專(zhuān)利名稱(chēng)：具有2′-醚基的核苷和寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及其中2′—OH被羥乙基或氟代烷基醚化的核苷類(lèi)似物，其制備方法，含有這些核苷的寡核苷酸，以及這些核苷用于制備分子中含相同或不同核苷單元的寡核苷酸的用途。
核苷和寡核苷酸都可作為抗病毒有效成分，并因?yàn)樗鼈兣c核酸(“反義”寡核苷酸)相互作用的能力和與此相關(guān)的生物活性，已引起人們的極大興趣；例如見(jiàn)Uhlman，E.，Peyman，A.，Chemical Reviews90543—548(1990)。為了得到具有新特性的核苷或改進(jìn)反義寡核苷酸與天然核酸的相互作用并提高它們對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性，對(duì)核苷(或寡核苷酸中的核苷單元)的糖殘基、已對(duì)寡核苷酸中核苷間的磷酸酯鍵進(jìn)行了各種修飾；例如見(jiàn)Marquez，V.E.，Lim，M.I.，Medicinal Re-search Reviews 61—40(1986)，Helene，C.Toulme，J.J.，Biochimica etBiophysica Acta 104999—125(1990)，Englisch，U.，Gauss，D.H.，Angewandte Chemie 103629—646(1991)，Matleucci，M.D.，Bischof-berger，N.，Annual Reports in Medicinal Chemistry 2687—296(1991)在Cook，P.D.，Anti—Cancer Drug Design 6585—607(1991)和WO91/06556中，描述了在糖的2′—OH上已被修飾的核苷。所述的這些修飾使核酸酶耐受性提高；烷基越長(zhǎng)，核酸酶耐受性越高。據(jù)觀察用短鏈烷基如甲基、乙基或丙基，結(jié)合親合力稍有提高，而用長(zhǎng)鏈則結(jié)合親合力大幅度下降。迄今為止還沒(méi)有過(guò)將以羥乙基或氟代烷基作為2′—OH的側(cè)鏈的核苷摻入到寡核苷酸中。令人驚奇地是，與使用等長(zhǎng)的未取代烷基相比，本發(fā)明的修飾提高了對(duì)互補(bǔ)的RNA的結(jié)合親合力。在公開(kāi)的現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上無(wú)法預(yù)計(jì)到該結(jié)果。與2′—OH修飾的寡核苷酸相似，本發(fā)明的化合物用標(biāo)記的核酸酶耐受性來(lái)區(qū)別。另外，包含本發(fā)明核苷的寡核苷酸顯示其細(xì)胞攝取率提高，并因此提高了生物利用度和體內(nèi)活性。
本發(fā)明涉及式I化合物 其中R1和R2互相獨(dú)立，各自為氫或保護(hù)基，或R1同上所定義，并且R2為形成含磷核苷酸橋基的殘基；B為嘌呤或嘧啶殘基或其類(lèi)似基團(tuán)；及R3為OH、F或(CF2)nCF3，其中n為0—7的數(shù)。
當(dāng)R3為OH時(shí)，該羥基可被R1和R2中定義的基團(tuán)保護(hù)。
優(yōu)選n為0。
優(yōu)選R1和R2為氫。
保護(hù)基和用這樣的保護(hù)基衍生羥基的方法在糖和核苷酸化學(xué)中是普遍已知的，并在下述文獻(xiàn)中有述例如Greene，B.T.的ProtectiveGroups in Organic Synthesis，Wiley Interscience，New York(1991)，Son-veaux，E.的Bioorganic Chemistry 14274—325(1986)或Beaucage，S.L，Iyer，R.的Tetrahedron 482223—2311(1992)。這類(lèi)保護(hù)基的例子有芐基、甲基芐基、二甲基芐基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基、溴芐基、2，4—二氯芐基；二苯基甲基、二(甲基苯基)甲基、二(二甲基苯基)甲基、二(甲氧苯基)甲基、二(二甲氧苯基)甲基、三苯甲基、三—4，4′，4″—叔丁基苯基甲基、二-對(duì)茴香基苯基甲基、三(甲基苯基)甲基、三(二甲基苯基)甲基、甲氧苯基(二苯基)甲基、二(甲氧苯基)苯基甲基、三(甲氧苯基)甲基、三(二甲氧苯基)甲基；三苯基甲硅烷基、烷基二苯基甲硅烷基、二烷基苯基甲硅烷基和三烷基甲硅烷基，其中烷基含1—20個(gè)，優(yōu)選1—12個(gè)，最優(yōu)選1—8個(gè)碳原子，如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三正丙基甲硅烷基、異丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、正辛基二甲基甲硅烷基、(1，1，2，2—四甲基乙基)—二甲基甲硅烷基；—(C1—C8烷基)2Si—O—Si(C1—C8烷基)2—，其中烷基為如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基；C2—C12—?；?，特別是C2—C8—?；缫阴；⒈；⒍□；?、戊酰基、己酰基、苯甲?；?、甲基苯甲?；?、甲氧基苯甲酰基、氯代苯甲酰基和溴代苯甲?；?；Rs1—SO2，其中Rs1為C1—C12烷基，特別是C1—C6烷基、C5—或C6—環(huán)烷基、苯基、芐基、C1—C12烷基苯基特別是C1—C4烷基苯基、或C1—C12—特別是C1—C4烷基芐基、或鹵代苯基或鹵代芐基，例如甲基—、乙基—、丙基—、丁基—、苯基—、芐基—、對(duì)溴苯基—、對(duì)甲氧苯基—及對(duì)甲基苯基—磺酰基；被F、Cl、Br、C1—C4烷氧基、三—(C1—C4烷基)甲硅烷基或被C1—C4烷基磺酰基取代或未取代的C1—C12—，優(yōu)選C1—C8—烷氧羰基，例如甲氧基—、乙氧基—、正丙氧基—、異丙氧基—、正丁氧基—、異丁氧基—或叔丁氧基—羰基、2—三甲基甲硅烷基乙氧基羰基、2—甲基磺?；已趸驶?、烯丙氧基羰基、或各自被烷氧羰基的上述取代基取代或未取代的苯氧基羰基或芐氧基羰基，例如甲基—或甲氧基—或氯—苯氧基羰基或—芐氧基羰基，及9—芴基甲氧羰基。當(dāng)R1和/或R2為烷基時(shí)，它可被F、Cl、Br、C1—C4烷氧基、甲氧基、氯苯氧基、甲氧苯氧基、芐氧基、甲氧芐氧基或被氯苯氧基取代。式I中R1和R2可為相同或不同的保護(hù)基。
特別優(yōu)選作為保護(hù)基的R1和R2為芐基、甲基芐基、二甲基芐基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基、鹵化芐基(特別是溴代芐基)；二苯基甲基、二(甲基苯基)甲基、二(二甲基苯基)甲基、二(甲氧苯基)甲基、二(甲氧苯基)(苯基)甲基、三苯基甲基、三—4，4′，4″—叔丁基苯基甲基、二—對(duì)茴香基苯基甲基、三(甲基苯基)甲基、三(二甲基苯基)甲基、三(甲氧苯基)甲基、三(二甲氧苯基)甲基；三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三正丙基甲硅烷基、異丙基—二甲基甲硅烷基、叔丁基—二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、正辛基—二甲基甲硅烷基、(1，1，2，2—四甲基乙基)—二甲基甲硅烷基、—(CH3)2Si—O—Si(CH3)2—、—(i—C3H7)2Si—O—Si(i—C3H7)2—；乙?；?、丙酰基、丁酰基、戊?；⒓乎；?、苯甲?；?、甲基苯甲酰基、甲氧基苯甲酰基、氯苯甲酰基和溴苯甲?；患谆?、乙基—、丙基—、丁基—、苯基—、芐基—、對(duì)溴苯基—、對(duì)甲氧苯基—和對(duì)甲基苯基—磺?；?；甲氧基—、乙氧基—、正或異丙氧基—或正或異或叔丁氧基羰基、或苯氧基羰基、芐氧基羰基、甲基—、或甲氧基—或氯—苯氧基羰基或—芐氧基羰基或9—芴基甲氧基羰基。
作為形成核苷酸橋基的含磷殘基的R2可為式P1或P2 其中Ya為氫、C1—C12烷基、C6—C12芳基、C7—C20芳烷基、C7—C20烷芳基、—ORb、-SRb、—NH2、伯氨基、仲氨基、O_M_或S_M_；Xa為氧或硫；Ra為氫、M_、C1—C12烷基、C2—C12鏈烯基、C6—C12芳基、或RaO—基團(tuán)為具有含1—3個(gè)N原子的5之環(huán)的N—雜芳基—N—基；Rb為氫、C1—C12烷基或C6—C12芳基；及M_為Na_、K_、Li_、NH4_或伯、仲、叔或季銨離子；Ya、Ra和Rb中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基被烷氧基、烷硫基、鹵原子、—CN、-NO2、苯基、硝基苯基或被鹵代苯基取代或未取代。
作為伯氨基，Ya優(yōu)選含1—12個(gè)碳原子、最優(yōu)選含1—6個(gè)碳原子，作為仲氨基，Ya優(yōu)選含2—12個(gè)碳原子，優(yōu)選含2—6個(gè)碳原子。
例如，伯氨基和仲氨基可為式RcRdN的殘基，其中Rc為H，或獨(dú)立地同Rd的定義，及Rd為C1—C20—，優(yōu)選C1—C12—，最優(yōu)選C1—C6—烷基，C1—C20—，優(yōu)選C1—C12—，最優(yōu)選C1—C6—氨基烷基，C1—C20—，優(yōu)選C1—C12—，最優(yōu)選C1—C6-羥基烷基；羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8個(gè)碳原子，烷基含1—6個(gè)，優(yōu)選1—4個(gè)碳原子；C2—C20—，優(yōu)選C2—C12，最優(yōu)選C2—C6—鏈烯基；苯基，單—或二—(C1—C4—烷基—或烷氧基)苯基、芐基、單—或二—(C1—C4烷基—或—烷氧基)芐基；或1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—C1—C6烷基，或Rc和Rd一起為四亞甲基或五亞甲基，3—氧雜—1，5—亞戊基，—CH2NRc—CH2CH2—或—CH2CH2NR19—CH2CH2—，其中Rc為H或C1—C4烷基。氨基烷基中的氨基可被一個(gè)或兩個(gè)C1—C4—烷基或C1—C4—羥烷基取代。羥烷基中的羥基可被C1—C4烷基醚化。
在上文M_的定義中Ya代表的伯、仲、叔和季銨離子應(yīng)理解為式RfRgRhRiN(+)的離子，其中Rf為C1—C20—、優(yōu)選C1—C12、最優(yōu)選C1—C6—烷基、—氨基烷基或—羥烷基；羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8個(gè)碳原子，烷基含1—6個(gè)、優(yōu)選1—4個(gè)碳原子；C2—C20—、優(yōu)選C2—C12、最優(yōu)選C2—C6—鏈烯基；苯基，單—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苯基，芐基，單—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)芐基；或1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—C1—C6烷基，及Rg、Rh和Ri各自相互獨(dú)立地為氫或如Rf的定義，或Rf和Rg一起為四亞甲基或五亞甲基、3—氧雜—1，5—亞戊基，—CH2NRc—CH2CH2—或—CH2CH2NRe—CH2CH2，其中Rc為H或C1—C4烷基，及Rh和Ri各自相互獨(dú)立地具有Rf的定義。
氨基烷基中的氨基可被一個(gè)或兩個(gè)C1—C4—烷基或—羥烷基所取代。羥烷基中的羥基可被C1—C4烷基醚化。
羧基烷基的例子有羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基的例子為以上羧基烷基被甲基或乙基酯化。鏈烯基的例子有烯丙基，丁—1—烯—3—基或—4—基，或—3—或—4—烯—1—基或—2—基，己—3—或—4—或—5—烯—1—基或—2—基。烷基—和烷氧基—苯基和—芐基的例子有甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基芐基、二甲基芐基、乙基芐基、二乙基芐基、甲氧苯基、二甲氧苯基和乙氧苯基、二乙氧苯基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基、乙氧基芐基、二乙氧基芐基。咪唑基烷基(其中烷基優(yōu)選含2—4個(gè)碳原子)的例子有1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—乙基或—正丙基或—正丁基。R19優(yōu)選為H、甲基或乙基。
伯氨基和仲氨基的優(yōu)選實(shí)例為甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、二異丙基、單—或二—(1—羥基乙—2—基)—、苯基—和芐基—氨基，乙酰氨基和苯甲酰氨基，還有哌啶基、哌嗪基和嗎啉基。
伯和仲銨的優(yōu)選實(shí)例為甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、二異丙基—、單—或二—(1—羥基—乙—2—基)—、苯基—和芐基—銨。
作為烷基的Ya、Ra和Rb的實(shí)例為甲基、乙基以及丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基的異構(gòu)體；作為芳基的Ya、Ra和Rb的實(shí)例為苯基和萘基；作為鏈烯基的Ra的實(shí)例為烯丙基和(C1—C4烷基)CH＝CH—CH2—；作為芳烷基Ya的實(shí)例為苯基Cnh2n—，其中n為1—6的數(shù)，特別是芐基；作為烷芳基的Ya的實(shí)例為單—、二—或三—(C1—C4—烷基)苯基。優(yōu)選的取代基為氯、溴、甲氧基、—NO2、—CN、2，4—二氯苯基和4—硝基苯基。Rb的實(shí)例為2，2，2—三氯乙基、4—氯苯基、2—氯苯基和2，4—二氯苯基；及RbO—作為N—雜芳基的例子為吡咯—N—基、三唑—N—基和苯并三唑—N—基。
特別優(yōu)選Ra為β—氰基乙基和Ya為二(異丙基氨基)。
當(dāng)B為嘌呤殘基或其類(lèi)似物時(shí)，它可為式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe或Hf的殘基； 其中Rb1為H、Cl、Br、OH或—O—C1—C12烷基，及Rb2、Rb3和Rb5各自相互獨(dú)立地為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮雜環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1—C12烷基，羥基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，芐氧基或C1—C12烷硫基，被保護(hù)基取代或未取代的羥基和氨基，苯基，芐基，C1—C20伯氨基或C2—C30仲氨基，Rb4為氫、CN或—C≡C—Rb7，及Rb6和Rb7為氫或C1—C4烷基。
以上已提及了適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基。優(yōu)選的保護(hù)基為C1—C8?；?，如乙酰基、丙?；?、丁酰基和苯甲?；?。Rb6優(yōu)選為H或甲基。
伯氨基優(yōu)選含1—12個(gè)碳原子，最優(yōu)選含1—6個(gè)碳原子，仲氨基優(yōu)選含2—12個(gè)碳原子，最優(yōu)選含2—6個(gè)碳原子。
優(yōu)選含1—6個(gè)碳原子的烷基、烷氧基、烷硫基、羥烷基和氨基烷基的一些實(shí)例有甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基的異構(gòu)體，及相應(yīng)的烷氧基、烷硫基、羥烷基和氨基烷基。烷基、烷氧基、烷硫基、羥烷基和氨基烷基最優(yōu)選含1—4個(gè)碳原子。優(yōu)選的烷基、烷氧基、烷硫基、羥烷基和氨基烷基為甲基、乙基、正和異丙基、正、異和叔丁基、甲氧基、乙氧基、甲硫基和乙硫基、氨基甲基、氨基乙基、羥甲基和羥乙基。
例如，伯氨基和仲氨基可為式Ra1Ra2N的殘基，其中Ra1為H或獨(dú)立地為Ra2的定義，及Ra2為C1—C20、優(yōu)選C1—C12—、最優(yōu)選C1—C6—烷基、—氨基烷基或—羥烷基；羧烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8個(gè)碳原子，烷基含1—6個(gè)、優(yōu)選1—4個(gè)碳原子；C2—C20、優(yōu)選C2—C12、最優(yōu)選C2—C6—鏈烯基，苯基，單—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苯基、芐基、單—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)芐基；或1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—C1—C6—烷基，或Ra1和Ra2一起為四亞甲基或五亞甲基，3—氧雜—1，5—亞戊基，—CH2—NRa3—CH2CH2—或—CH2CH2NRa3—CH2CH2—其中Ra3為H或C1—C4烷基。
氨基烷基中的氨基可被一個(gè)或兩個(gè)C1—C4—烷基或—羥基烷基所取代。羥烷基中的羥基可被C1—C4烷基醚化。
以上已給出了烷基的實(shí)例。氨基烷基的實(shí)例為氨基甲基，氨基乙基，1—氨基—丙—2—基或—3—基，1—氨基—丁—2—基或—3—基或—4—基，N—甲基或N，N—二甲基—或N—乙基—或N，N—二乙基—或N—2—羥乙基—或N，N—二—2—羥乙基—氨基乙基或—氨基乙基或—氨基丙基或—氨基丁基。羥烷基的實(shí)例為羥甲基，1—羥—乙—2—基，1—羥—丙—2—或—3—基，1—羥—丁—2—基，—3—基或—4—基。羧烷基的實(shí)例為羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基的例子為被甲基或乙基酯化的上述羧烷基。鏈烯基的實(shí)例為烯丙基，丁—1—烯—3—基或—4—基，戊—3—或—4—烯—1—基或—2—基，己—3—或—4—或—5—烯—1—基或—2—基。烷基—和烷氧基—苯基和—芐基的實(shí)例為甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基芐基、二甲基芐基、乙基芐基、二乙基芐基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、二乙氧基苯基、甲氧基芐基、二甲氧基芐基、乙氧基芐基和二乙氧基芐基。其中烷基優(yōu)選含2—4個(gè)碳原子的咪唑基烷基的例子為1，2—、1，3—或1，4—咪唑基—乙基或—正丙基或—正丁基。Ra3優(yōu)選為H、甲基、或乙基。
伯氨基和仲氨基的優(yōu)選實(shí)例為甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、烯丙基—、單—或二—(1—羥基—乙—2—基)—、苯基—和芐基—氨基、乙酰氨基，異丁酰氨基和苯甲酰氨基。
優(yōu)選Rb1為氫。在另一優(yōu)選方案中Rb5為氫。另一優(yōu)選方案中Rb2和Rb3各自獨(dú)立地為H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲氨基、二甲氨基、苯甲酰氨基、異丁酰氨基、甲氧基、乙氧基或甲硫基。
嘌呤系列的類(lèi)似物的一些實(shí)例除嘌呤外，還有黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、N—甲基腺嘌呤、N—苯甲?；汆堰?、2—甲硫基腺嘌呤、2—氨基腺嘌呤、6—羥基嘌呤、2—氨基—6—氯嘌呤、2—氨基—6—甲硫基嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和N—異丁酰基鳥(niǎo)嘌呤。特別優(yōu)選腺嘌呤、2—氨基腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，及其堿基被保護(hù)的衍生物。
當(dāng)式I中B為嘧啶殘基時(shí)，它優(yōu)選為式III、IIIa、IIIb和IIIc的尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶或式III、IIIa、IIIb或IIIc殘基的二氫衍生物 其中Rb6為H或C1—C4烷基，及Rb8為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮雜環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1—C12烷基，羥基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，芐氧基或C1—C12烷硫基，被保護(hù)基取代或未取代的羥基和氨基，苯基，芐基，C1—C20伯氨基，C2—C30仲氨基，C1—C12鏈烯基或C1—C12炔基，及式IIIb中的NH2被C1—C6烷基、苯甲?；虮槐Ｗo(hù)基取代或未取代。
優(yōu)選，式III中Rb8為H，C1—C6—烷基或—羥烷基，C2—C6—鏈烯基或—炔基，F(xiàn)，Cl，Br，NH2，苯甲酰氨基，或單—或二—C1—C6烷基氨基。式IIIb和IIIc中Rb8優(yōu)選為H，C1—C6—烷基—或—烷氧基或—羥烷基，C2—C6—鏈烯基或—炔基，F(xiàn)，Cl、Br，NH2，苯甲酰氨基，或單—或二—C1—C6烷基氨基。
Rb6優(yōu)選為H或甲基。式III中Rb8優(yōu)選為H，F(xiàn)，Cl，Br，NH2，NHCH3，N(CH3)2，C1—C4烷基，C2—C4鏈烯基或C2—C4炔—1—基。式IIIb和IIIc中Rb8優(yōu)選為H，C1—C4烷基，特別是甲基，C2—C4鏈烯基，特別是乙烯基或C2—C4炔—1—基，特別是1—丙炔—1—基，或NH2，NHCH3或(CH3)2N。
嘧啶類(lèi)似物的一些實(shí)例為尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5—氟尿嘧啶、5—氯尿嘧啶、5—溴尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5—甲基胞嘧啶、5—丙炔胸腺嘧啶和5—丙炔胞嘧啶。
本發(fā)明還涉及式I化合物的制備方法 其中R1和R2各自相互獨(dú)立地為氫或保護(hù)基；B為嘌呤或嘧啶殘基或其類(lèi)似物；及(a)R3為OH，該方法包括式IVa化合物 其中R14和R15為相同或不同的保護(hù)基，B為嘌呤或嘧啶殘基或其類(lèi)似物，堿基B中的官能團(tuán)用保護(hù)基保護(hù)，在惰性溶劑中與式A化合物反應(yīng)A—CH2—COOR4(A)其中R4為C1—C4烷基，X為Cl、Br、I、甲苯磺?；狾—或甲磺?；狾；然后用NaBH4或LiAlH4還原酯官能團(tuán)，可以用R1中定義的基團(tuán)臨時(shí)保護(hù)生成的OH；(b)R3為F，該方法包括其中R3為OH的式I化合物與式B化合物反應(yīng) (c)R3為—(CF2)n—CF3，其中n為0—7的數(shù)，該方法包括式IVa化合物與式C、D或E的化合物反應(yīng)CH≡C-(CF2)n-CF3(C)CH2＝CH-(CF2)n-CF3(D) 然后將雙鍵或氯代雙鍵催化還原，可形成CH2CH2(CF)nCF3基團(tuán)；(d)R3為OH、F或—(CF2)n—CF3，該方法包括式IVb化合物 其中R14和R15如上所定義，A為離去基團(tuán)，優(yōu)選為烷氧基、酰氧基、甲磺?！狾、甲苯磺?！狾，最優(yōu)選OCH3、OCOCH3或苯甲酰氧基，按(a)到(c)中描述的方法之一在2′—OH上進(jìn)行取代，然后按本身已知的方法通過(guò)取代引入堿基B〔E.Lukevics，A.Zablocka，NucleosideSynthesis，Ellis Horwood，New York(1991)〕；及必要時(shí)脫去保護(hù)基R14和R15。
式IVa和IVb、A、B、C、D和E化合物為已知化合物，其中某些有市售，或可用已知方法或類(lèi)似方法制備。
惰性溶劑例如為烴、鹵代烴、烷基化羧酰胺和內(nèi)酰胺、醚、腈如乙腈、二烷基砜或亞砜或環(huán)狀砜和亞砜。
在方法步驟(a)—(d)中，反應(yīng)溫度為—50—200℃，優(yōu)選為0—90℃。
除B以外，反應(yīng)最好在堿存在下進(jìn)行，堿例如為堿金屬氫化物、醇化物、氫氧化物或碳酸鹽，三烷基胺或二氮雜雙環(huán)十一烯。
式I化合物的分離及純化按照本身為已知的方法進(jìn)行，如沉淀或結(jié)晶、過(guò)濾和色譜方法。
從式I化合物可能構(gòu)建這樣的寡核苷酸，由于它們與核酸的相互作用而具有有價(jià)值的生物活性，它們可用作藥物有效成分或診斷劑。
本發(fā)明還涉及式I化合物用于制備寡核苷酸的用途，其中該寡核苷酸含有相同或不同的式I化合物單體單元，但含有與其它天然或合成核苷單體單元結(jié)合的至少一個(gè)式I化合物單位單元，該寡核苷酸含有2—200個(gè)單體單元，優(yōu)選2—100個(gè)，更優(yōu)選2—50個(gè)，最優(yōu)選4—30個(gè)單體單元。優(yōu)選含相同或不同的式I化合物單體單元的寡核苷酸。還優(yōu)選另外含有衍生自D—核糖或2—脫氧核糖的合成或天然核苷單體單元的寡核苷酸。
本發(fā)明還涉及式V寡核苷酸5′-U-(O-Y-O-V-)xO-Y-O-W-3′(V)，其中X為0—200的數(shù)，及Y為核苷酸橋基，U、V和W各自獨(dú)立地為相同或不同的天然或合成核苷殘基，并且U、V和/或W殘基中至少一個(gè)為式VI的殘基 B和R3的定義、優(yōu)選定義和實(shí)例如式I化合物下所定義。
優(yōu)選的橋基Y為天然寡核苷酸中存在的—P(O)O_基團(tuán)。橋基的其它實(shí)例為—P(O)S_—、—P(S)S_—、—P(O)R16—、—P(O)NR17R18及—CH2—，其中R16為H或C1—C6烷基，及R17和R18每個(gè)相互獨(dú)立地同R16的定義。在式V中，X優(yōu)選為0—100，更優(yōu)選為1—50，最優(yōu)選為3—29的數(shù)。式VI殘基可連結(jié)在核苷酸序列末端或序列中，全部或幾個(gè)(如2—5個(gè))式VI殘基可以依次連結(jié)，或式VI殘基連結(jié)在天然或合成苷核之間，或以混合形式分布在核苷酸序列中。
一種特別優(yōu)選的方案是這樣的式V寡核苷酸，其中X為2—50，優(yōu)選2—30的數(shù)，Y為—P(O)O(-)—基團(tuán)，U、V和W每個(gè)獨(dú)立地為相同或不同的天然核苷殘基，且U、V和W的至少一種相當(dāng)于式VI。
適合的天然核苷為腺苷、胞苷、鳥(niǎo)苷、尿苷、2—氨基腺苷、5—甲基胞苷、2′—脫氧腺苷、2′—脫氧胞苷、2′—脫氧鳥(niǎo)苷和胸苷。提及的天然核苷堿基特別是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。式VI殘基可連結(jié)在核苷酸序列末端或序列中，全部或12個(gè)(比2—5個(gè))或VI殘基可以依次連結(jié)，或式VI殘基連結(jié)在天然核苷殘基之間，或以混合形式分布在核苷酸序列中。在式V的寡核苷酸的另一優(yōu)選形式中，所有U，V和W殘基相當(dāng)于相同或不同的式VI殘基。X優(yōu)選為3—29的數(shù)，式V殘基的總數(shù)優(yōu)選為1—12個(gè)。
本發(fā)明的寡核苷酸可用本身已知的各種方法在DNA合成儀中制備，DNA合成儀可為自動(dòng)化或非自動(dòng)化的，帶有操作說(shuō)明的這種儀器可購(gòu)得。對(duì)于橋基—P(O)O(-)—，例如可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的磷酸三酯法、亞磷酸三酯法或H—膦酸酯法。在亞磷酸三酯法中可采用的步驟，例如包括其中R1和R2各自為H的式I核苷與保護(hù)基式劑如4，4′—二甲氧基三苯基甲基氯反應(yīng)，形成式F的核苷 再將式F化合物通過(guò)“連接于”如琥珀酸酐連結(jié)到固體載體上如含有長(zhǎng)鏈烷基氨基的可控多孔玻璃(CPG)上。在單獨(dú)的步驟中，例如用R′OP〔N(異丙基)2)〕2將式F化合物的羥基衍生化為磷亞酰胺，形成式G化合物 其中R′為如β—氰基乙基。
在去除連結(jié)于載體的物質(zhì)的保護(hù)基如DMT后，與式F化合物進(jìn)行偶聯(lián)，同時(shí)脫去—N(異—C3H7)2，將存在的任何游離羥基封閉(加帽)，然后將生成的亞磷酸酯氧化為磷酸酯。將二聚物脫保護(hù)后，用式G化合物重復(fù)反應(yīng)循環(huán)，直到合成了具有所需數(shù)目的單體單元的寡聚體為止，使產(chǎn)物從載體上脫離。以此方式，得到了這樣的寡核苷酸，其中所有根據(jù)式V的殘基U、V和W由式VI的殘基組成。根據(jù)具體反應(yīng)循環(huán)中所使用的本發(fā)明的核苷單元和合成及天然核苷單元，以此方法還可以制備在任何所需的序列中含有任何所需的單體的寡核苷酸。
其中R1和R2各自為H的本發(fā)明式I化合物具有抗病毒和抗增殖特性，因此可用作藥物。另外，本發(fā)明的寡核苷酸對(duì)核酸酶降解具有高穩(wěn)定性。特別令人驚奇的是它們與互補(bǔ)核酸鏈(特別是RNA型的互補(bǔ)核酸鏈)的優(yōu)異的配對(duì)能力。另外，它們具有意外高的細(xì)胞攝取率。本發(fā)明的寡核苷酸因此特別適合于反義技術(shù)，即通過(guò)與mRNA的適當(dāng)互補(bǔ)核苷酸序列結(jié)合，抑制不良蛋白產(chǎn)物的表達(dá)(EP 266099，WO87/07300和WO89/08146)。它們可用于治療感染和疾病，例如在核酸階段阻斷生物活性蛋白質(zhì)的表達(dá)(如致癌基因)。本發(fā)明的寡核苷酸還適于作為診斷劑，可作為基團(tuán)探針通過(guò)在單鏈或雙鏈核酸階段選擇性相互作用。用于病毒感染和遺傳病的檢測(cè)。特別是由于其對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性提高，它們不僅可在體外而且可在體內(nèi)(如組織樣品、血漿和血清)用于診斷。這些可能的應(yīng)用在如WO91/06556中有所描述。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的寡核苷酸作為病毒感染或遺傳病檢測(cè)的診斷劑的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的式I核苷和式V寡核苷酸用于通過(guò)使體內(nèi)核苷酸序列失活來(lái)治療恒溫動(dòng)物(包括人)的疾病的治療方法中。給重約70kg的恒溫動(dòng)物施用的日劑量為如0.01—1000mg。優(yōu)選的藥物組合物的形式經(jīng)非胃腸道途徑，如靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，它含有有效量的式I核苷或式V寡核苷酸，或還有其它活性成分，優(yōu)選有效量的藥物載體及適當(dāng)時(shí)含有賦形劑。
本發(fā)明的藥理有效的核苷和寡核苷酸可以非腸胃給藥組合物形式或滴注液形式使用。這種溶液優(yōu)選是等滲水溶液或懸液，它可在使用前從例如含有效成分本身或與載體如甘露糖醇結(jié)合的凍干組合物制備。該藥物組合物可被滅菌和/或可含有賦形劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑和/或乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖液。該藥物組合物必要時(shí)可含有其它藥理活性物質(zhì)如抗生素，可以本身已知的方法如常規(guī)溶解或冷凍干燥方法制備，它含有約0.1％—90％，特別是約0.5％—30％，例如1％—5％的有效成分。
下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。1H—NHR譜是基于下列環(huán)狀碳結(jié)構(gòu)中的碳原子編號(hào)。起始化合物 核苷(示例) 在本文中和式中使用的縮寫(xiě)DMF 二甲基甲酰胺ClBnCl22，4—二氯芐基氯Bn 芐基Ac 乙?；? 苯基BSA N，N—雙三甲基甲硅烷基乙酰胺
DBU二氮雜雙環(huán)〔5.4.0〕十一—7—烯。
BOH—Cl 芐氧基甲基氯DMTCl 4，4′二甲氧基三苯甲基氯THF四氫呋喃A)核苷類(lèi)似物的制備實(shí)施例A1將28.0g 1—甲基核糖于60℃滴加到13.5gNaH在130mlDMF中的沸合物中。當(dāng)不再產(chǎn)生H2時(shí)，滴加110.0g ClBnCl2。在25℃再攪拌反應(yīng)混合物16小時(shí)。為了破壞殘余的NaH，小心滴加甲醇，再將反應(yīng)混合物傾入冰/水中。濾出塊狀沉淀，用乙腈徹底洗滌。得到化合物(Al)。 1H—NMR(250MHz，CDCl3)H—C(1)質(zhì)子出現(xiàn)在5.0ppm處，單峰。MS638(M+)實(shí)施例A2將實(shí)施例A1中制備的65.9g產(chǎn)物溶解在600ml二氯甲烷中，將此溶液冷卻至0℃。然后滴加800ml二氯甲烷中的121mlSnCl4，在3℃靜置。26小時(shí)后再加入2mlSnCl4?？偣?5小時(shí)后，將反應(yīng)溶液小心傾入700mlNaHCO3飽和溶液中。用400ml二氯甲烷稀釋后，濾去含Sn沉淀。濾液的有機(jī)相用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮，得到化合物(A2)。 1H—NMR(250MHz，CDCl3)H—C(1)質(zhì)子出現(xiàn)在4.90ppm處，為雙峰，J＝5Hz。實(shí)施例A3將125.9g實(shí)施例A2中得到的產(chǎn)物溶解在1升吡啶中。20℃下加入25.5g乙酸酐和1g4—二甲氨基吡啶。然后攪拌反應(yīng)混合物17小時(shí)，再用浸溶于1升水中，用濃鹽酸酸化，用乙酸乙酯萃取。萃取液用MgSO4干燥，并蒸發(fā)濃縮。最后，殘余物用己烷結(jié)晶。得到化合物(A3)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)5.15[d，J＝4.5Hz，H-C(1)]；3.50(s，OCH3)；2.17(s，OCOCH3)；MS522(M+)[α]Na(D)＝87.4±1.0°，CHCl3(0.998％)實(shí)施例A4將24g胸腺嘧啶在100ml1，2—二氯乙烷中制成漿狀。加入116.4gBSA后，回流直至得到澄清溶液。將該溶液冷卻到50℃，加入50g實(shí)施例A3制得的產(chǎn)物和27.5g三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯?；旌衔镌?0℃下攪拌20小時(shí)，然后傾入300mlNaHCO3溶液中，過(guò)濾。用二氯乙烷萃取后，萃取液用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮。最后，殘余物用甲醇結(jié)晶。得到化合物(A4)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)8.25(s，NH)；6.10[d，J＝4.5Hz，H-C(1’)]；2.13(s，OCOCH3)；1.66(s，CH3)MS616(M+)實(shí)施例A5將85g實(shí)施例A4制得的產(chǎn)物懸浮在850ml乙腈中。在室溫下滴加24.2gDBU和24.9gbOM—Cl。攪拌20小時(shí)后，將反應(yīng)混合物傾入水中，用乙酸乙酯萃取。萃取液用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮。得到化合物(A5)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)6.05[d，J＝4.5Hz，H-C(1’)]；5.5(AB，CH2)；5.37[dd，H-C(2’)]；2.13(S，OCOCH3)；1.55(s，CH3)MS736(M+)實(shí)施例A6將106g實(shí)施例A5中制備的產(chǎn)物懸浮在1升THF中。滴加26g30％NaOCH3/CH3OH。攪拌2.5小時(shí)后，將反應(yīng)溶液傾入水中，加入氯化鈉飽和水溶液，用乙酸乙酯萃取。用MgSO4干燥后，蒸發(fā)濃縮萃取液。得到化合物(A6)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)5.93[d，J＝5Hz，H-C(l)’)]；5.5(AB，CH2)；3.03(d，J＝6.5Hz，OH)；1.72(s，CH3)MS694(M+)實(shí)施例7將79.4g實(shí)施例A6中制得的產(chǎn)物溶解在800mlTHF中。加入3.3gNaH后，將混合物迅速加熱至沸騰，然后于40℃下滴加21g溴乙酸甲酯。反應(yīng)混合物于60℃共攪拌27小時(shí)，在此期間16小時(shí)后加入1gNaH和2ml溴乙酸甲酯，20小時(shí)后再次加入。最后，將反應(yīng)混合物傾入水中，用乙酸乙酯萃取。萃取物用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮，得到化合物(A7)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.70[s，H-C(6)]；5.92[s，H-C(1’)]；5.48(AB，CH2)；3.75(s，OCH3)；1.58(s，CH3).MS766(M+).實(shí)施例A8將37g實(shí)施例A7中得到的產(chǎn)物溶解在400mlTHF中。于20℃分批加入1.5gLiBH4，攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。將其小心傾入500ml水中，用32m12N鹽酸水溶液中和。用乙酸乙酯萃取后，蒸發(fā)濃縮，得到化合物(A8)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.65[s，H-C(6)]；5.96[s，H-C(1’)]；5.50(AB，CH2)；2.57(broad s，OH)；1.60(s，CH3).MS738(M+).實(shí)施例A9將20.0g實(shí)施例A8中制得的產(chǎn)物溶解在200mlTHF中，用2gPd/C(5％)于25℃和常壓下氫化4.5小時(shí)(H2吸收102％)。過(guò)濾并蒸發(fā)濃縮濾液后，將殘余物溶解在170ml甲醇中，用30％NaOCH3/CH3OH溶液調(diào)pH至11。24小時(shí)后，將混合物傾入250ml水中，用2N鹽酸水溶液酸化，用乙酸乙酯萃取。萃取物用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮。得到化合物(A9)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)9.24(s，NH)；7.90[s，H-C(6)]；5.99[s，H-C(1，)]；2.68(t，OH)；1.60(s，CH3).MS618(M+).實(shí)施例A10將4.2g實(shí)施例A9中制備的產(chǎn)物溶解在50ml吡啶中，加入2.4g乙酸酐后，于室溫下攪拌19小時(shí)。將溶液傾入100ml2NHCl中，用乙酸乙酯萃取。萃取液用2NHCl和水洗滌，用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮。制得化合物(A10)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)9.28(s，NH)；7.67[s，H-C(6)]；5.95[s，H-C(1’)]；2.00(s，CH3)；1.60(s，CH3).MS663(M＋H)+.實(shí)施例A114.2g實(shí)施例A10中制得的產(chǎn)物在50ml甲醇中在2.09g無(wú)水醋酸鈉存在下，用0.8gPd/C(5％)于35℃和常壓下氫化。58小時(shí)后，過(guò)濾氫化混合物，蒸發(fā)濃縮。為了除去鹽，殘余物用硅膠在小玻璃柱上層析(乙酸乙酯/甲醇9∶1)。得到化合物(A11)。 1H-NMR(250MHz，DMSO)10.1(s，NH)；7.61[s，H-C(6)]；5.64[d，J＝6Hz，H-C(1’)]；1.70(s，CH3)；1.57.MS379(M＋Cl)-.實(shí)施例Al22.27g實(shí)施例A11中制備的產(chǎn)物浸溶于吡啶中兩次，蒸發(fā)濃縮。殘余物再溶解在30ml吡啶中，向其中加入2.57gDMTCl。室溫?cái)嚢?0小時(shí)后，反應(yīng)混合物用250ml乙酸乙酯稀釋?zhuān)A入50ml水中。有機(jī)相用MgSO4干燥。并濃縮。殘余物在硅膠上層析(甲苯/乙酸乙酯/三乙胺49∶49∶2)。得到化合物(A12)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)9.22(s，NH)；7.70[s，H-C(6)]；5.94[d，J＝1.5Hz，H-C(1’)]；3.78(s，OCH3)；2.19(s，CH3)；1.36(s，CH3).MS706(M＋NH4)+.實(shí)施例A13將2.70g實(shí)施例A12中得到的產(chǎn)物加入0.93g二異丙基銨四唑化物、1.15g2—氰基乙基—N，N，N′，N′—四異丙基磷二亞酰胺及30ml二氯甲烷的混合物中。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物17小時(shí)，然后傾入NaHCO3飽和水溶液中。有機(jī)相用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮。殘余物在硅膠上層析(乙醇/乙酸乙酯1∶1，加入2％三乙胺)。形成的泡沫溶解在1ml甲基叔丁基醚中，于0℃滴加到戊烷中。得到化合物(A13)(非對(duì)映異構(gòu)體，1∶1)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.74[s，H-C(6)]and 7.68[s，H-C(6)]；6.08[d，J＝4Hz，H-C(1)]；5.97[d，J＝4Hz，H-C(1’)]；31P-NMR(CDCl3)150.174 and 150.038MS847(M＋H)+實(shí)施例A14將實(shí)施例A8中得到的20.6g產(chǎn)物溶解在200mlCH2Cl2中。于5℃下，滴加4.35g二乙氨基—硫三氟化物(DAST)，5℃下攪拌反應(yīng)混合物3小時(shí)。將此溶液傾入300mlNaHCO3飽和溶液中，用CH2Cl2萃取。萃取液用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮。殘余物層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯，1∶1)，得到化合物(A14)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.68[s，H-C(6)]；5.92[s，H-C(1’)]；5.50[AB，CH2]1.58(s，CH3).19F-NMR(CDCl3)-223.74(t.CH2F).MS758(M＋NH4)+.實(shí)施例A15將1.30g實(shí)施例A14中得到的產(chǎn)物溶解在26mlTHF中，用0.65g/Pd/C(5％)于20℃和常壓下氫化。0.5小時(shí)后，濾出催化劑，蒸發(fā)濃縮濾液。殘余物溶解在甲醇(15ml)中，用NaOMe/MeOH溶液調(diào)pH為11。攪拌20小時(shí)后，將混合物傾入20ml水中，用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮后，得到化合物(A15)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)8.99(s，NH)；7.61[s，H-C(6)]；5.88[d，J＝1.5Hz，H-C(1’)]；1.52[s，CH3].MS621(M＋H)+.實(shí)施例A16類(lèi)似于對(duì)步驟(A11)、(A12)和(A13)的說(shuō)明，將化合物(A15)轉(zhuǎn)化成磷亞酰胺(A16)(非對(duì)映異構(gòu)體，1∶1)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.75[s，H-C(6)]and 7.68[s，H-C(6)]；6.06[d，J＝4Hz，H-C(1’)]and 6.00[d，J＝4Hz，H-C(1’)].31P-NMR(CDCl3)150.107.實(shí)施例A17將20.0g化合物(A6)溶解在200mlTHF中，保持在60℃，加入0.83gNaH(100％)，直至不再產(chǎn)生H2。冷卻后，將此溶液在高壓釜中加壓，將48.0g三氟丙炔和該反應(yīng)混合物加熱至50℃。48小時(shí)后，將反應(yīng)混合物濃縮至一半體積，然后傾入水中，用乙酸乙酯萃取。萃取物用MgSO4干燥，蒸發(fā)濃縮。殘余物在硅膠上層析(正己烷/乙酸乙酯.4∶1)。得到化合物(A17)。 1H-NMR(250MHz，CDCl3)7.72[s，H-C(6)]；6.80(d，J＝8Hz，CH＝C)；5.82[s，H-C(1’)]；5.48(AB，CH2)；4.85(m，CH＝C)；1.58(s，CH3).MS789(M＋H)+.實(shí)施例A18將10.0g化合物(A17)溶解在200mlTHF中，用2gPd/C在室溫和常壓下氫化。1小時(shí)后，濾去催化劑，蒸發(fā)濃縮濾液。然后類(lèi)似于實(shí)施例A15，殘余物用NaOMe處理，在硅膠上層析(正己烷/乙酸乙酯2∶1)。得到化合物(A18)。 1H-NMR(CDCl3)9.00(s，NH)；7.66[s，H-C(6)]；5.93[d，J＝1.5Hz，H-C(1’)]；1.61(s，CH3).19F-NMR(CDCl3)-65.23.MS705(M＋Cl)-.實(shí)施例A19將8.9g化合物(A6)溶解在90mlTHF中，迅速加熱至沸，加入0.34gNaH(100％)。當(dāng)不再產(chǎn)生H2時(shí)，于20℃滴加5.1gl，1，2—三氯—3，3，3—三氟丙烯，然后在55℃下攪拌反應(yīng)混合物5小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾入水中，用乙酸乙酯萃取。蒸發(fā)濃縮，然后層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯4∶1)。得到順/反(約1∶1)混合物形式的化合物(A19)。 1H-NMR(CDCl3)7.63 and 7.60[each s，each H-C(6)]；5.91 and 5.87[each s，eachH-C(1’)]；1.61 and 1.57(each s，each CH3).MS891(M＋Cl)-.
實(shí)施例A20類(lèi)似上述實(shí)施列，將化合物(A18)或(A19)脫保護(hù)并轉(zhuǎn)化成磷亞酰胺，得到化合物(A20)(非對(duì)映異構(gòu)體，1∶1)。 1H-NMR(CDCl3)8.6(broad s，NH)；7.74 and 7.69[each s，each H-C(6)]；5.97 and 5.94[each d，J＝4Hz，each H-C(1’)].31P-NMR(CDCl3)150.287 and 150.035ppm.實(shí)施例B寡核苷酸的制備用二甲氧基三苯甲基化、3′—活化的〔3′—(β—氰基乙氧基—二(異丙基氨基)磷亞酰胺)〕本發(fā)明核苷和這樣的天然活化核苷，將寡核苷酸連結(jié)于固體載體(可控多孔玻璃CPG)上，按照制造商的一般性說(shuō)明〔也見(jiàn)“Oligonucleotide Synthesis，a practical approach”M.J Gait；IRL Press 1984(Oxford—Washington DC)〕在DMA合成儀(AppliedBiosystems，Modell 380B，標(biāo)準(zhǔn)磷亞酰胺化學(xué)和磺酰化)中進(jìn)行合成。在偶聯(lián)最后一個(gè)核苷單元后，使5′—保護(hù)的寡核苷酸從固體載體上脫離過(guò)夜，同時(shí)用濃氨水處理除去所有其它的保護(hù)基，然后經(jīng)反相HPLC用50mM乙酸銨緩沖液(pH7)/乙腈進(jìn)行純化。再用80％乙酸水溶液處理20分鐘，除去5′—二甲氧基三苯甲基保護(hù)基，用乙醇沉淀寡核苷酸，離心分離。用凝膠電脈(聚丙烯酰胺)鑒定此寡核苷酸的純度，并且借助于基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI—TOFMS)檢定其特性。實(shí)施例C1親和性；寡核苷酸(反義)與互補(bǔ)寡核苷酸序列(有意義)的相互作用寡核苷酸與相應(yīng)的天然核苷酸的堿基互補(bǔ)寡聚體的相互作用，通過(guò)記錄UV熔化曲線和由其所確定的Tm值來(lái)表征。例如由Marky，L.A.〔Breslauer，K.J.，Biopolymers 261601—1620(1987)〕描述了該標(biāo)準(zhǔn)方法。
制備寡核苷酸和相應(yīng)的堿基互補(bǔ)天然寡核苷酸在10mM磷酸緩沖液，100mM、NaCl、0.1mMEDTA，pH7.0中的溶液(c＝4·10-6/寡核苷酸)，記錄作為溫度(15—95℃)函數(shù)的260nm處消光值的變化。從熔化曲線測(cè)得Tm值(表3)。表3親和性(a)TTTTtCTCTCTCTCT(vs.RNA) X Tm(℃) ΔTm(℃)H 51.8 0 (h)tCCAGGtGtCCGCAtC(vs.RNA) x Tm(℃) ΔTm(℃)/modH62.3 0 (c)GCGttttttttttGCG(vs.RNA) X Tm(℃)ΔTm(℃)/mod．H50.2 0 實(shí)施例C2特異性；寡核苷酸與其中插入了錯(cuò)誤核苷(Y)的堿基互補(bǔ)寡核苷酸的相互作用制備了寡核苷酸和序列為r(GGA CCG GAA YGG TAC GAG)的相應(yīng)堿基互補(bǔ)寡核苷酸在10mM磷酸鹽緩沖液、100mM NaCl、0.1mM EDTA，pH7中的溶液(c＝4·10-6M/寡核苷酸)，測(cè)定作為溫度(15℃到95℃)函數(shù)的在200nm處消光值的變化。從該曲線測(cè)得Tm值。結(jié)果示于表4中。表4特異性有意義3’-GAG CAU GGY AAG GCC AGG-5’(RNA)反義 5’-CTC GTA CCt TTC CGG TCC-3’(DNA)Tm(℃) andΔTm Y＝A63.3 65.0 69.4Y＝C54.5 55.5 55.8(-8.9) (-9.5) (-8.6)Y＝G61.6 59.7 60.5(-1.7) (-5.3) (-4.0)Y＝U55.8 56.2 56.8(-7.5) (-8.8) (-7.7)Y＝無(wú) 59.4 56.1 57.4(-3.9) (-8.9) (-7.0)實(shí)施例C3核酸酶穩(wěn)定性；具有序列d(TCC AGG TGT CCG tttC)的各種寡核苷酸的酶促水解。
數(shù)批合成的寡核苷酸和相應(yīng)的天然寡聚體，每批14μg在37℃在200μl 10％熱滅活胎牛血清中(c＝70μg/ml)溫育。在0.5；1；2；4；6；24和48小時(shí)后，每15μl反應(yīng)溶液通過(guò)加入到25μl 9M脲和三硼酸鹽緩沖液(pH7)中退火，—20℃下儲(chǔ)存，直到進(jìn)行測(cè)定為止。退火反應(yīng)溶液用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用其磷含量(磷成像方法)鑒別裂解產(chǎn)物。在給定的時(shí)間t時(shí)完整寡核苷酸的濃度(Cn(t))和從3′末端除去天然C—單元得到的片段的濃度(Cn-1(t))之和，與在t＝0時(shí)完整寡核苷酸的原始濃度(Cn(0))之比R—R＝(Cn(t)＋Cn-1(0))/ Cn(0)—對(duì)時(shí)間作圖。測(cè)得半衰期τ1/2(即R＝0.5時(shí)的時(shí)間)為
權(quán)利要求
1.式I化合物 其中R1和R2各自相互獨(dú)立地為氫或保護(hù)基，或R1如上所定義和R2為形成含磷核苷酸橋基的殘基；B為嘌呤或嘧啶殘基或其類(lèi)似物；及R3為OH，F(xiàn)或(CF2)nCF3，其中n為0—7的數(shù)。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1和R2均為氫。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R1和R2為相同的保護(hù)基。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中作為嘌呤殘基或其類(lèi)似物的B為式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe和IIf的殘基 其中Rb1為H、Cl、Br、OH或—O—C1—C12烷基，及Rb2、Rb3和Rb5各自相互獨(dú)立地為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，-N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮雜環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1—C12烷基，羥基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，芐氧基或C1—C12烷硫基，被保護(hù)基取代或未取代的羥基和氨基，苯基，芐基，C1—C20伯氨基或C2—C30仲氨基，Rb4為氫、CN或—C≡C—Rb7，及Rb6和Rb7為氫或C1—C4烷基。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中羥基和氨基的保護(hù)基為C1—C8?；?。
6.權(quán)利要求4的化合物，其中伯氨基含有1—12個(gè)碳原子，仲氨基含有2—12個(gè)碳原子。
7.權(quán)利要求4的化合物，其中伯氨基和仲氨基為式Ra1Ra2N的殘基，其中Ra1為H，或獨(dú)立地同Ra2的定義，及Ra2為C1—C26烷基、—氨基烷基或—羥基烷基；羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含2—8個(gè)碳原子，烷基含1—6個(gè)碳原子，優(yōu)選1—4個(gè)；C2—C20鏈烯基；苯基，單—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)苯基，芐基，單—或二—(C1—C4—烷基—或—烷氧基)芐基；或1，2—1，3—或1，4—咪唑—C1—C6烷基，或Ra1和Ra2一起為四亞甲基或五亞甲基，3—氧雜—1，5—亞戊基，—CH2—NRa3—CH2CH2—或—CH2CH2—NRa3—CH2CH2—，其中Ra3為H或C1—C4烷基，氨基烷基中的氨基被一個(gè)或兩個(gè)C1—C4烷基或羥基烷基所取代或未取代，及羥基烷基中的羥基為游離的或被C1—C4烷基醚化。
8.權(quán)利要求6的化合物，其中伯氨基和仲氨基為甲基—、乙基—、二甲基—、二乙基—、烯丙基—、單或二—(羥基—乙—2—基)—、苯基—和芐基、乙?；惗□；虮郊柞；被?。
9.權(quán)利要求4的化合物，其中式II、IIb、IIc、IId和IIe中Rb1為氫。
10.權(quán)利要求4的化合物，其中式IId中Rb5為氫。
11.權(quán)利要求4的化合物，其中式II、IIa、IIb、IIc、IId和IIf中的Rb2和Rb3各自相互獨(dú)立地為H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲氨基、二甲氨基、苯甲酰氨基、甲氧基、乙氧基或甲硫基。
12.權(quán)利要求4的化合物，其中B為嘌呤殘基或選自下列的嘌呤類(lèi)似物的殘基腺嘌呤、N—甲基腺嘌呤、N—苯甲?；汆堰?、2—甲硫基腺嘌呤、2—氨基腺嘌呤、6—羥基嘌呤、2—氨基—6—氯嘌呤、2—氨基—6—甲硫基嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和N—異丁?；B(niǎo)嘌呤。
13.權(quán)利要求1的化合物，其中式I中作為嘧啶殘基的B為式III、IIIa、IIIb或IIIc的尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶殘基 其中Rb6為H或C1—C4烷基，及Rb8為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—氮雜環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1—C12烷基，羥基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，芐氧基或C1—C12烷硫基，被保護(hù)基取代或未取代的羥基和氨基，苯基，芐基，C1—C20伯氨基，C2—C30仲氨基，C1—C12鏈烯基或C1—C12炔基，及及IIIb中的NH2被C1—C6烷基、苯甲酰基或被保護(hù)基取代或未取代，或式III、IIIa、IIIb或IIIc殘基的二氫衍生物。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中Rb8為H，C1—C6—烷基或—羥烷基，C2—C6—鏈烯基或—炔基，F(xiàn)，Cl，Br，NH2，苯甲酰氨基，或單—或二—C1—C6烷基氨基。
15.權(quán)利要求13的化合物，其中Rb8為H，C1—C6—烷基或—烷氧基或—羥基烷基，C2—C6—鏈烯基或—炔基，F(xiàn)，Cl，Br，NH2，苯甲酰氨基，或單—或二—C1—C6烷基氨基。
16.權(quán)利要求14的化合物，其中Rb8為H、F、Cl、Br、NH2、NHCH3、N(CH3)2、C1—C4烷基、C2—C4鏈烯基—(1)或C2—C4炔基—(1)。
17.權(quán)利要求15的化合物，其中Rb8為H，C1—C4烷基，C2—C4鏈烯基—(1)，C2—C4炔基—(1)，NH2，NHCH3或(CH3)2N。
18.權(quán)利要求1的化合物，其中作為嘧啶類(lèi)似物的殘基B衍生自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5—氟尿嘧啶、5—氯尿嘧啶、5—溴尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5—甲基胞嘧啶、5—丙炔胸腺嘧啶和5—丙炔胞嘧啶。
19.權(quán)利要求1的化合物，其中作為形成核苷酸橋基的含磷殘基R2為式P1或P2 其中Ya為氫、C1—C12烷基、C6—C12芳基、C7—C20芳烷基、C7—C20烷芳基、—ORb、—SRb、—NH2、伯氨基、仲氨基、O(-)M(+)或S(-)M(+)；Xa為氧或硫；Ra為氫、M_、C1—C12烷基、C2—C12鏈烯基、C6—C12芳基、或RaO—基團(tuán)為具有含1—3個(gè)N原子的5之環(huán)的N—雜芳基—N—基；Rb為氫、C1—C12烷基或C6—C12芳基；及M_為Na_、K_、Li_、NH4_或伯、仲、叔或季銨離子；Ya、Ra和Rb中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基被烷氧基、烷硫基、鹵原子、—CN、—NO2、苯基、硝基苯基或被鹵代苯基取代或未取代。
20.權(quán)利要求19的化合物，其中Ra為β—氰基乙基，及Ya為二(異丙基)氨基。
21.權(quán)利要求1的化合物，其中R3為OH。
22.權(quán)利要求1的化合物，其中R3為F。
23.權(quán)利要求1的化合物，其中R3為(CF2)nCF3，且n為0—7的數(shù)。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中n為0。
25.式I化合物的制備方法 其中R1和R2各自相互獨(dú)立地為氫或保護(hù)基；B為嘌呤或嘧啶殘基或其類(lèi)似物；及(a)R3為OH，該方法包括式IVa化合物 其中R14和R15為相同或不同的保護(hù)基，B為嘌呤或嘧啶殘基或其類(lèi)似物，堿基B中的官能團(tuán)用保護(hù)基保護(hù)，在惰性溶劑中與式A化合物反應(yīng)X—CH2—COOR4(A)其中R4為C1—C4烷基，X為Cl、Br、I、甲苯磺?；狾—或甲磺?；狾；然后用NaBH4或LiAlH4還原酯官能團(tuán)，可以用R1中定義的基團(tuán)臨時(shí)保護(hù)生成的OH；(b)R3為F，該方法包括其中R3為OH的式I化合物與式B化合物反應(yīng) (c)R3為—(CF2)n—CF3，其中n為0—7的數(shù)，該方法包括式IVa化合物與式C、D或E的化合物反應(yīng)CH≡C-(CF2)n-CF3(C)CH2＝CH-(CF2)n-CF3(D) 然后將雙鍵或氯代雙鍵催化還原，可形成CH2CH2(CF)nCF3基團(tuán)；(d)R3為OH、F或—(CF2)n—CF3，該方法包括式IVb化合物 其中R14和R15如上所定義，A為離去基團(tuán)，按(a)到(c)中描述的方法之一在2′—OH上進(jìn)行取代，然后通過(guò)取代引入堿基B；必要時(shí)脫去保護(hù)基R14和R15。
26.權(quán)利要求1的化合物用于制備寡核苷酸的用途，其中寡核苷酸由相同或不同的式1化合物單體單元組成，或含有與一個(gè)或多個(gè)其它天然或合成的核苷相結(jié)合的至少一個(gè)式I化合物單位單元，該寡核苷酸為2—200個(gè)單體單元組成。
27.權(quán)利要求26的用途，是制備含2—100個(gè)單體單元的寡核苷酸。
28.權(quán)利要求27的用途，是制備含2—50個(gè)單體單元的寡核苷酸。
29.權(quán)利要求28的用途，是制備含4—30個(gè)單體單元的寡核苷酸。
30.權(quán)利要求26的用途，是制備相同或不同的式I化合物單體單元的寡核苷酸。
31.權(quán)利要求26的用途，是制備相同的式I化合物單體單元和一種或多種天然或合成核苷單體單元的寡核苷酸。
32.式V的寡核苷酸5′-U-(O-Y-O-V-)xO-Y-O-W-3′(V)，其中X為0—200的數(shù)，及Y為核苷酸橋基，U、V和W各自獨(dú)立地為相同或不同的天然或合成核苷，并且U、V和/或W殘基中至少一個(gè)為式VI的殘基 其中B為嘌呤或嘧啶殘基或其類(lèi)似物，及R3為OH、F或(CF2)nCF3，其中n為0—7的數(shù)。
33.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中n為0。
34.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中橋基Y為—P(O)O(-)—、—P(O)S(-)—、—P(S)S(-)—、—P(O)R16—、—P(O)NR17R18—或—CH2—，其中R16為H或C1—C6烷基，及R17和R18各自獨(dú)立地同R16的定義。
35.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中橋基Y為—P(O)O(-)—。
36.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中X為0—100的數(shù)。
37.權(quán)利要求36的寡核苷酸，其中X為1—50的數(shù)。
38.權(quán)利要求37的寡核苷酸，其中X為3—29的數(shù)。
39.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中式VI殘基鍵合在末端和/或核苷酸序列中。
40.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中式VI殘基鍵合在天然或合成核苷之間。
41.權(quán)利要求39或40的寡核苷酸，其中2—5個(gè)相同或不同的式VI殘基依次相連。
42.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中共含4—30個(gè)核苷單元和1—12個(gè)式VI殘基。
43.權(quán)利要求32的化合物，其中作為嘌呤殘基或其類(lèi)似物的B為式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe或IIf的殘基 其中Rb1為H、Cl、Br、OH或—O—C1—C12烷基，及Rb2、Rb3和Rb5各自相互獨(dú)立地為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—N—環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1—C12烷基，羥基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，芐氧基或C1—C12烷硫基，被保護(hù)基取代或未取代的羥基和氨基，苯基，芐基，C1—C20伯氨基或C2—C30仲氨基，Rb4為氫、CN或—C≡C—Rb7，及Rb6和Rb7為氫或C1—C4烷基。
44.權(quán)利要求32的化合物，其中B為式III、IIIa、IIIb或IIIc的尿嘧啶、胸腺嘧啶或胞嘧啶殘基 其中Rb6為H或C1—C4烷基，及Rb8為H，OH，SH，NH2，NHNH2，NHOH，NHO—C1—C12烷基，—N＝CH—N(C1—C12烷基)2，—N＝CH—N—環(huán)烷基，F(xiàn)，Cl，Br，C1—C12烷基，羥基—C1—C12烷基，氨基—C1—C12烷基，C1—C12烷氧基，芐氧基或C1—C12烷硫基，被保護(hù)基取代或未取代的羥基和氨基，苯基，芐基，C1—C20伯氨基，C2—C30仲氨基，C1—C12鏈烯基或C1—C12炔基，及及IIIb中的NH2被C2—6烷基、苯甲酰基或被保護(hù)基取代或未取代，或式III、IIIa、IIIb或IIIc殘基的二氫衍生物。
45.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中R3為OH。
46.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中R3為F。
47.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中R3為(CF2)nCF3。
48.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中n為0—3的數(shù)。
49.權(quán)利要求48的寡核苷酸，其中n為0。
50.式V的寡核苷酸作為檢測(cè)病毒感染或遺傳病的診斷劑的用途。
51.式V的寡核苷酸在通過(guò)與體內(nèi)核苷酸序列相互作用來(lái)治療恒溫動(dòng)物(包括人)的疾病的治療方法中的用途。
52.含有有效量的式I核苷或式V寡核苷酸，或還含有其它有效成分，藥物載體以及適當(dāng)時(shí)含有賦形劑的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了式I化合物，式中R
文檔編號(hào)C07H19/167GK1115320SQ9510424
公開(kāi)日1996年1月24日 申請(qǐng)日期1995年4月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月27日
發(fā)明者P·馬丁 申請(qǐng)人:希巴-蓋吉股份公司