一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法，主要是采用低能離子束注入技術(shù)對(duì)黃芩毛狀根進(jìn)行處理，并將處理后的黃芩毛狀根作為種子，利用三級(jí)培養(yǎng)法進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定其黃芩苷含量，結(jié)果表明經(jīng)低能離子誘變的毛狀根相比于對(duì)照組，具有生長(zhǎng)速度快、生物合成黃芩苷能力強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，黃芩毛狀根生長(zhǎng)至45天，其毛狀根生物量及其黃芩苷含量分別達(dá)到16.57g/L和28.3%，與未經(jīng)低能離子注入的黃芩毛狀根生物量及其黃芩苷含量13.28g/L和21.01%相比，分別提高了24.77%和35.03%。
【專利說明】一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃芩是常用藥材品種，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。其主要有效成分黃芩苷和黃芩素具有顯著的解熱、抑菌、鎮(zhèn)靜、降壓等作用，因此以黃芩為原料的中藥有效成分提取廠家紛紛崛起，加之各種黃芩成藥產(chǎn)品的廣泛開發(fā)，特別是雙黃連、銀黃系列，黃芩的年銷量急劇增加。加上近年來國(guó)家出臺(tái)了一系列保護(hù)野生資源的政策，致使可用野生黃芩資源日漸萎縮，而家種黃芩的種植面積也因價(jià)格和經(jīng)濟(jì)利益的因素得不到明顯的擴(kuò)大，并且家種黃芩存在藥殘風(fēng)險(xiǎn)。這些因素導(dǎo)致了黃芩藥材出現(xiàn)緊缺、供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。因此，亟需開發(fā)出一條新的、行之有效的黃芩藥材及有效成分藥源新途徑。而在眾多的應(yīng)對(duì)措施中，黃芩毛狀根的培養(yǎng)及有效成分積累和代謝調(diào)控越來越受到人們的關(guān)注，并且其在生產(chǎn)周期、有效成分積累和農(nóng)藥激素殘留等方面顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
[0003]上世紀(jì)80年代以后，隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)毛狀根的研究十分迅速，除了探求外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的機(jī)制和植物激素的生理效應(yīng)外，應(yīng)用毛狀根生物技術(shù)誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的形成與生物轉(zhuǎn)化等研究也有很大發(fā)展，這一生物技術(shù)為植物有效成分的大量生產(chǎn)提供了新的途徑，越來越引起人們的重視。到20世紀(jì)末，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已建立了分屬于31個(gè)科的100余種植物的毛狀根培養(yǎng)體系，并進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和調(diào)控，包括苷類、生物堿、醌類、芳香油、酚類、黃酮等多種天然產(chǎn)物。毛狀根培養(yǎng)技術(shù)已被認(rèn)為是生產(chǎn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的一條重要途徑，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。Nishikawa等將發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834含有 的Ri質(zhì)粒中的T-DNA片段整合到黃芩愈傷組織，誘導(dǎo)出毛狀根，進(jìn)行黃芩的毛狀根培養(yǎng)，從而提高黃芩的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。而國(guó)內(nèi)對(duì)黃芩毛狀根的培養(yǎng)研究工作開展的相對(duì)較晚。2006年，齊香君等利用激素誘導(dǎo)黃芩無菌苗外植體(帶節(jié)莖段)，并通過發(fā)根農(nóng)桿菌(1.2556、A49615和A4野生型)誘導(dǎo)得到黃芩毛狀根，經(jīng)過培養(yǎng)條件優(yōu)化采用2L鼓泡式反應(yīng)器對(duì)黃芩毛狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)做了初步的嘗試，發(fā)現(xiàn)毛狀根生長(zhǎng)量為14.9g/L，黃芩苷含量為5.16%、產(chǎn)量為0.77g/L，其生長(zhǎng)量略高于搖瓶培養(yǎng)，黃芩苷含量偏低。2009年李雅等建立了三級(jí)黃芩毛狀根的培養(yǎng)體系，毛狀根的生物量為11.52g/L，黃芩苷含量為20.99%。
[0004]目前，已有少數(shù)單位正在利用低能離子束生物技術(shù)對(duì)藥用植物育種工作展開研究，并已取得明顯成效，新疆大學(xué)離子束生物工程實(shí)驗(yàn)室對(duì)低能離子注入麻黃種子生物效應(yīng)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明:離子注入對(duì)麻黃種子的生長(zhǎng)起良好的生物效應(yīng)；內(nèi)蒙古大學(xué)離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室正開展以藥用植物為對(duì)象，用離子束生物技術(shù)進(jìn)行品種改良的系列研究。但是目前，尚沒有關(guān)于將離子束用于毛狀根品質(zhì)改良的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0007]I)黃芩毛狀根預(yù)培養(yǎng)
[0008]將黃芩毛狀根以5~10g/L的接種量接種于改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后于25~28°C避光培養(yǎng)4~6天，所述改良的MS液體培養(yǎng)基為添加有0.4~0.6mmol/L苯丙氨酸以及60~70g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基；
[0009]2)毛狀根的處理
[0010]將150~200mg經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的黃芩毛狀根在無菌條件下剪切成1.5~2cm的毛狀根片段，將毛狀根片段放置于無菌的培養(yǎng)皿中，然后用無菌風(fēng)將培養(yǎng)皿中的毛狀根片段吹干，然后將培養(yǎng)皿放入離子注入機(jī)靶室中對(duì)毛狀根片段進(jìn)行低能離子束注入；
[0011]3)以經(jīng)過低能離子束注入后的毛狀根片段為黃芩毛狀根種子，對(duì)黃芩毛狀根種子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0012]所述低能離子束注入的條件為:注入離子為N+，注入劑量為2.5X IO16~
3.5X1016ions/cm2，注入能量為15~25KeV，脈沖時(shí)間為5~10s，間隔時(shí)間為5~10s。
[0013]所述擴(kuò)大培養(yǎng)具體包括以下步驟:
[0014]I)種子培養(yǎng)
[0015]種子培養(yǎng)包括一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)種子培養(yǎng)，一級(jí)種子培養(yǎng)是指將50~60mg經(jīng)過低能離子束注入后的毛狀根片段接種于100~200mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在100~200r/min、25~28°C條件下避光培養(yǎng)5~10天獲得毛狀根A，二級(jí)種子培養(yǎng)是指將150~200mg毛狀根A接種于300~500mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在100~200r/min、25~28°C條件下避光培養(yǎng)10~15天獲得毛狀根B ；
[0016]2)培養(yǎng)基二次補(bǔ)加培養(yǎng)
[0017]將毛狀根B以5~10g/L的接種量接種于500~1000mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在100~200r/min、25~28°C下避光培養(yǎng)，培養(yǎng)到10~20天補(bǔ)加300~500mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基，然后繼續(xù)在100~200r/min、25~28°C下避光培養(yǎng)10~20天后收獲毛狀根。
[0018]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0019]本發(fā)明運(yùn)用低能離子注入技術(shù)處理黃芩毛狀根，顯著提高了黃芩毛狀根培養(yǎng)中黃芩毛狀根的黃芩苷含量，具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、高效等優(yōu)點(diǎn)。
[0020]進(jìn)一步的，本發(fā)明將低能離子束注入處理后的黃芩毛狀根作為種子，采用三級(jí)黃芩毛狀根培養(yǎng)技術(shù)(一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)種子培養(yǎng)以及培養(yǎng)基二次補(bǔ)加培養(yǎng))進(jìn)行培養(yǎng)，黃芩毛狀根中黃芩苷的含量可提高到28.3%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為經(jīng)低能離子注入的黃芩毛狀根和對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線圖譜；
[0022]圖2為低能離子注入的黃芩毛狀根生物合成黃芩苷的遺傳穩(wěn)定性圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。[0024]本發(fā)明利用低能N+注入新鮮的黃芩毛狀根，并將其作為種子，進(jìn)行三級(jí)黃芩毛狀根培養(yǎng)，具體步驟如下:
[0025]I)預(yù)培養(yǎng):將本實(shí)驗(yàn)室已有的黃岑屬黃岑(Scutellaria baicalensis Georgi)的毛狀根(獲取方法依據(jù)ZL201110132376.4)在無菌條件下以5g/L的接種量接種于IOOmL改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后于26 °C避光培養(yǎng)6天，所述改良的MS液體培養(yǎng)基為在MS液體培養(yǎng)基(Murashige T and Skoog F (1962).Physiol Plantl5 (3): 473-497.)中添加 0.4mmol/L苯丙氨酸以及60g/L鹿糖；
[0026]2)經(jīng)過步驟I)后，在無菌操作臺(tái)上稱取150mg經(jīng)過上述預(yù)培養(yǎng)的毛狀根并剪切成1.5cm的毛狀根片段，將毛狀根片段均勻放置于無菌的培養(yǎng)皿(90mm)中并用無菌風(fēng)吹35min，使毛狀根片段表面干燥。然后將所述培養(yǎng)皿放置于離子注入機(jī)靶室內(nèi)并對(duì)培養(yǎng)皿內(nèi)的毛狀根片段進(jìn)行低能離子束注入，低能離子束注入的條件為:注入離子為N+，注入劑量為3.0X1016ions/cm2，注入能量為20KeV，脈沖時(shí)間為5s，間隔時(shí)間為10s。
[0027]3)以經(jīng)過低能離子束注入后的毛狀根片段為黃芩毛狀根種子，對(duì)黃芩毛狀根種子進(jìn)行三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng):a)—級(jí)種子培養(yǎng):在無菌條件下將50mg經(jīng)過低能離子束注入后的毛狀根片段接種于150mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在110r/min、26°C條件下避光培養(yǎng)5天獲得毛狀根A ;b)二級(jí)種子培養(yǎng):在無菌條件下將150mg毛狀根A接種于300mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在110r/min、26°C條件下避光培養(yǎng)10天獲得毛狀根B ;c)培養(yǎng)基二次補(bǔ)加培養(yǎng):在無菌條件下將毛狀根B以5g/L的接種量接種于500mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在110r/min、26°C下避光培養(yǎng)，培養(yǎng)15天后補(bǔ)加300mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基，然后在110r/min、26°C下繼續(xù)避光培養(yǎng)15天后收獲黃芩毛狀根，然后測(cè)定收獲的黃芩毛狀根的鮮重及其黃芩苷的含量。
[0028]分別將經(jīng)同一批次低能離子注入的毛狀根片段接種于15個(gè)裝有150mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基的搖瓶中，每個(gè)搖瓶中接種量為50mg毛狀根片段，分成5組，每組設(shè)3個(gè)搖瓶進(jìn)行平行分析，依據(jù)上述三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)并收獲毛狀根，然后根據(jù)毛狀根的生物量及其黃芩苷含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，參見表1，表1中對(duì)照組采用未經(jīng)低能離子注入的毛狀根片段。
[0029]黃芩毛狀根生物量(用鮮重表示)的測(cè)定:取出毛狀根，用布氏漏斗抽濾后，至無水滴下時(shí)稱重。
[0030]黃芩毛狀根生物量(用干重表示)的測(cè)定:取毛狀根，蒸餾水洗去表面培養(yǎng)基，于70°C下滅酶并烘至恒重，研磨后過60目篩得黃芩毛狀根干粉，稱重。
[0031]黃芩毛狀根的黃芩苷含量測(cè)定:精密稱取0.300g黃芩毛狀根干粉，加40mL70%乙醇回流提取3h后定容至IOOmL,然后過0.45 μ m微孔濾膜，得供試品溶液，結(jié)合用黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品制作的黃芩苷高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用高效液相色譜法(HPLC )測(cè)定供試品溶液中的黃芩苷含量。
[0032]黃芩毛狀根的黃芩苷含量=HPLC計(jì)算的黃芩苷含量/黃芩毛狀根干重X 100%
[0033]根據(jù)表1可知，本發(fā)明所提供的低能離子注入方法可以提高黃芩苷產(chǎn)量，盡管存在提高程度不同的情況，但與未經(jīng)低能離子注入的毛狀根相比，經(jīng)低能離子注入的毛狀根出現(xiàn)正突變結(jié)果的概率絕對(duì)值保證了該方法可以獲得預(yù)期效果，正突變率是依據(jù)毛狀根的生物量及其黃芩苷含量比對(duì)照組(未經(jīng)低能離子注入的毛狀根)的生物量及其黃芩苷含量大于5%而定。
[0034]表1毛狀根的生物量(鮮重，g/L)及其黃芩苷的含量統(tǒng)計(jì)
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)黃芩毛狀根預(yù)培養(yǎng) 將黃芩毛狀根以5~10g/L的接種量接種于改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后于25~28°C避光培養(yǎng)4~6天，所述改良的MS液體培養(yǎng)基為添加有0.4~0.6mmol/L苯丙氨酸以及60~70g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基； 2)毛狀根的處理 將150~200mg經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的黃岑毛狀根在無菌條件下剪切成1.5~2cm的毛狀根片段，將毛狀根片段放置于無菌的培養(yǎng)皿中，然后用無菌風(fēng)將培養(yǎng)皿中的毛狀根片段吹干，然后將培養(yǎng)皿放入離子注入機(jī)靶室中對(duì)毛狀根片段進(jìn)行低能離子束注入； 3)以經(jīng)過低能離子束注入后的毛狀根片段為黃芩毛狀根種子，對(duì)黃芩毛狀根種子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述低能離子束注入的條件為:注入離子為N+，注入劑量為2.5 X 1O16~3.5X 1016ionS/cm2，注入能量為15~25KeV，脈沖時(shí)間為5~IOs,間隔時(shí)間為5~10s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高黃芩毛狀根黃芩苷產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述擴(kuò)大培養(yǎng)具體包括以下步驟: 1)種子培養(yǎng) 種子培養(yǎng)包括一級(jí)種子培養(yǎng)和二級(jí)種子培養(yǎng)，一級(jí)種子培養(yǎng)是指將50~60mg經(jīng)過低能離子束注入后的毛狀根片段接種于100~200mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在100~200r/min、25~28°C條件下避光培養(yǎng)5~10天獲得毛狀根A，二級(jí)種子培養(yǎng)是指將150~200mg毛狀根A接種于300~500mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在100~200r/min、25~28°C條件下避光培養(yǎng)10~15天獲得毛狀根B ； 2)培養(yǎng)基二次補(bǔ)加培養(yǎng) 將毛狀根B以5~10g/L的接種量接種于500~1000mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基中，然后在100~200r/min、25~28°C下避光培養(yǎng)，培養(yǎng)到10~20天補(bǔ)加300~500mL所述改良的MS液體培養(yǎng)基，然后繼續(xù)在100~200r/min、25~28°C下避光培養(yǎng)10~20天后收獲毛狀根。
【文檔編號(hào)】C07H17/07GK103918550SQ201410143966
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】錢衛(wèi)東, 付云芳, 施春陽(yáng), 蔡長(zhǎng)龍, 齊香君 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)