256054.6中記載`的方法)制備。
[0031]2)純化:
[0032]純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:5cmX 25cm。流動相:A相:0.1%硫酸和0.4%高氯酸水溶液(v/v)，用氨水調pH值5.5 ；B相:乙腈，流速:50-100ml/分鐘，梯度:B%:10%~40% (每3分鐘升高1%)，60分鐘，檢測波長:280nm。進樣量為1.0-2.5g。
[0033]將色譜柱用體積比40~50%的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為1.0-2.5g。線性梯度洗脫60分鐘，收集目的峰(為最大峰30~35分鐘)，檢測其色譜純度，將純度大于95%以上的樣品合并后于水溫不超過35°C的條件下于旋轉蒸發(fā)儀上減壓旋蒸濃縮，濃縮至剩余約一半的體積后轉入鹽析純化步驟。
[0034]3)轉鹽:
[0035]色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:5cmX25cm。將色譜柱用體積比50%以上的乙腈醋酸溶液沖洗干凈后上樣，上樣量
1.0-2.5g，用B相為乙腈，A相為0.1% (w/v)的醋酸銨水溶液的色譜條件，按照B%為3% (體積比)的條件沖洗25-35分鐘，然后用B相為乙腈，A相為0.05%的鹽酸水溶液色譜條件，按照B%為3%的條件洗脫10分鐘后，換用B%為40%的條件洗脫，收集目的峰，將收集的布舍瑞林溶液于水溫不超過35°C條件下減壓旋蒸濃縮至約50-200mg/mL后轉至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于99.0%的醋酸布舍瑞林。[0036]實施例2
[0037]1)前處理:用體積比15%的甲醇水溶液按照30g/L的濃度溶解化學合成法獲得的粗肽，攪拌使樣品完全溶解后用Φ 0.45 μ的偏氟濾膜過濾，收集濾液。用水將粗肽溶液中的甲醇的體積比例稀釋到20%以下備用。
[0038]2)純化:
[0039]純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:10CmX25Cm。流動相:A相:0.2%硫酸和0.3%高氯酸水溶液(v/v)，用氨水調pH值
6.0 ;B相:乙腈，流速:150-300ml/分鐘，梯度:B%:10%~40% (每3分鐘升高1%)，檢測波長:280nm。進樣量為 1.0-2.5g。
[0040]純化過程:將色譜柱用體積比50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為5-15g。線性梯度洗脫60分鐘，收集目的峰(為最大峰30-35分鐘)，檢測其色譜純度，將純度大于99%以上的合并后于水溫不超過35°C的條件下減壓旋蒸濃縮，濃縮至剩余約一半的體積后轉入轉鹽步驟。
[0041]3)轉鹽:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:10cmX25cm。將色譜柱用體積比50%以上的乙腈醋酸溶液沖洗干凈后上樣，上樣量10-25g，用B相為乙腈，A相為0.3%的醋酸銨水溶液的色譜條件，按照B%為5%的條件沖洗25-35分鐘，然后用B相為乙腈，A相為0.1%的醋酸水溶液的色譜條件，按照B%為5%的條件洗脫10分鐘后，換用含體積比40%乙腈的0.1%的醋酸水溶液洗脫，收集目的峰，將收集的布舍瑞林溶液于水溫不超過35°C條件下減壓旋蒸濃縮至約50-200mg/mL后轉至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于99.0%的醋酸布舍瑞林。
[0042]實施例3
[0043]1)前處理:用體積 比20%的甲醇水溶液按照40g/L的濃度溶解化學合成法獲得的粗肽，攪拌使樣品完全溶解后用Φ 0.45 μ的偏氟濾膜過濾，收集濾液。用水將粗肽溶液中的甲醇的體積比例稀釋到20%以下備用。
[0044]2)純化:
[0045]純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:15CmX25Cm。流動相:A相:0.3%硫酸和0.2%高氯酸水溶液(v/v)，用氨水調pH值
6.5 ;B相:乙腈，流速:300-600ml/分鐘，梯度:B%:10%~40% (每3分鐘升高1%)，檢測波長:280nm。進樣量為15_30g。
[0046]純化過程:將色譜柱用體積比50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為15-30g。線性梯度洗脫60分鐘，收集目的峰(為最大峰30-35分鐘)，檢測其色譜純度，將純度大于99%以上的合并后于水溫不超過35°C的條件下減壓旋蒸濃縮，濃縮至剩余約一半的體積后轉入轉鹽步驟。
[0047]3)轉鹽:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:15cmX25cm。將色譜柱用體積比50%以上的乙腈醋酸溶液沖洗干凈后上樣，上樣量10-25g，用B相為乙腈，A相為0.4%的醋酸銨水溶液的色譜條件，按照B相為5% (體積比)的條件沖洗25-35分鐘，然后用B相為乙腈，A相為0.1%的醋酸水溶液的色譜條件，按照B相為5%的條件洗脫10分鐘后，換用含體積比40%乙腈的0.1%的醋酸水溶液洗脫，收集目的峰，將收集的布舍瑞林溶液于水溫不超過35°C條件下減壓旋蒸濃縮至約50-200mg/mL后轉至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于99.0%的醋酸布舍瑞林。
[0048]實施例4
[0049]1)前處理:用體積比30%的甲醇水溶液按照50g/L的濃度溶解化學合成法獲得的粗肽，攪拌使樣品完全溶解后用Φ 0.45 μ的偏氟濾膜過濾，收集濾液。用水將粗肽溶液中的甲醇的體積比例稀釋到30%以下備用。
[0050]2)純化:
[0051]純化條件:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:30CmX25Cm。流動相:A相:0.4%硫酸和0.1%高氯酸水溶液(v/v)，用氨水調pH值
6.5 ；B相:乙腈，流速:1500-4000ml/分鐘，梯度:B%:10%~40%(每3分鐘升高1%)，檢測波長:280nm。進樣量為15_30g。
[0052]純化過程:將色譜柱用體積比50%以上的乙腈沖洗干凈后平衡上樣，上樣量為50-120g。線性梯度洗脫60分鐘，收集目的峰(為最大峰30-35分鐘)，檢測其色譜純度，將純度大于99%以上的合并后于水溫不超過35°C的條件下減壓旋蒸濃縮，濃縮至剩余約一半的體積后轉入轉鹽步驟。
[0053]3)轉鹽:色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:30cmX25cm。將色譜柱用體積比50%以上的乙腈醋酸溶液沖洗干凈后上樣，上樣量50-120g，用B相為乙腈，A相為0.6%的醋酸銨水溶液的色譜條件，按照B%為8% (體積比)的條件沖洗25-35分鐘，然后用B相為乙腈，A相為0.1%的醋酸水溶液的色譜條件，按照B%為10%的條件洗脫10分鐘后，換用含體積比40%乙腈的0.2%的醋酸水溶液洗脫，收集目的峰，將收集的布舍瑞林溶液`于水溫不超過35°C條件下減壓旋蒸濃縮至約50-200mg/mL后轉至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于99.0%的醋酸布舍瑞林。
【權利要求】
1.一種布舍瑞林的純化方法，包括以下步驟:1)前處理:以體積比5%— 30%的甲醇水溶液按照濃度20g/L — 50g/L溶解粗肽，用水將粗肽溶液中甲醇的體積比例稀釋到10% — 30% ；2)純化:將步驟1)所得粗肽溶液進行梯度洗脫純化，以0.1% — 0.4%的硫酸和0.1%—0.4%高氯酸水溶液用三乙胺調pH值5.5—6.5后為A相，乙腈為B相，梯度:B%:10% — 40%，收集純化的布舍瑞林硫酸鹽； 3)轉鹽:用反相高效液相色譜法洗脫步驟2)所得布舍瑞林硫酸鹽，以0.1%-0.6%的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度:B%為3% —10%的梯度或等度沖洗15—30分鐘；然后用醋酸水溶液乙腈體系洗脫，所述醋酸水溶液的濃度為0.05% — 0.2%，該洗脫步驟所采用的乙腈濃度為40%以上，收集布舍瑞林溶液，濃縮，冷凍干燥后得醋酸布舍瑞林。
2.權利要求1所述的方法，其中所述步驟2)中A相的pH為6.0。
3.權利要求1或2所述的方法，其中所述步驟2)中的色譜法使用色譜柱，其直徑和長度為 5cmX 25cm, lOcmX 25cm、15cmX 25cm 或 30cmX 25cm。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述步驟2)中的色譜法使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相。
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述步驟3)中的色譜法使用色譜柱，其直徑和長度為 5cmX 25cm, lOcmX 25cm、15cmX 25cm 或 30cmX 25cm。
6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述步驟3)中的色譜法使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相。
7.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述步驟3)中醋酸銨溶液為0.3%。
8.權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述步驟4)中所述醋酸水溶液的濃度為.0.1%。
【文檔編號】C07K1/20GK103694319SQ201310717255
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權日:2013年12月20日
【發(fā)明者】趙忠衛(wèi), 劉建, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司