專利名稱：一種有氨肽酶活性的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表現(xiàn)出氨肽酶活性的酶，一種生產(chǎn)該酶的方法，含表現(xiàn)出氨肽酶活性的該酶的一種酶制劑，以及將該酶用于多種工業(yè)用途。
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物被用于許多食品中。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物傳統(tǒng)上是由酸水解所產(chǎn)生的，然而今天酶水解已被視為一種引人注意的替代方法。
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的主要問題之一是其嘗起來常常有苦味。當(dāng)使用諸如大豆蛋白質(zhì)或酪蛋白(它們都富含疏水L-氨基酸)作為蛋白質(zhì)來源時(shí)，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物就會(huì)具有苦味?？偟膩碚f，人們相信蛋白質(zhì)是否具有苦味取決于L-氨基酸殘基的平均疏水性，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
大多數(shù)能表現(xiàn)出肽酶活性的酶都可實(shí)施對(duì)植物、酵母及/或動(dòng)物蛋白質(zhì)的酶水解，可引出用作食品添加物的具高營(yíng)養(yǎng)值的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，如在湯類、醬油、肉汁、糊醬、豆腐、牛肉清湯、調(diào)味品、嬰兒食品、快餐、成品肉等產(chǎn)品中。
肽酶所有的肽酶或蛋白酶都是水解酶，它們作用于蛋白質(zhì)或其部分水解產(chǎn)物而分解肽鍵。
歐洲專利427,385(日本研究與發(fā)展協(xié)會(huì))披露了一種可編碼衍生自黃色霉菌(如米曲霉(Aspergillus oryzae))的堿性蛋白酶的染色體組基因。
日本專利0-2002374和0-2002375(Shokuhin)描述了衍生自米曲霉、可用于醫(yī)藥、食品和清潔劑之中的一種堿性蛋白酶。
SU-89177(Khark)討論了來自米曲霉的一種微生物蛋白酶，它也可用于食品、醫(yī)藥等。
日本專利5-4035283(Ajinomoto KK)披露了來自如米曲霉、可表現(xiàn)出內(nèi)肽酶活性的多種酶制劑，它們可以將蛋白質(zhì)幾乎完全水解。
WO 94/25580(Novo Nordisk A/S)描述了的一種水解植物或動(dòng)物蛋白質(zhì)的方法，是通過用衍生自米曲霉菌株的一種解蛋白酶制劑進(jìn)行溫育而實(shí)施的。
氨肽酶肽酶(蛋白酶)的一個(gè)亞組叫做氨肽酶，根據(jù)國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)的推薦文件(1992)，被劃分在酶分類號(hào)碼E.C.3.4.11之下(氨肽酶)。
氨肽酶能夠從多肽中去除一個(gè)或多個(gè)氨基末端殘基。
日本專利7-5034631(Noda)披露了一種衍生自黃色霉菌(其中包括米曲霉)的亮氨酸氨肽酶。
日本專利7-4021798(Zaidan Hojin Noda Sangyo)描述了通過添加由培養(yǎng)多種霉菌(包括米曲霉菌株460和IAM 2616)而制備的亮氨酸氨肽酶II來生產(chǎn)味噌醬。
Van Heeke等人[生物化學(xué)和生物物理記述，(1992)，1131，337-340]描述了來自解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)的一種30kDa氨肽酶的克隆，該菌株保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所，號(hào)碼ATCC No.15338。
米曲霉460被認(rèn)為能生產(chǎn)多種亮氨酸氨肽酶。通過凝膠過濾，經(jīng)計(jì)算可確定其中3種的分子量分別為26,500、56,000和61,000[Nakada等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，(1972)，37(4)，757-765；Nakada等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，(1972)，37(4)，767-774；Nakada等人，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，(1972)，37(4)，775-782]。米曲霉460菌株保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所，其為米曲霉(ATCC No.20386)。
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物苦味的降低歐洲專利65,663和325,986(Miles公司)討論了利用含米曲霉衍生的蛋白酶的酶混合物對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶水解。所得到的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物味道溫和，無苦味。
日本專利4-7029577(Asahi電子-化學(xué)公司)探討了衍生自米曲霉的一種蛋白酶，其分解蛋白質(zhì)時(shí)不產(chǎn)生任何苦成分。
現(xiàn)有技術(shù)披露了許多表現(xiàn)出肽酶、氨肽酶和其它酶活性的酶。所述的酶可衍生自多種微生物，包括真菌種類米曲霉。
一般來說，用于生產(chǎn)無苦味的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的產(chǎn)品包括肽酶和氨肽酶活性的混合物。
因此，極需要提供一種單成分酶(即基本上沒有任何副活性)，其只表現(xiàn)出用于減少食品中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味的活性。


圖1顯示對(duì)來自米曲霉A01568 35 kDa氨肽酶生產(chǎn)用的轉(zhuǎn)化體上清液的SDS-PAGE分析結(jié)果。
本發(fā)明的目的是提供一種表現(xiàn)出活性的單成分酶，其尤其可用于制備改進(jìn)性面包產(chǎn)品和生產(chǎn)食料中無苦味的蛋白質(zhì)及/或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
在分離可編碼表現(xiàn)出氨肽酶活性的DNA序列的方面，本發(fā)明人的成功是十分驚人的，其可優(yōu)先用于改進(jìn)烘烤產(chǎn)品的味道、外皮色澤、面心結(jié)構(gòu)和面團(tuán)粘性。另外，所述新型酶可用于生產(chǎn)無苦味的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
編碼所述氨肽酶的整體DNA序列使得制備單成分氨肽酶成為可能。
編碼本發(fā)明氨肽酶的整體DNA序列(如SEQ ID No.1所示)包含在一個(gè)質(zhì)粒中，其被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌菌株大腸桿菌DSM No.9965中。將在下面進(jìn)行描述。
通過數(shù)據(jù)庫編排檢索，我們發(fā)現(xiàn)，如SEQ ID No.1所示的DNA序列是新的。我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)于上述來自解蛋白弧菌(ATCC No.15338)的30kDa氨肽酶來說，相似性和同一性最高分別可達(dá)53％和2％。
本發(fā)明人對(duì)由分泌信號(hào)組成的氨肽酶前體形式和35 kDa氨肽酶進(jìn)行了分析。經(jīng)過計(jì)算，前體形式的分子量(Mw)達(dá)41kDa，估計(jì)等電點(diǎn)(pI)約為4.9。另外，氨肽酶的氨基酸組成估計(jì)如表1所示。表1非極性 No.百分比丙氨酸 37 9.79
纈氨酸 23 6.08亮氨酸 29 7.67異亮氨酸20 5.29脯氨酸 14 3.70甲硫氨酸3 0.79苯丙氨酸19 5.03色氨酸 2 0.53極性No.百分比甘氨酸 28 7.41絲氨酸 32 8.47蘇氨酸 25 6.61半胱氨酸4 1.06酪氨酸 13 3.44天冬酰胺11 2.91谷氨酰胺16 4.23酸性No.百分比天冬氨酸29 7.67谷氨酸 25 6.61堿性No.百分比賴氨酸 28 7.41精氨酸 9 2.38組氨酸 10 2.6535kDa酶的氨基酸序列的推論性完整前體形式 SEQ ID No.2所示。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種表現(xiàn)氨肽酶活性的酶，用SDS-PAGE法測(cè)得其表觀分子量(Mw)約為35kDa。
質(zhì)譜法顯示，該重組氨肽酶的平均質(zhì)量在33kDa-35kDa范圍內(nèi)。測(cè)得該酶的等電點(diǎn)(pI)約為4.9。
等電點(diǎn)pI被定義為酶分子復(fù)合體(與金屬或其它離子選擇性相聯(lián))為中性時(shí)即復(fù)合體上的靜電荷總量(凈電荷，NEC)等于0時(shí)的pH值。在這個(gè)量化過程中，必須考慮到靜電荷的正或負(fù)性。
在下列術(shù)語中，“35kDa氨肽酶”和“表現(xiàn)氨肽酶活性的酶”可交替用于本發(fā)明的單成分酶。
本發(fā)明表現(xiàn)氨肽酶活性的酶可衍生自多種微生物。本發(fā)明人已經(jīng)從絲狀真菌米曲霉A01568中分離出了本發(fā)明的氨肽酶，其以米曲霉460(FERM-P No.1149，ATCC No.20386)被保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所，進(jìn)一步描述見美國(guó)專利No.3,914,436。
本發(fā)明的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶至少包括分別如SEQ ID Nos.6，7，8，9和10所述的部分氨基酸序列之一。SEQ ID No.11是一種重疊和延伸N-末端序列的肽(5)。
第二方面，本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體，其含有編碼所述氨肽酶的DNA序列，該DNA序列包括a)如SEQ ID No.1所示的DNA序列的氨肽酶編碼部分，和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列，b)如a)定義所示DNA序列的類似物，其i)與如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列同源，或ii)與SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的相同寡核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽與由含如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的DNA序列所編碼的多肽同源，iv)編碼一種多肽，該多肽與由衍生自米曲霉A01568或得自大腸桿菌DSM 9965的SEQ ID No.1所示的DNA序列所編碼的純化氨肽酶所針對(duì)的抗體有免疫反應(yīng)性，在本說明書中，如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的“類似物”意指編碼表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的任何DNA序列，其至少具有屬性i)-iv)中的一種。
類似的DNA序列—可分離自能產(chǎn)生表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的另一種或相關(guān)(如相同)的生物，這要根據(jù)SEQ ID Nos.3-5所示的任意DNA序列，例如可使用此處的方法；因此可以是含此處所示的DNA序列的DNA序列的等位或種類變異體，—依據(jù)如SEQ ID Nos.3-5所示的任何DNA序列進(jìn)行構(gòu)建，例如可通過引入核苷酸的置換，即不會(huì)發(fā)生該DNA序列所編碼氨肽酶的另外的氨基酸序列，但其需符合產(chǎn)生該酶的宿主生物的密碼子利用；或者可通過引入能發(fā)生不同氨基酸序列的核苷酸置換。然而，在后一情況中，氨基酸變化最好是微小性的，是對(duì)多肽折疊或活性無顯著影響的保守性氨基酸置換，是一般為1-30個(gè)氨基酸的小型缺失；小型氨基或羧基末端的延展，如氨基末端甲硫氨酸殘基，一個(gè)約達(dá)20-25個(gè)殘基的小型銜接性肽，可促進(jìn)純化作用的小型延展，如聚組氨酸束，即抗原表位或連接區(qū)域。一般參見Ford等人，(1991)，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化2，95-107。保守性置換的實(shí)例限于堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小型氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道，這種置換可以在對(duì)分子功能十分關(guān)鍵的區(qū)域之外進(jìn)行，而且仍舊導(dǎo)致一種活性酶。這些氨基酸對(duì)于由本發(fā)明DNA構(gòu)建體所編碼的多肽活性是最基本的，因而最好不進(jìn)行置換，它們可依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的程序進(jìn)行鑒定，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變[Cunningham和Wells，(1989)，科學(xué)244，1081-1085]。在后者中，在分子的每一個(gè)殘基處都引入了技術(shù)性突變，對(duì)所生成的突變分子進(jìn)行生物活性檢測(cè)(即解氨肽特性)，以鑒定對(duì)于分子活性十分關(guān)鍵的氨基酸殘基。還可通過對(duì)晶體結(jié)構(gòu)的分析來確定底物—酶相互作用的位點(diǎn)，例如可通過諸如核磁共振、結(jié)晶分析或光親和性標(biāo)記等技術(shù)。例如可參見de Vos等人，(1992)，科學(xué)255，306-312；Smith等人，(1992)，分子生物學(xué)雜志，224，899-904；Wlodaver等人，(1992)，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)通訊，309，59-64。
可以理解，如SEQ ID Nos.3-5所示的DNA序列就是可用于分離編碼氨肽酶的整體DNA序列的序列，所述整體DNA序列例如是SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或轉(zhuǎn)化入保藏的菌種大腸桿菌DSM 9965中的DNA序列。術(shù)語“類似物”意指包括所述的完整DNA序列，其包含如SEQ ID Nos.3-5所示的一種或多種部分序列或其部分。氨基酸序列(從如SEQ ID No.1所示的DNA序列所推論)如SEQ ID No.2所示。
上述i)中所述的同源性可通過兩個(gè)序列間同一性程度(標(biāo)志第一個(gè)序列由第二個(gè)序列衍生)來確定?？赏ㄟ^技術(shù)領(lǐng)域所熟知的計(jì)算機(jī)程序來適宜地確定該同源性，如GCG程序包中所提供的GAP[Needleman，S.B.和Wuns ch，C.D.(1970)，分子生物學(xué)雜志，48，443-453]。使用GAP在下列條件下進(jìn)行DNA序列的比較GAP創(chuàng)造罰值為5.0，GAP延展罰值為0.3，與如SEQ ID No.1所示的DNA序列或得自大腸桿菌DSM 9965中質(zhì)粒的DNA序列的編碼區(qū)域相比，DNA序列的編碼區(qū)域所表現(xiàn)出的同一性程度最好至少為70％，優(yōu)選至少為80％，尤其至少為90％。
上述ii)中所述的雜交意指，在某些特殊條件下類似的DNA序列與編碼氨肽酶的DNA序列的相同探針進(jìn)行雜交，詳細(xì)描述見以下“材料與方法”章節(jié)。
一般而言，類似的DNA序列與DNA序列是高度同源的，例如同如SEQ IDNo.1所示的DNA序列或得自大腸桿菌DSM 9965中質(zhì)粒、編碼本發(fā)明中氨肽酶的DNA序列至少有60％的同源性，如與所述DNA序列比較至少為65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或甚至至少95％的同源性。
上述iii)中所述的同源性可通過兩個(gè)序列間同一性程度(標(biāo)志第一個(gè)序列由第二個(gè)序列衍生)來確定。可通過技術(shù)領(lǐng)域所熟知的計(jì)算機(jī)程序來適宜地確定該同源性，如GCG程序包中所提供的GAP[Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)，分子生物學(xué)雜志，48，443-453]。使用GAP在下列條件下進(jìn)行DNA序列的比較GAP創(chuàng)造罰值為5.0，GAP延展罰值為0.3，與如SEQ ID No.1所示的DNA序列或得自大腸桿菌DSM 9965中質(zhì)粒的DNA序列的編碼區(qū)域相比，DNA序列的編碼區(qū)域所表現(xiàn)出的同一性程度最好至少為70％，優(yōu)選至少為80％，尤其至少為90％。
與上述特性iv)相聯(lián)系的術(shù)語“衍生自”不僅指由菌種A01568所產(chǎn)生的氨肽酶，而且指由分離自菌種A01568的DNA序列所編碼并在用該DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物中產(chǎn)生的氨肽酶?？赏ㄟ^如以下“材料與方法”章節(jié)中所述的方法來確定免疫反應(yīng)性。
本發(fā)明的進(jìn)一個(gè)方面涉及攜帶本發(fā)明DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體，含該DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的細(xì)胞，和表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的生產(chǎn)方法，該方法包括在允許該酶生成的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收酶。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供富含本發(fā)明35kDa氨肽酶的酶制劑。
另外，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物，它含有本發(fā)明表現(xiàn)氨肽酶活性的酶。該組合物可以和其它酶組合，例如與解淀粉酶和常規(guī)性面包改進(jìn)劑組合。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明35kDa氨肽酶的烘烤產(chǎn)品和冷凍面團(tuán)的制備方法。
最后，本發(fā)明涉及對(duì)本發(fā)明35kDa氨肽酶的利用。本發(fā)明的酶或含這種酶的本發(fā)明組合物可用于改進(jìn)烘烤產(chǎn)品的味道、外皮色澤和面心結(jié)構(gòu)，以及改進(jìn)冷凍面團(tuán)的粘性。本發(fā)明的氨肽酶還可優(yōu)先用于生產(chǎn)無苦味的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，還可用于很多用途，包括含多種物質(zhì)的蛋白質(zhì)的降解或修飾；對(duì)接觸透鏡的清洗、制備食物和動(dòng)物飼料等。
可通過通常方法來分離本發(fā)明中編碼表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的DNA序列，包括—在適宜的載體中從米曲霉中克隆出DNA文庫，—用所述載體轉(zhuǎn)化適宜的酵母宿主細(xì)胞，—在適宜的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以表達(dá)由文庫中克隆所編碼的令人感興趣的任何酶，—通過測(cè)定該克隆所產(chǎn)生的酶的任何氨肽酶活性來篩選陽性克隆，—從該克隆中分離編碼酶的DNA。
通常方法進(jìn)一步參見WO 93/11249，其內(nèi)容附此作為參考。對(duì)篩選方法的更詳細(xì)描述見以下實(shí)施例3。
微生物來源例如，通過篩選供體生物的cDNA文庫和選擇表達(dá)適當(dāng)酶活性(即由酶水解亮氨酸-7酰胺基-4-甲基香豆素的能力所定義的氨肽酶活性)的克隆，來分離出編碼本發(fā)明中氨肽酶的DNA序列。而后可通過標(biāo)準(zhǔn)程序從克隆中分離適當(dāng)?shù)腄NA序列，例如在實(shí)施例1中所述。
供體生物可以是米曲霉(ATCC No.20386)的真菌，如美國(guó)專利No.3,914,436所述。
把編碼本發(fā)明中氨肽酶的完整全長(zhǎng)DNA序列轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株中，其包括在表達(dá)質(zhì)粒pYES 2.0(Invitrogen)中。該菌種由本發(fā)明人根據(jù)有關(guān)“用于專利程序用途的國(guó)際微生物保藏認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約”保藏于theDeutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Branschweig，德國(guó)(DSM)。
保藏日期11.05.95保藏者文獻(xiàn)NN49001DSM名稱大腸桿菌DSM No.9965作為布達(dá)佩斯條約下的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH根據(jù)上述條約的條例和規(guī)章來實(shí)施永久性的保藏，特別參見條例9。在本專利申請(qǐng)尚未授權(quán)期間，被美國(guó)專利及商標(biāo)局的專員授權(quán)的人員，可以得到兩種保藏菌種，按照37 C.F.R.Par.1.14和35U.S.C.Par.122。另外，根據(jù)EPC的條例28，上述保藏菌種滿足了歐洲有關(guān)微生物專利申請(qǐng)的要求。
上述保藏菌種代表了所分離菌種基本純化的培養(yǎng)物。在某些國(guó)家中，按該外國(guó)專利法可得到保藏物，所述國(guó)家中本申請(qǐng)的對(duì)應(yīng)申請(qǐng)或其派生申請(qǐng)已提交。不過，應(yīng)該理解，得到所保藏的菌種并不是對(duì)實(shí)施本標(biāo)題發(fā)明的許可，政府行為所授權(quán)的專利權(quán)并沒有廢止。
可通過標(biāo)準(zhǔn)方法從上述保藏菌種中分離出表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的編碼DNA序列。
我們預(yù)期，編碼同源酶的DNA序列(即類似的DNA序列)可得自其它微生物。例如，可通過類似篩選另一種微生物的cDNA文庫來衍生出該DNA序列，特別是真菌，如曲霉屬的菌種，尤其是刺孢曲霉(A.aculeatus)或黑曲霉，木霉屬的菌種，尤其是T.reesei、綠色木霉(T.viride)、T.longibrachiatum或康寧木霉(T.koningii)，或鐮孢屬的菌種，尤其是尖鐮孢(F.oxysporum)，或腐殖霉屬的菌種。
另外，依據(jù)人們熟知的程序，通過根據(jù)此處披露的DNA序列所制備的合成性寡核苷酸探針，可以從適宜來源(例如上述任何生物)的DNA中方便地分離出編碼表現(xiàn)本發(fā)明氨肽酶活性的酶的DNA序列。比如，依據(jù)如SEQ IDNos.3-5所示的任何寡核苷酸序列或如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或其任何適宜的亞序列，可制備出適宜的寡核苷酸針。
隨后可將該DNA序列插入重組表達(dá)載體中。其可以是能方便進(jìn)行重組DNA程序處理的任何載體，而載體的選擇常常取決于其所要引入的宿主細(xì)胞。于是，該載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體而存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制(如質(zhì)粒)。另外，該載體可以是這樣的載體，當(dāng)引入宿主細(xì)胞中時(shí)，其可整合入宿主細(xì)胞基因組中并同其整合入的染色體一起進(jìn)行復(fù)制。
在載體中，編碼氨肽酶的DNA序列可操作性連接到適宜的啟動(dòng)子和終止子序列上。啟動(dòng)子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任意DNA序列，可以衍生自編碼蛋白質(zhì)(對(duì)宿主細(xì)胞既可是同源的也可是異源的)的基因。用于將編碼氨肽酶的DNA序列、啟動(dòng)子和終止子分別連接起來及將其插入適宜載體中的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的[例如可參見Sambrook等人，(1989)，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，紐約]。
用編碼本發(fā)明中酶的DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞，特別是真菌細(xì)胞，如酵母或絲狀真菌細(xì)胞。該細(xì)胞尤其可以是曲霉屬的菌種，最好為米曲霉或黑曲霉?？梢酝ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成及其轉(zhuǎn)化、隨后通過熟悉的方式進(jìn)行細(xì)胞壁再生，這樣來進(jìn)行真菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。使用曲霉屬作為宿主微生物如歐洲專利238 023所述(Novo Nordisk A/S)，其內(nèi)容附錄于此作參考。該宿主細(xì)胞也可以是酵母細(xì)胞，如酵母菌屬的菌種，特別是釀酒酵母、克魯弗酵母(S.kluyveri)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)；裂殖酵母屬的菌種，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；漢遜酵母屬的菌種；畢赤酵母屬的菌種；Yarrowia的菌種，如Y.lipolytica；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的菌種，如乳酸克魯維酵母(K.lactis)。
生產(chǎn)本發(fā)明酶的方法本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的酶的生產(chǎn)方法，其中將用酶的DNA編碼序列所轉(zhuǎn)化的適宜的宿主細(xì)胞在準(zhǔn)許酶生成的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)物中回收所生成的酶。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任意適于所述宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基。所表達(dá)的氨肽酶可方便地分泌入培養(yǎng)基中，并通過熟知的程序進(jìn)行回收，其中包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，通過鹽法(如硫酸銨)、隨后通過色譜程序(如離子交換色譜、親合色譜等)沉淀出培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)類成分。
酶制劑本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及可用于降低食料中蛋白質(zhì)及/或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物苦味的酶制劑。
富集本發(fā)明酶的酶制劑例如可以是含有多種酶活性的酶制劑，例如含多種生成蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物之酶的酶制劑。富集的制劑可以是Flavourzyme(購自Novo Nordisk A/S)。Flavourzyme是一種衍生自米曲霉中的蛋白酶/肽酶復(fù)合體，開發(fā)來進(jìn)行蛋白質(zhì)的水解。
根據(jù)該酶制劑待應(yīng)用的用途，本發(fā)明的氨肽酶可結(jié)合下述其它酶類。
在本說明書中，術(shù)語“富集”意指該酶制劑的氨肽酶活性已經(jīng)增長(zhǎng)了，例如富集因子至少為1.1，優(yōu)選在1.1及10之間，更優(yōu)選在2及8之間，特別是4及6之間，原因在于添加了通過上述方法所制備的本發(fā)明的酶。
另外，用表現(xiàn)出氨肽酶活性的酶所富集的酶制劑是這樣的制劑，其包括作為主要酶成分的本發(fā)明的酶，如單成分酶制劑。
可依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法來制備該酶制劑，形式可以是液體或是干制劑。例如，酶制劑的形式可以是顆?；蛭㈩w粒狀的?？梢罁?jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法來穩(wěn)定包含在該制劑中的酶。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及含有本發(fā)明氨肽酶的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物。所述組合物可進(jìn)一步含有選自解淀粉酶在內(nèi)的酶類，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、生麥α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、酸穩(wěn)定性淀粉酶和1，6-支鏈淀粉酶。
這類酶可購于Novo Nordisk A/S，如得自黑曲霉菌種的AMGTM(淀粉葡糖苷酶)，得自米曲霉菌種的FungamylTM(真菌淀粉酶)，得自嗜熱脂肪芽孢桿菌的NovamylTM(生麥淀粉酶)。
本發(fā)明的組合物還可含有一種或多種附加酶。這類酶的實(shí)例包括纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶(用于戊聚糖的部分水解，這能增加面團(tuán)的延展性)、脂肪酶(用于改變面團(tuán)或面團(tuán)構(gòu)成中存在的脂質(zhì)以軟化面團(tuán))、過氧化物酶(用于改善面團(tuán)的稠度)、氧化酶(如葡糖氧化酶)、漆酶、木聚糖酶、蛋白酶(用于面筋弱化，特別是當(dāng)使用硬度小麥面粉時(shí))。
其它酶組分優(yōu)選為微生物來源的，可通過上述使用的常規(guī)技術(shù)得到。
本發(fā)明中所使用的酶類可以是適宜的任何形式，例如干粉或顆粒形式(特別是無塵顆粒)、液體形式(特別是穩(wěn)定性液體)或被護(hù)性酶形式?？扇鏤S 4,106,991和US 4,661,452(均為Novo Industri A/S)所披露的來生成顆粒，用本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的方法來有選擇地進(jìn)行涂敷。例如，可依據(jù)既成方法，通過加入營(yíng)養(yǎng)上可接受的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定酶制劑，如糖、糖醇或另外的多羥基化合物、乳酸或另外的有機(jī)酸?？梢罁?jù)歐洲專利238,216所披露的方法來制備被護(hù)性酶。
一般來說，為了在預(yù)混物或面粉中進(jìn)行添加，酶最好是干產(chǎn)品的形式，如無塵顆粒，而為了與液體一同添加，最好是液態(tài)形式的。
除此之外或作為其它酶組分的替代品，改善面團(tuán)及/或面包的組合物可含有常規(guī)使用的烘烤劑，例如一種或多種下列組成奶粉(提供外皮色澤)、面筋(以改善弱度面粉中的氣體滯留)、乳化劑(以改善面團(tuán)的延展性并在某種程度上改善做出的面包的稠度)、顆粒性脂肪(用于面團(tuán)的軟化和面包的稠度)、氧化劑(添加以加強(qiáng)面筋的結(jié)構(gòu)；如抗壞血酸、溴酸鉀、碘化鉀或過硫酸銨)、氨基酸(如半胱氨酸)、糖、鹽類(如氯化鈉、乙酸鈣、硫酸鈉或硫酸鈣，用來使面團(tuán)更加堅(jiān)固)、面粉或定粉。還可以依據(jù)本發(fā)明的方法將這些組分直接加入到面團(tuán)之中。
適當(dāng)?shù)娜榛瘎?shí)例有甘油一酯或甘油二酯、甘油一酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、甘油一酯的乳酸酯、甘油一酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸鹽、磷脂和卵磷脂。
本發(fā)明的面包和/或面團(tuán)改善組合物通常含在面團(tuán)中，其含量0.01-5％，尤其是0.1-3％。
依據(jù)本發(fā)明的方法，其中將本發(fā)明具有氨肽酶活性的酶與上述其它酶類有選擇地組合起來，可用于面團(tuán)和/或烘烤產(chǎn)品的制備，可將酶類原樣加入面團(tuán)制備于其中的混合物或待制備面團(tuán)用的任何組分(如面粉)中。另外，可將酶類作為上述面團(tuán)和/或面包改善組合物的組分進(jìn)行添加，既可以加入面粉中也可加入其它面團(tuán)組分之中，或直接加入到制備面團(tuán)用的混合物中。
在本發(fā)明方法中所使用的酶劑量應(yīng)適用于所述面團(tuán)的特性和組成以及所用酶類的特性。一般來說，酶制劑的添加量為每kg面粉中0.01-1000mg酶蛋白質(zhì)，優(yōu)選為每kg面粉中0.1-100mg酶蛋白質(zhì)，更優(yōu)選為每kg面粉中0.1-10mg酶蛋白質(zhì)。
至于酶的活性，具有氨肽酶活性的已知單成分酶有選擇地同其它酶相組合使用，用于對(duì)面粉或烘烤產(chǎn)品的外皮色澤進(jìn)行有益的改善，其適當(dāng)?shù)膭┝咳Q于所涉及的酶和酶底物。最佳劑量依面粉或酵母類型和烘烤過程的不同而有所變化。有經(jīng)驗(yàn)的人士可根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的方法來確定適宜的酶單位劑量。
然而，依據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明表現(xiàn)出氨肽酶活性的酶的添加劑量為每kg面粉30-1000 LAPU，優(yōu)選為50-500 LAPU，尤其為80-300 LAPU，如約為100 LAPU。LAPU定義如下。
解淀粉酶的添加量一般為每kg面粉1-50 FAU。一個(gè)FAU(真菌α-淀粉酶單位)是指每小時(shí)分解5.26g淀粉所用的酶量(Merk，Amylumsolubile Erg.B.6，BAch 9947275)，使用的是Novo Nordisk標(biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)定α-淀粉酶的活性。對(duì)Novo Nordisk分析方法(AF216)的詳細(xì)描述可索取得到。
生麥淀粉酶一般添加量為每kg面粉1-1000 MANU(生麥淀粉酶Novo單位)。一個(gè)MANU被定義為標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘水解i微摩爾麥芽三糖所用的酶量。該分析方法(AF 203)可索取得到。
當(dāng)依據(jù)本發(fā)明的方法添加一種或多種附加的酶活性時(shí)，這些活性可以分別加入或者同具有外肽酶活性的燒烤組分酶一起加入，可選擇性作為本發(fā)明面包和/或面團(tuán)改善組合物的組成。其它酶活性可以是上述任意的酶，可依據(jù)既成的烘烤做法來確定添加劑量。
如上所述，表現(xiàn)出氨肽酶活性的酶與上述其它酶選擇性組合使用，可添加至任何面團(tuán)組分的混合物中，加入面團(tuán)，或加入面團(tuán)中所包括的任何組分中，換句話說，酶可以在面團(tuán)制備的任意步驟加入，在適宜之處可分一步、兩步或多步進(jìn)行添加。
對(duì)于擬議中的面團(tuán)和/或烘烤產(chǎn)品來說，可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▉韺?shí)施對(duì)面團(tuán)和/或烘烤物的處理，一般包括以下步驟揉捏面團(tuán)，對(duì)面團(tuán)進(jìn)行一次或多次試驗(yàn)處理，在適宜的條件下烘烤產(chǎn)品，即適宜的溫度和足夠的烘烤時(shí)間。例如，可通過常規(guī)的直接面團(tuán)過程、酸面團(tuán)過程、面團(tuán)過夜方法、低溫和長(zhǎng)期發(fā)酵方法、面團(tuán)冷凍方法、Chorleywood面包過程或發(fā)面及面團(tuán)過程來制備面團(tuán)。
通過本發(fā)明方法所制備的面團(tuán)和/或烘烤產(chǎn)品一般使用的是小麥粉或面粉，可有選擇地同其它類型的粉組合使用，如玉米粉、黑麥粉、燕麥粉、大豆粉、高粱粉或土豆粉。
在本說明書中，術(shù)語“烘烤產(chǎn)品”意指任何制備于面粉的產(chǎn)品，既可以是柔軟的也可以是松脆特性的。由本發(fā)明優(yōu)先制作的烘烤產(chǎn)品的實(shí)例可以是白色、淡色或深色類型的，包括面包(尤其是白色、全粉或黑麥面包)、典型形式為條形或卷形、法國(guó)小圓形面包、皮塔面包、油炸三明治、蛋糕、薄煎餅、餅干、松脆面包等等。
本發(fā)明的面團(tuán)可以是上述任意類型的，可以是新鮮或冷凍的。
冷凍面團(tuán)的制備如K.Kulp和K.Lorenz所述，見“冷凍和冷藏面團(tuán)及稀面糊”。當(dāng)使用本發(fā)明中的氨肽酶用于冷凍面包時(shí)，其味道、外皮色澤和松軟性都得到了改善。
如上所述，顯然，本發(fā)明中的面團(tuán)一般是發(fā)酵的面團(tuán)或要進(jìn)行發(fā)酵處理的面團(tuán)?？梢砸远喾N方式使面團(tuán)發(fā)酵，例如加入小蘇打等或曲子(發(fā)酵的面團(tuán))，但優(yōu)選是通過加入適當(dāng)?shù)慕湍概囵B(yǎng)物來發(fā)酵面團(tuán)，如釀酒酵母培養(yǎng)物(即面包師傅所使用的酵母)?？梢允褂萌魏紊逃眯葬劸平湍妇N。
如上所述，本發(fā)明還涉及一種預(yù)混物，形式例如可為面粉組合物，用于面團(tuán)和/或由面團(tuán)制備的烘烤產(chǎn)品，該預(yù)混物含有本發(fā)明表現(xiàn)氨肽酶活性的酶以及上述其它選擇性酶?？赏ㄟ^將相關(guān)的酶或含有酶的本發(fā)明面包和/或面團(tuán)改進(jìn)用組合物同適宜的載體(如面粉、淀粉、糖或鹽)進(jìn)行摻混來制備出預(yù)混物。該預(yù)混物可含有其它面團(tuán)和/或面包改進(jìn)用添加劑，如任意的添加劑，包括上述的酶。
對(duì)本發(fā)明35 kDa氨肽酶的利用利用本發(fā)明的酶來制備烘烤產(chǎn)品本發(fā)明中的酶或酶制劑可用于烘烤業(yè)，例如用來減弱面粉的面筋成分以獲得所謂硬麥面粉的軟化。
不過，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的氨肽酶并不能降解面筋的網(wǎng)絡(luò)，而這是在將蛋白酶用于制備烘烤產(chǎn)品時(shí)所觀察到現(xiàn)象。于是，面團(tuán)的特性和面心結(jié)構(gòu)并沒有受到影響。
另外，當(dāng)制備烘烤產(chǎn)品時(shí)在面團(tuán)或面團(tuán)成分中加入本發(fā)明的35 kDa氨肽酶，烘烤產(chǎn)品的味道、外皮色澤和/或面心結(jié)構(gòu)和/或外皮色澤將得到顯著改善，如實(shí)施例13所示。
再者，本發(fā)明中的酶可改善面團(tuán)的粘性。
添加本發(fā)明中的酶可使得烘烤產(chǎn)品具有酵母類型的味道，提供一種“新烘烤性”面包的香味。這使得本發(fā)明著重研究了發(fā)面團(tuán)系統(tǒng)，其中添加酶可以減少發(fā)面團(tuán)發(fā)酵的時(shí)間而無酵母味道降低的副作用，在速制面團(tuán)法(大多數(shù)歐洲用的過程)中酶可以提供酵母味道，而一般以該過程制備的產(chǎn)品會(huì)缺少這種味道。
在不局限于任何理論的情況下，我們堅(jiān)信，當(dāng)具有外肽酶活性的單成分酶與解淀粉酶組合使用時(shí)，就可以進(jìn)一步改善烘烤產(chǎn)品的味道和/或外皮色澤，尤其是與能夠從面粉或面團(tuán)其它組成中釋放還原糖分子的解淀粉酶組合使用時(shí)。還原糖在面團(tuán)中的數(shù)量增長(zhǎng)可以增強(qiáng)烘烤過程中發(fā)生的Maillard反應(yīng)，因此可進(jìn)一步改善烘烤產(chǎn)品的味道和外皮色澤。
利用本發(fā)明的酶來降低苦味本發(fā)明的酶或酶制劑可用于降低食料中蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味。
依據(jù)本發(fā)明還可以推測(cè)在從蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中產(chǎn)生出游離氨基酸。在這方面，谷氨酸可以提高食品的味道。
所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以是動(dòng)物或植物來源的。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所水解的蛋白質(zhì)是酪蛋白或大豆蛋白。
蛋白質(zhì)可用來生成如奶酪的食料和含可可的食料。
盡管用本發(fā)明的酶所富集的氨肽酶和酶制劑可與特別優(yōu)先用于生成無苦味的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，本發(fā)明的氨肽酶還可以用于多種的工業(yè)用途，包括降解或修飾含蛋白質(zhì)的多種物質(zhì)(如細(xì)胞壁)。諸如伸展蛋白的某些蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞壁的組成成分。因而氨肽酶可以促進(jìn)植物細(xì)胞壁的降解或修飾。
可依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法來確定本發(fā)明的酶制劑劑量和使用該制劑的其它條件。
從植物中提取油依據(jù)本發(fā)明的酶制劑可以用來從植物源(如橄欖和油菜)中提取油，或者從不同的水果(如蘋果、梨和柑橘)中榨取汁液。它還可以用于酒行業(yè)來防止混濁的形成，特別是在白酒行業(yè)。再者，它還可用來修飾和降解蛋白質(zhì)，例如用來降低蛋白質(zhì)引起或部分引起的粘度，或者用來促進(jìn)涉及蛋白質(zhì)的發(fā)酵過程，或者用來改善蛋白質(zhì)和其它營(yíng)養(yǎng)物的可消化性。
在制備食品和飼料中的應(yīng)用氨肽酶制劑還可以用于食品和飼料業(yè)中以改善蛋白質(zhì)的可消化性。例如，可在動(dòng)物飼料中加入該酶或酶制劑，或者用來處理動(dòng)物飼料，尤其是小豬或家禽的飼料。
另外，本發(fā)明的酶或酶制劑可用于從諸如植物蛋白質(zhì)(如大豆、豌豆、羽扇豆或油菜籽蛋白質(zhì))、乳(如酪蛋白)、肉類蛋白質(zhì)或魚類蛋白質(zhì)中制造蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。氨肽酶可以用于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物以改善溶解能力、稠度或發(fā)酵能力，用來降低抗原性或用于其它用途來制造食品、飼料或醫(yī)藥產(chǎn)品。氨肽酶可以單獨(dú)使用或司其它氨肽酶或其它酶類(如外肽酶)一起使用。將本發(fā)明的氨肽酶同富含外肽酶的酶一起使用可改善蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的味道。
再者，該酶或酶制劑可用于魚或肉類的加工中，例如可用來改變組織結(jié)構(gòu)和/或粘性。
在釀造過程中應(yīng)用該酶制劑還可以用來促進(jìn)發(fā)酵過程，譬如對(duì)大麥、麥芽和其它原材料的酵母發(fā)酵過程以制造諸如啤酒的產(chǎn)品。
用來制造原生質(zhì)體該酶制劑可用來從真菌中制造原生質(zhì)體。
用來生產(chǎn)肽該酶制劑可用來從蛋白質(zhì)中生產(chǎn)肽，其優(yōu)勢(shì)在于它使用了基本不含其它解蛋白活性的克隆化酶。
用來降解蛋白質(zhì)另外，該氨肽酶制劑可用來降解蛋白質(zhì)以促進(jìn)不同產(chǎn)品的純化或濃集，例如用來純化或濃集樹膠(如瓜耳膠、黃原膠)，用來進(jìn)行絲的脫膠，或者改善絨毛的質(zhì)量。
用來清洗接觸透鏡該酶或酶制劑還可用來清洗接觸透鏡。
本發(fā)明將在如下的實(shí)施例中進(jìn)行詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例絕不是限制本發(fā)明所要求的范圍。
方法和材料材料供體生物米曲霉A01568(如美國(guó)專利No.3,914,436所述)宿主生物大腸桿菌MC1061[Meissner等人，(1987)，美國(guó)自然科學(xué)學(xué)術(shù)匯編，84，4171-4176cDNA文庫菌種]
釀酒酵母W3124[van den Hazel等人，(1992)，歐洲生物化學(xué)雜志，207，277-283]活性篩選菌種粟酒裂殖酵母Broker等人，(1989)，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)通訊，248，105-110其它生物米曲霉A1560[Christensen等人，(1988)，生物/技術(shù)6，1419-1422]。
質(zhì)粒pYES 2.0轉(zhuǎn)化載體(Invitrogen)pHD414曲霉表達(dá)載體是質(zhì)粒p775的衍生物(如歐洲專利238,023所述)。pHD414的構(gòu)建進(jìn)一步描述于WO 93/11249中。pHD414含有黑曲霉葡糖淀粉酶終止子和米曲霉TAKA淀粉酶啟動(dòng)子。
pHD423是帶有新的多接頭的pHD414的微生物(如WO 94/20611所述)。
pUC18表達(dá)載體[Sambrook等人，(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版；冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約]。
pC1EXP3含有編碼本發(fā)明35kDa氨肽酶的1.4kb cDNA插入子的質(zhì)粒(見實(shí)施例3和SEQ ID No.1)。
pC1EXP4含有cDNA序列的質(zhì)粒，其比pC1EXP3 1.4kb cDNA插入子短120bp(見實(shí)施例10和SEQ ID No.12)。
p3SR2冠構(gòu)曲霉amdS+基因攜帶質(zhì)粒[Christensen等人，(1988)，生物/技術(shù)，6，1419-1422]。
pP1酵母表達(dá)載體，其為含有ADH啟動(dòng)子和URA 3(選擇性標(biāo)記物)的大腸桿菌/粟酒裂殖酵母穿梭載體[Broker等人，(1989)，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)通訊，248，105-110]。
引物通用pUC引物[Sambrook等人，(1989)，如上]在PCR反應(yīng)中所使用引物的推斷序列s25’-GAR ACI GTI CAR AAY CTI AT-3’s35’GAY AAR AAR AAY TTY GAW ACI GT-3’as15’TCI ACR TTR TCI GTI ATI ATY TCI AT-3’(s＝意義，as＝反義)A＝腺嘌呤G＝鳥嘌呤C＝胞嘧啶T＝胸腺嘧啶I＝脫氧肌苷Y＝C或TR＝A或GW＝A或T正向和反向pYES引物(Invitrogen)酶賴氨酸特異性蛋白酶Novozym234(Novo Nordisk A/S)Alcalase(Novo Nordisk A/S)Neutrase (Novo Nordisk A/S)35kDa氨肽酶的肽(見SEQ ID No.6-11)N-末端對(duì)真實(shí)和重組氨肽酶N-末端的直接序列測(cè)定表明，兩種酶具有相同的N-末端氨基酸序列，這表明對(duì)重組酶進(jìn)行了與真實(shí)酶相同的解蛋白處理。Tyr-Pro-Asp-Ser-Val-Gln-His-Xaa-Glu-Thr-Val-Gln-Asn-Leu-Ile-s2 ------>Lys-Ser-Leu-Asp-Lys-Lys-Asn-Phe-Glu-Thr-Val-Leu-Gln-Pro-s3------>(Xaa是糖基化的Asn殘基)通過用賴氨酰特異性蛋白酶進(jìn)行裂解，從衍生自氨肽酶S-羧甲化樣品的肽中得到了下列肽序列。肽1Tyr-Pro-Asp-Ser-Val-Gln-His-Xaa-Glu-Thr-Val-Gln-Asn-Leu-Ile-Lys肽2Gly-Val-Thr-Val-Glu-Pro-Phe-Lys肽3Val-Ile-Val-Asp-Ala-Tyr-Cys-Thr-Ile-Pro-Thr-Val-Asp-Ser-Lys肽4Gly-Thr-Thr-Asp-Ala-Gly-Lys-Pro-Glu-Ser-Ile-Glu-Ile-Ile-Thr-<-------as1Asp-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Leu-Thr-Lys肽5Asn-Phe-Glu-Thr-Val-Leu-Gln-Pro-Phe-Ser-Glu-Phe-His-Asn-Arg-Tyr-Tyr-Lys(重疊和擴(kuò)展N-末端序列)培養(yǎng)基和其它材料STC1.2 M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl2BSA(Sigma，H25型)亮氨酸-7酰胺-4-甲基香豆素(Sigma)PEG 4000(聚乙二醇，分子量＝4,000)(BDH，英國(guó))SequenaseKit(美國(guó)生物化學(xué)公司)Hybond-N尼龍膜(Amersham，美國(guó))Q-瓊脂糖(Pharmacia Tm)Superdex 200 TmAmicon膜VG Analytical Tofspecα-氰基-4-羥基肉桂酸(Aldrich，Steinheim，德國(guó))YPD10g酵母膏，20g胨，加水至810ml。高壓滅菌，加入90ml20％的葡萄糖(無菌過濾)。
10x基礎(chǔ)鹽66.8g酵母氮堿。100g琥珀酸，60g NaOH，加水到1000ml，無菌過濾。
SC-URA90ml 10x基礎(chǔ)鹽，22.5ml的20％酪蛋白氨基酸，9ml 1％的色氨酸，加水至806ml，高壓滅菌，加入3.6ml 5％的蘇氨酸和90ml20％的葡萄糖或20％的半乳糖。
SC-H培養(yǎng)液7.5g/l無氨基酸的酵母氮堿。11.3g/l的琥珀酸，6.8g/l的NaOH，5.6g/l無維生素的酪蛋白氨基酸，0.1g/l的色氨酸。121℃下高壓滅菌20分鐘。之后，在每100ml培養(yǎng)液中加入10ml 30％的半乳糖液，5ml 30％的葡萄糖液和0.4ml 5％的蘇氨酸液。
SC-H瓊脂7.5g/l無氨基酸的酵母氮堿，11.3g/l的琥珀酸，6.8g/l的NaOH，5.6g/l的無維生素的酪蛋白氨基酸，0.1g/l的色氨酸和20g/l瓊脂(Bacto)。121℃下高壓滅菌20分鐘。之后，在每450ml瓊脂中加入55ml 22％的半乳糖液，1.8ml 5％的蘇氨酸液。
YNB-1瓊脂3.3g/l的KH2PO4，16.7g/l的瓊脂，pH調(diào)至7。121℃下高壓滅菌20分鐘。之后，在每450ml瓊脂中加入25ml 13.6％的無氨基酸的酵母氮堿，25ml 40％的葡萄糖液，1.5ml 1％的L-亮氨酸液和1.5ml 1％的組氨酸液。
YNB-1培養(yǎng)液組成同YNB-1瓊脂一樣，但無瓊脂。
基本平皿[Cove生物化學(xué)及生物物理記述113(1996)51-56]含有1.0M蔗糖，pH7.0，10mM乙酰胺(作為氮源)和20mM的CsCl。
乳清蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用Alcalase和Neutrase水解乳清，再用水稀釋，直到蛋白質(zhì)的含量為整體溶液的8％(w/w)。
方法RNA分離通過用硫氰酸胍提取隨后通過5.7M CsCl墊[Chirgwin等人，(1979)，生物化學(xué)，18，5294-5299]進(jìn)行超離心，從冷凍、粉狀的米曲霉A01568菌絲體中制備出整體RNA。通過寡(dT)-纖維素親和色譜方法來實(shí)施聚(A)+RNA[Aviv，H，和Leder P，(1972)，美國(guó)自然科學(xué)學(xué)術(shù)匯編，69，1408-1412]。
cDNA的合成從5μg米曲霉聚(A)RNA中合成雙鏈cDNA，如Kofod等人所述，生物化學(xué)雜志，(1994)，269，29182-29189，不同點(diǎn)在于在第一次鏈合成中加入25ng的隨機(jī)六核苷酸引物(Pharmacia，瑞典)。
cDNA文庫的構(gòu)建進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，如Kofod等人所述，生物化學(xué)雜志，(1994)，269，29182-29189。
釀酒酵母的轉(zhuǎn)化為了確保所有的細(xì)菌克隆都能在酵母中得到檢測(cè)，將比源庫池中的細(xì)菌克隆數(shù)量高出5倍的酵母轉(zhuǎn)化體數(shù)目作為一種限制。
將來自各個(gè)庫池的1μl等分試樣的純化質(zhì)粒DNA(100ng/μl)電穿孔(200Ω，1.5kV，24μF)至40μl的感受態(tài)釀酒酵母細(xì)胞中(在500ml YPD中OD600＝1.5，在冷蒸餾水中沖洗2次，在1M的冷山梨醇中沖洗1次，在0.5ml 1M的山梨醇中重懸浮，Becker和Guarante，1991)。添加1ml 1M的冷山梨醇之后，將80μl等分試樣涂敷在SC+葡萄糖-尿嘧啶的平皿上而達(dá)到250-400c.f.u./平皿，在30℃下溫育3-5天。
粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化對(duì)粟酒裂殖酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如Broker(1987)所述，生物技術(shù)，5，51-517。
從米曲霉中提純35kDa氨肽酶將1g米曲霉A01568發(fā)酵上清液的冷凍、干燥粉末溶解于100ml的Tris-乙酸緩沖液中(25mM，pH8)。離子強(qiáng)度為2mSi。將懸浮液通過45μ微孔過濾器進(jìn)行過濾。過濾后的溶液上200ml的陰離子交換色譜柱(填充有Q-瓊脂糖)，其用Tris-乙酸緩沖液進(jìn)行過平衡。從流出液中收集堿性蛋白酶—即主要的內(nèi)蛋白酶(等電點(diǎn)為8)。用Tris-乙酸緩沖液來沖洗色譜柱，直到流出液中再無紫外線吸附物質(zhì)出現(xiàn)。
用線性鹽梯度來洗脫所束縛的蛋白質(zhì)，即在Tris-乙酸緩沖液(pH為8)中使用0-0.5M的NaCl，10柱體積，流速為4ml/分鐘。匯集含有氨肽酶活性(見下)的級(jí)分，用Tris-乙酸緩沖液進(jìn)行透析(25mM，pH為6)。
將透析后含有活性的庫池pH值調(diào)至6，離子強(qiáng)度至2mSi，上50ml的高性能Q-瓊脂糖柱(用25mM的Tris-乙酸緩沖液平衡，pH為8)進(jìn)行陰離子交換色譜分析。沖洗該柱直到流出液中的紫外線吸附物質(zhì)在280nm處低于0.05。用20柱體積的線性鹽梯度(從0-0.5M NaCl)來洗脫所束縛的活性，流速為2ml/分鐘。匯集含有氨肽酶活性的級(jí)分，用50mM-乙酸鈉緩沖液(pH為6)，超過濾進(jìn)行濃縮。
將含有氨肽酶活性的2ml濃縮庫池上Superdex 200Tm柱，該柱用含0.1M的NaCl的50mM乙酸鈉緩沖液平衡(pH為6)。進(jìn)行凝膠過濾，流速為0.5ml/分鐘。匯集含有氨肽酶活性的樣品，利用Amicon膜進(jìn)行超過濾濃縮，截?cái)嘀禐?0kDa。
測(cè)定米曲霉氨肽酶的N-末端和內(nèi)部肽的氨基酸序列用賴氨酰-特異性蛋白酶來消化純化的天然氨肽酶的S-羧甲基化樣品，通過反相高壓液體色譜法(HPLC)來分離所得到的肽，并如Matsudaria所示進(jìn)行序列測(cè)定，見“用于微序列測(cè)定的蛋白質(zhì)和肽提純的實(shí)用指南”，3-88，學(xué)術(shù)出版公司，圣迭哥，加利福尼亞，根據(jù)生產(chǎn)商說明書參見應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的473A序列測(cè)定儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。
用于氨基酸序列測(cè)定的試劑和溶劑均來自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Foster城，加利福尼亞)。
PCR引物的設(shè)計(jì)PCR引物的設(shè)計(jì)如Kofod等人所述，生物化學(xué)雜志，(1994)，269，29182-29189。
使用PCR進(jìn)行的氨肽酶cDNA探針的產(chǎn)生
利用每份500pmol所設(shè)計(jì)的引物，配合500pmol pYES 2.0多接頭引物(正向和反向)、DNA熱循環(huán)器(Landgraf，德國(guó))和2.5單位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer)，對(duì)來自cDNA文庫池的1μg雙鏈質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
實(shí)施30輪PCR反應(yīng)，每輪在94℃下變性反應(yīng)1分鐘，在55℃下退火2分鐘，在72℃下延伸3分鐘。
雙脫氧鏈終止法該方法實(shí)施如Sanger等人所述，(1977)，美國(guó)自然科學(xué)學(xué)術(shù)匯編，74，5463-5467，使用SequenaseKit和通用pUC引物。
利用Southern印跡分析來鑒定陽性cDNA克隆通過Southern印跡雜交來鑒定陽性克隆，使用的是0.5kb無規(guī)引物32P標(biāo)記性PCR產(chǎn)物或作為探針的35 kDa氨肽酶。雜交實(shí)施的條件為2×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％(w/v)SDS， 100μg/ml變性鮭精DNA，時(shí)間48小時(shí)，溫度65℃，隨后嚴(yán)格沖洗，2×SSC(2×15分鐘)，2×SSC，0.5％SDS(30分鐘)，0.2×SSC，0.5％SDS(30分鐘)，最好2×SSC(15分鐘)，溫度65℃[Sambrook等人，(1989)，如上述]。
電泳在0.7％瓊脂糖凝膠(來自SeaKem，F(xiàn)MC)上進(jìn)行電泳。
毛細(xì)管印跡法毛細(xì)管印跡法如Sambrook等人所述(1989，如上)，使用10×SSC轉(zhuǎn)移緩沖液。
對(duì)雜交克隆進(jìn)行嚴(yán)格沖洗在2×SSC中實(shí)施2×15分鐘的沖洗，在0.1×SSC、0.5％SDS中實(shí)施2×30分鐘的沖洗，在2×SSC中實(shí)施15分鐘的沖洗，溫度65℃。
米曲霉的轉(zhuǎn)化米曲霉的轉(zhuǎn)化如Christensen等人所述，(1988)，生物技術(shù)6，1419-1422。
曲霉屬的氨肽酶表達(dá)盒構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)程序從陽性大腸桿菌克隆中分離出質(zhì)粒DNA，并通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行分析。利用適宜的限制性內(nèi)切酶來剪切cDNA插入子，并連接到曲霉屬表達(dá)載體上。
米曲霉或黑曲霉的轉(zhuǎn)化(通用程序)將100ml YPD(Sherman等人，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1981)用米曲霉或黑曲霉的孢子接種，在37℃下震蕩溫育約2天。通過miracloth過濾來收獲菌絲體，用200ml 0.6M的MgSO4沖洗。將菌絲體懸浮在15ml1.2M的MgSO4·10mM NaH2PO4，pH＝5.8。將懸浮液在冰上冷卻，加入含120mg Novozym234的緩沖液1ml。5分鐘后，加入12mg/ml的BSA 1ml，在37℃下輕微攪拌，持續(xù)溫育1.5-2.5小時(shí)，直到在顯微鏡下檢測(cè)樣品可看到大量的原生質(zhì)體。
將懸浮液通過miracloth進(jìn)行過濾，把濾液轉(zhuǎn)移至無菌試管中，用5ml0.6M的山梨醇、100mM Tris-HCl、pH＝7.0重疊。在100g下離心15分鐘，從MgSO4墊的頂端收集原生質(zhì)體。在原生質(zhì)體懸浮液中加入2體積的STC，在1000g下將混合物離心5分鐘。將原生質(zhì)體丸粒重懸浮在3ml的STC中并再次制成丸粒。重復(fù)這一過程。
最后將原生質(zhì)體重懸浮在0.2-1ml的STC中。
將100μl的原生質(zhì)體懸浮液和5-25μg的適宜DNA在10μl的STC中進(jìn)行混合。將原生質(zhì)體和p3SR2(一種攜帶冠構(gòu)曲霉amdS基因的質(zhì)粒)。把混合液在室溫下放置25分鐘。加入0.2ml 60％的PEG 4000，10mM的CaCl2和10mM的Tris-HCl，pH7.5，仔細(xì)混合(兩次)，最后加入0.85ml的相同溶液并仔細(xì)混合。將混合液在室溫下放置25分鐘，在2500g下旋轉(zhuǎn)15分鐘，并在2ml 1.2M的山梨醇中重懸浮丸粒。再經(jīng)過一次沉淀之后，將原生質(zhì)體涂抹到適當(dāng)?shù)钠矫笊稀０言|(zhì)體涂抹到基本平皿上以抑制背景的生長(zhǎng)。在37℃下溫育4-7天之后挑選出孢子，涂抹為單菌落。重復(fù)該過程，在兩次重分離之后，將單菌落的孢子儲(chǔ)存為所定義的轉(zhuǎn)化體。
米曲霉轉(zhuǎn)化體的提純通過分生孢子在AmdS’-平皿(+0.01％Triton X-100)上并于30℃下在YPM中生長(zhǎng)3天來提純米曲霉菌落。
對(duì)氨肽酶陽性米曲霉轉(zhuǎn)化體的鑒定在瓊脂平皿(重疊有60μg/ml的亮氨酸-7酰胺-4甲基香豆素)上對(duì)得自米曲霉轉(zhuǎn)化體的上清液進(jìn)行氨肽酶的檢測(cè)。通過在30℃下溫育5分鐘-2小時(shí)后在紫外線熒光下分析平皿來鑒定陽性轉(zhuǎn)化體。
SDS-PAGE分析對(duì)來自米曲霉氨肽酶生產(chǎn)用轉(zhuǎn)化體的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。將該轉(zhuǎn)化體在5ml的YPM中生長(zhǎng)3天。將10μl的上清液上12％的SDS聚丙烯酰胺凝膠，而后用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。
質(zhì)譜分析在VG Analytical TofSpec中使用基質(zhì)輔助性激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行質(zhì)譜分析。對(duì)質(zhì)譜分析來說，將2μl的樣品同2μl飽和基質(zhì)液
和2μl點(diǎn)在靶平皿上的混合物相混合。在引入質(zhì)譜分析儀之前，蒸發(fā)去除溶劑。在閾值激光強(qiáng)度下通過4ns激光脈沖(337nm)來解吸和電離樣品，通過25kV的加速電壓而加速加入無場(chǎng)飛行試管中。通過設(shè)置在1850V下的微槽平皿對(duì)離子進(jìn)行檢測(cè)。用已知質(zhì)量的蛋白質(zhì)從外部對(duì)光譜進(jìn)行校準(zhǔn)。
免疫交叉反應(yīng)性通過使用純化氨肽酶來制備用于測(cè)定免疫交叉反應(yīng)性的抗體。特別是通過使兔子(或其它嚙齒動(dòng)物)免疫來培養(yǎng)出抗本發(fā)明氨肽酶的抗血清，依據(jù)的程序見N.Axelsen等人，定量免疫電泳手冊(cè)，Blackwell科學(xué)出版社，1973，第23章；或見A.Johnstone和R.Thorpe，實(shí)用免疫化學(xué)，Blackwell科學(xué)出版社，1982(尤其是27-31頁)。從該抗血清中可得到純化的免疫球蛋白，例如可通過鹽沉淀法[(NH4)2SO4]，而后進(jìn)行滲析和離子交換色譜分析，如在DEAE-Sephadex上。可進(jìn)行蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)分析，既可通過Outcherlony雙擴(kuò)散分析[O.Ouchterlony，見實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(D.M.Weir編輯)，Blackwell科學(xué)出版社，1967，655-706頁]，通過交叉免疫電泳法(N.Axelsen等人，如上，第3和第4章)，也可以通過火箭免疫電泳法(N.Axelsen等人，第2章)。
Southern印跡分析根據(jù)Yelton等人(1984)從米曲霉中分離出基因組DNA(美國(guó)自然科學(xué)學(xué)術(shù)匯編，81，1470-1474頁)，用BamHI、BglII、EcoRI和HindIII(10μg/樣品)進(jìn)行完全消化，在0.7％的瓊脂糖凝膠上分級(jí)，利用10×SSC作為轉(zhuǎn)移緩沖液將其變性并印跡在尼龍濾膜(Hybond-N)上，見Southern，E.M.(1975)，分子生物學(xué)雜志，503-517頁。通過隨機(jī)引物法對(duì)氨肽酶cDNA進(jìn)行32P標(biāo)記(＞1×109cpm/μg)，并用作Southern分析中的探針。雜交和沖洗條件如RNA凝膠印跡分析中所述。將濾膜在-80℃下放射性自顯影12小時(shí)。
RNA凝膠印跡分析將來自米曲霉的聚(A)+RNA(1μg)上電泳(1.2％瓊脂糖-2.2M甲醛凝膠)，見Thomas，P.S.(1983)，酶學(xué)方法，100，255-2663頁，然后印跡在具10×SSC(作為轉(zhuǎn)移緩沖液)的尼龍膜(Nybond-N)中。通過隨機(jī)引物法對(duì)氨肽酶cDNA進(jìn)行32P標(biāo)記(＞1×109cpm/μg)，然后在65℃下在膜上雜交18-20小時(shí)，溶液為5×SSC，5×Denhardt溶液，0.5％SDS(w/v)和100μg/ml的變性鮭精DNA。沖洗濾膜，溶液為65℃下的5×SSC(2×15分鐘)，2×SSC，0.5％SDS(1×30分鐘)，0.2×SSC，0.5％SDS(1×30分鐘)及5×SSC(2×15分鐘)。將濾膜在-80℃下放射性自顯影12小時(shí)。
測(cè)定氨肽酶的活性(LAPU)將一個(gè)LAPU定義為每分鐘水解1μmol L-亮氨酸-p-硝基酰苯胺所用的酶量，方法如AF 298/1-GB所述(從Novo Nodisk A/S可索取得到)。
根據(jù)TMBS分析來確定％DH可通過水解作用達(dá)到的程度來測(cè)定蛋白質(zhì)水解的程度。在本發(fā)明的說明書中，水解作用的程度(DH)可據(jù)如下公式所定義hDH＝------------------×100％htotalh是所水解的肽鍵的數(shù)目，htotal是蛋白質(zhì)中肽鍵的總數(shù)。htotal取決于原材料的類型，而h可表示為meqv亮氨酸NH2的函數(shù)，例如可通過TNBS分析來量度。
％DH的確定如EF-9415317所述(可從Novo Nordisk A/S索取得到)。
對(duì)面團(tuán)和面包的檢測(cè)依據(jù)本發(fā)明，可通過以下方法在面團(tuán)和面包中檢測(cè)添加具有氨肽酶活性的單成分酶后的效果面包的制作程序1.面團(tuán)的調(diào)制(螺旋調(diào)制器)700 RPM下3分鐘1400 RPM下5分鐘調(diào)制時(shí)間事先由有經(jīng)驗(yàn)的面包師根據(jù)所用面粉進(jìn)行確定并調(diào)整，以便能在本檢測(cè)條件下達(dá)到最佳的面團(tuán)稠度。
2.第一次實(shí)驗(yàn)30℃-80％RH，15分鐘3.標(biāo)度和定型；4.在周圍環(huán)境下擱置5分鐘；5.最終實(shí)驗(yàn)32℃-80％RH，面包卷45分鐘，面包55分鐘；6.烘烤225℃，面包卷22分鐘，枕形面包30分鐘。
對(duì)面團(tuán)和烘烤產(chǎn)品的評(píng)估如下對(duì)面團(tuán)和烘烤產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)估枕形面包的比容使用傳統(tǒng)油菜籽方法來衡量4個(gè)枕形面包體積的平均值。按每g面包的體積ml來計(jì)算比容。將對(duì)照組(無酶)的比容定義為100。如下計(jì)算出相對(duì)比容指數(shù)4個(gè)枕形面包的比容比容指數(shù)＝--------------------------------------------*1004個(gè)對(duì)照枕形面包的比容可依據(jù)以下尺度從視覺上來評(píng)估面團(tuán)粘性和面心結(jié)構(gòu)面團(tuán)粘性近乎液體1過于粘著2粘著3可接受 3.5正常4干燥5面心結(jié)構(gòu)很差1
差 2非均勻 3均勻/良好 4優(yōu)秀5震動(dòng)測(cè)試第二次實(shí)驗(yàn)之后，將盛有面團(tuán)的一個(gè)平鍋從20cm高度處扔下。將面團(tuán)進(jìn)行烘烤，確定所制作面包的體積。
酵母味道對(duì)照組 3略有改善 3.5改善 4面心色澤可從視覺上來確定面心色澤實(shí)施例實(shí)施例1 cDNA文庫的構(gòu)建從米曲霉A01568中提取全部RNA。利用寡(dT)-纖維素親和色譜來分離聚(A)+RNA，并合成雙鏈cDNA(ds cDNA)。
將來自米曲霉A01568的cDNA文庫(由3.5×106個(gè)克隆組成)構(gòu)建入酵母表達(dá)載體pYES 2.0中。
實(shí)施例2 cDNA克隆的擴(kuò)增和特性分析如“材料和方法”章節(jié)中所述，從米曲霉A01568中提純氨肽酶。
用賴氨酰-特異性蛋白酶對(duì)S-羧甲基化純蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，得到氨肽酶的1個(gè)長(zhǎng)NH2-末端序列和4個(gè)內(nèi)序列(包括肽1-5)。
根據(jù)這些序列合成出3個(gè)引物(分別是as1、s2和s3)。如“材料和方法”章節(jié)中所述，將雙鏈cDNA(ds cDNA)用作PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中的模板。
對(duì)所生成PCR產(chǎn)物的分析揭示出帶有一引物對(duì)(引物s3和引物as1)的0.5kb片段。
將PCR片段亞克隆到Sma I酶切的脫磷酸化pUC18載體中，利用如“材料和方法”章節(jié)中所述的雙脫氧鏈終止方法從兩端來進(jìn)行序列測(cè)定。
除了引物所編碼的殘基之外，由得自純化氨肽酶的肽2序列(與所推論的氨基酸序列線匹配)可以確定所需的cDNA種類已經(jīng)被PCR特異性地?cái)U(kuò)增了。
實(shí)施例3對(duì)編碼來自米曲霉的氨肽酶的克隆之cDNA文庫的篩選通過上述菌落雜交篩選出來自米曲霉A01568的cDNA文庫的約10,000個(gè)菌落。其產(chǎn)生出帶有插入子(范圍650bp-1.5kb)的陽性克隆。
按上述“材料和方法”章節(jié)中所述，用Southern印跡分析法分析這些陽性克隆。
將來自氨肽酶cDNA克隆的純化質(zhì)粒DNA(約1μg)用HindIII和XbaI進(jìn)行完全消化，以從pYES載體中釋放出cDNA插入子。將樣品進(jìn)行電泳分析，通過毛細(xì)管印跡方法將其轉(zhuǎn)移至Hybond-N尼龍膜。嚴(yán)格沖洗濾膜，可得到帶有插入子(范圍900bp-1700bp)的陽性克隆。
通過對(duì)帶有正向和反向pYES引物的cDNAs末端進(jìn)行序列測(cè)定，可分析強(qiáng)烈雜交的克隆。
對(duì)序列數(shù)據(jù)的分析表明，其中一些克隆是截?cái)嗟腸DNAs，而另外一些似乎是完整的克隆。所得到的完整克隆之一(pC1EXP3，如表1所述)的核苷酸序列和推論性氨基酸序列含有1.4kb的cDNA插入子。
實(shí)施例4 氨肽酶在米曲霉中的表達(dá)為了能在米曲霉中大量生成氨肽酶，將來自pC1EXP3克隆的cDNA插入子亞克隆到pHD423中，并同AmdS+質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到米曲霉中，如上所述。
通過Hind III和Not I消化，從pYES2.0中分離出來自pC1EXP3的1.4kb的cDNA插入子，連接到Not I/Hind III裂解的pHD423載體上，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。
將所生成的轉(zhuǎn)化體提純兩次(如上)并如上述進(jìn)行氨肽酶活性的檢測(cè)。轉(zhuǎn)化體pA3EXP3/1表現(xiàn)出可檢測(cè)到的氨肽酶活性。
實(shí)施例5 氨肽酶生成用轉(zhuǎn)化體(pA3EXP3/1)的表達(dá)水平利用非轉(zhuǎn)化性米曲霉A01560菌種作為負(fù)對(duì)照及米曲霉A01568菌種作為正對(duì)照，通過DSD-PAGE來半定量測(cè)定來自轉(zhuǎn)化體(pA3EXP3/1)的分泌性氨肽酶的數(shù)量和純度(表達(dá)水平)，參見表1。
在pA3EXP3/1中可以看到一個(gè)36-37kDa的多肽，但在負(fù)對(duì)照中沒有。重組氨肽酶的大小比天然氨肽酶(約35kDa的雙條帶)高出約2kDa，可能是由于附加的糖基化或其它類型的轉(zhuǎn)譯后修飾作用。
實(shí)施例6質(zhì)譜法顯示，由于所測(cè)定的質(zhì)量超過了由cDNA序列計(jì)算出的多肽質(zhì)量32.4kDa，重組氨肽酶被糖基化了。
重組氨肽酶的平均質(zhì)量為34.1kDa，其質(zhì)量范圍為33kDa-35kDa。
通過SDS-PAGE(如“材料和方法”中所述)所測(cè)定的表觀分子量(Mw)約為35kDa。
實(shí)施例7 35kDa氨肽酶生成用轉(zhuǎn)化體的發(fā)酵米曲霉轉(zhuǎn)化體pA3EXP3/1在含有150ml DAP 2C(pH＝5.9)的1升搖瓶中生長(zhǎng)3天，溫度30℃。
通過SDS-PAGE分析所估測(cè)的分泌性氨肽酶數(shù)量約為0.5g/l上清液。
實(shí)施例8 35kDa氨肽酶克隆在粟酒裂殖酵母中的表達(dá)通過電穿孔法將完整的35 kDa氨肽酶cDNA克隆pC1EXP3重轉(zhuǎn)化到粟酒裂殖酵母中。通過Spel和NotI消化從pYES 2.0載體中釋放出1.4kb的cDNA插入子，并亞克隆至Spel/NotI剪切性酵母表達(dá)載體pP1(一種含有ADH啟動(dòng)子的大腸桿菌/粟酒裂殖酵母穿梭載體)上，而后檢測(cè)氨肽酶的活性。
結(jié)果表明，粟酒裂殖酵母轉(zhuǎn)化體具有很強(qiáng)的氨肽酶活性，這說明粟酒裂殖酵母能夠從米曲霉A01568中合成及分泌具功能活性的35kDa氨肽酶。實(shí)施例9氨肽酶基因的組織和表達(dá)通過Southern印跡雜交(如“材料和方法”章節(jié)所述)來確定米曲霉A01568基因組中氨肽酶基因的拷貝數(shù)。用BamHI、BalII、EcoRI或HindIII來完全消化從米曲霉中分離的完整DNA，并與氨肽酶cDNA進(jìn)行雜交。氨肽酶探針只能在每一情況中檢測(cè)出單個(gè)強(qiáng)雜交片段(BamHI消化除外)，由于BamHI位點(diǎn)在核苷酸640處，因此可給出2個(gè)雜交片段。這意味著氨肽酶基因在米曲霉A01568基因組中是以單拷貝存在的。
實(shí)施例10為了研究35kDa氨肽酶基因的表達(dá)，對(duì)提取自米曲霉A01568菌絲體的聚(A)+RNA進(jìn)行Northern印跡分析。用氨肽酶cDNA來探測(cè)RNA印跡揭示了mRNA的兩個(gè)種類，約1.45和1.55千堿基。這兩個(gè)mRNAs似乎并不代表兩個(gè)不同基因的轉(zhuǎn)錄物，因?yàn)楫?dāng)嚴(yán)格沖洗濾膜時(shí)會(huì)觀察到相同模式的雜交。兩個(gè)mRNAs大小的差異可能是由于3′-非翻譯區(qū)的不同長(zhǎng)度，因?yàn)榇嬖谟袃蓚€(gè)聚腺苷酸化位點(diǎn)，而依據(jù)分離自米曲霉cDNA文庫的兩個(gè)cDNA種類，一個(gè)對(duì)應(yīng)著克隆pC1EXP3，而另一個(gè)則對(duì)應(yīng)著pC1EXP4(其短120bp)。兩個(gè)mRNAs都能編碼同樣的氨肽酶。
實(shí)施例11 去除乳清蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味檢測(cè)米曲霉轉(zhuǎn)化體pA3EXP3/1的發(fā)酵培養(yǎng)液去除含8％(w/w)蛋白酶水解乳清蛋白質(zhì)的溶液苦味的能力。
發(fā)酵培養(yǎng)液的氨肽酶活性為5.58LAPU/g。
在含100g 8％的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的燒瓶中檢測(cè)底物蛋白質(zhì)溶液。加入表現(xiàn)出氨肽酶活性的發(fā)酵培養(yǎng)液，直到根據(jù)5000 LAPU/g的產(chǎn)品(等于12.5LAPU/g蛋白質(zhì))進(jìn)行計(jì)算，酶和底物(E/S)之間的關(guān)系為0.25％，而后在50℃下重新水解6小時(shí)，pH7.0。
(利用標(biāo)準(zhǔn)方法)分別在1分鐘和6小時(shí)之后來測(cè)定pH和滲析作用。使用TNSB方法(如上述)來測(cè)定％DH，使用標(biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)定％FAA(％自由氨基酸)。
*通過氨肽酶對(duì)底物的水解所引起的DH增加。盲試DH為28％對(duì)去掉苦味的水解產(chǎn)物(含13％FFA)樣品分析其亮氨酸含量。我們發(fā)現(xiàn)亮氨酸組成約為2.7％，而盲試的亮氨酸為約0.3％。
實(shí)施例12 品嘗測(cè)試?yán)每嘀笖?shù)(BI)為0(不苦)和10(盲試)之間，通過5個(gè)人的品嘗小組來評(píng)估去苦味蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的口味。
對(duì)屬于轉(zhuǎn)化體的苦味3.5％蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(盲試)的樣品和相似樣品的苦味進(jìn)行評(píng)估。
我們發(fā)現(xiàn)屬于轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物樣品的苦指數(shù)(BI)范圍約為6.2。
這個(gè)結(jié)果表明，35kDa氨肽酶去除了蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物樣品的苦味。
實(shí)施例13 面包味道、面團(tuán)粘性和面心結(jié)構(gòu)將使用每kg面粉0-300 LAPU所制作的面包的味道、面團(tuán)粘性和面心結(jié)構(gòu)同使用商用產(chǎn)品Flavourzyme制作的面包進(jìn)行比較。制作面包并如上述“材料和方法”章節(jié)中所述進(jìn)行評(píng)估。
我們發(fā)現(xiàn)下列結(jié)果(兩重復(fù)的平均量)
從上表可以看出，當(dāng)每kg面粉加入量為30-300 LAPU時(shí)，本發(fā)明的35 kDa氨肽酶以“新烘烤性”面包的形式顯著地改善了味道。本發(fā)明的氨肽酶對(duì)面心結(jié)構(gòu)并無影響。與商用性蛋白酶/肽酶復(fù)合物Flavourzyme相比，面團(tuán)的粘性得到了改善。
本領(lǐng)域技術(shù)人員從上述說明中顯然可以看出，在實(shí)施本發(fā)明而不背離其精神或其范圍的前提下可以進(jìn)行許多變化和改進(jìn)。因此，本發(fā)明的范圍要依據(jù)下列權(quán)利要求所定義的內(nèi)容。
序列表(1)一般情況(i)申請(qǐng)人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話+45 4444 8888(H)電傳+45 4449 3256(ii)發(fā)明標(biāo)題一種有氨肽酶活性的酶(iii)序列數(shù)目12(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介形式軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30B(EPO)(2)SEQ ID No.1(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度1409個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(B)菌種米曲霉A01568(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置52..1183(xi)序列描述SEQ ID No.1CGAGCATTCC GTTCGTATCG ACTTGGTGGT ACACCTTTC GTTCTCTCAA G ATG CGT57Met Arg1TTC CTC CCC TGC ATC GCG ACT TTG GCA GCC ACG GCC TCT GCC CTT GCT105Phe Leu Pro Cys Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ser Ala Leu Ala5 10 15ATT GGA GAC CAT GTA CGC TCG GAC GAT CAG TAT GTC CTA GAA CTC GCC153Ile Gly Asp His Val Arg Ser Asp Asp Gln Tyr Val Leu Glu Leu Ala20 25 30CCG GGA CAA ACG AAA GTT GTG ACG GAA GCA GAG AAA TGG GCT CTG AGA201Pro Gly Gln Thr Lys Val Val Thr Glu Ala Glu Lys Trp Ala Leu Arg35 40 45 50GCT GAG GGC AAG CGT TTC TTC GAT ATA ACC GAA CGG GCC AGT AGC CTG249Ala Glu Gly Lys Arg Phe Phe Asp Ile Thr Glu Arg Ala Ser Ser Leu55 60 65GAA CTC GCA TCG AAC AAG AAA CAA AAG CTC GGG GTT ACC TAC CCC GAT297Glu Leu Ala Ser Asn Lys Lys Gln Lys Leu Ala Val Thr Tyr Pro Asp70 75 80TCC GTG CAA CAC AAC GAG ACC GTG CAA AAT CTG ATC AAG TCG CTC GAC345Ser Val Gln His Asn Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys Ser Leu Asp85 90 95AAA AAG AAC TTC GAA ACC CTT CTC CAG CCG TTC TCG GAG TTC CAC AAT393Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe His Asn100 105 110CGC TAT TAC AAG AGC GAC AAT GGC AAG AAA TCA TCC GAG TGG CTG CAA441Arg Tyr Tyr Lys Ser Asp Asn Gly Lys Lys Ser Ser Glu Trp Leu Gln115 120 125 130GGC AAG ATT CAG GAA ATC ATC TCC GCC AGT GGA GCA AAG GGA GTC ACT489Gly Lys Ile Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ser Gly Ala Lys Gly Val Thr135 140 145GTG GAG CCT TTC AAA CAC TCC TTC CCG CAG TCG AGT CTG ATT GCG AAA537Val Glu Pro Phe Lys His Ser Phe Pro Gln Ser Ser Leu Ile Ala Lys150 155 160ATC CCC GGC AAG AGT GAC AAG ACC ATC GTG CTT GGA GCG CAT CAG GAC585Ile Pro Gly Lys Ser Asp Lys Thr Ile Val Leu Gly Ala His Gln Asp165 170 175TCC ATC AAC CTT GAT TCA CCC TCA GAG GGC CGT GCA CCG GGA GCT GAT633Ser Ile Asn Leu Asp Ser Pro Ser Glu Gly Arg Ala Pro Gly Ala Asp180 185 190GAC GAT GGA TCC GGC GTT GTT ACC ATT CTC GAA GCC TTC CGC GTT CTC681Asp Asp Gly Ser Gly Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Phe Arg Val Leu195 200 205 210CTG ACG GAC GAG AAG GTC GCA GCC GGT GAG GCT CCG AAC ACC GTT TGA 729Leu Thr Asp Glu Lys Val Ala Ala Gly Glu Ala Pro Asn Thr Val Glu252 220 225TTC CAC TTC TAT GCC GGA GAG GGT GGT GGT CTG CTG GGA AGT CAG GAC 777Phe His Phe Tyr Ala Gly Glu Glu Gly Gly Leu Leu Gly Ser Gln Asp230 235 240ATC TTC GAG CAG TAC TCG CAG AAA AGC CGA GAC GTG AAA GCC ATG CTT 825Ile Phe Glu Gln Tyr Ser Gln Lys Ser Arg Asp Val Lys Ala Met Leu245 250 255CAA CAG GAT ATG ACG GGT TAT ACT AAA GGC ACA ACC GAT GCT GGA AAG 873Gln Gln Asp Met Thr Gly Tyr Thr Lys Gly Thr Thr Asp Ala Gly Lys260 265 270CCG GAG TCG ATC GGT ATC ATC ACT GAC AAT GTC GAT GAG AAC CTG ACC 921Pro Glu Ser Ile Gly Ile Ile Thr Asp Asn Val Asp Glu Asn Leu Thr275 280 285 290AAG TTC CTG AAG GTC ATT GTC GAT GCT TAT TGC ACT ATC CCG ACC GTC 969Lys Phe Leu Lys Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro Thr Val295 300 305GAT TCG AAA TGC GGA TAC GGA TGC TCT GAC CAT GCT TCT GCC ACG AAG 1017Asp Ser Lys Cys Gly Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ser Ala Thr Lys310 315 320TAT GGT TAT CCC GCC GCA TTC GGA TTC GAG TCA GCC TTT GGC GAC GAC 1065Tyr Gly Tyr Pro Ala Ala Phe Ala Phe Glu Ser Ala Phe Gly Asp Asp325 330 335AGC CCT TAC ATT CAC TCG GCT GAT GAT ACG ATT GAG ACC GTC AAC TTT 1113Ser Pro Tyr Ile His Ser Ala Asp Asp Thr Ile Glu Thr Val Asn Phe340 345 350GAC CAT GTG CTG CAA CAC GGC AAA CTG ACT CTT GGA TTT GCA TAT GAG 1161Asp His Val Leu Gln His Gly Lys Leu Thr Leu Gly Phe Ala Try Glu355 360 365 370CTT GCC TTC GCA GAT TGG CTG T AAGGCTTATG ACGACGGTTG TATGAGCGAG 1213Leu Ala Phe Ala Asp Ser Leu375AGATCCAGTC CAACAGTGTG TATAATATGT GGGCCCGTGT TCAAATAGCA CTTTGATTTA1273GCCAGTGAGT AGCTTTGGTG GCGAAAATGG AGGCCGAATT CTAGGCAACA TCGAACTGGA1333GGCTGTCAGG GGCGCATCAC AAGAAGTTTT GAGCTACATA AGCGAGATAA AAGTCAGAAA1393AAAAAAAAAA AAAAAA1409(2)SEQ ID No.2的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度377個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID No.2Met Arg Phe Leu Pro Cys Ile Ala Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ser Ala1 5 10 15Leu Ala Ile Gly Asp His Val Arg Ser Asp Asp Gln Tyr Val Leu Glu20 25 30Leu Ala Pro Gly Gln Thr Lys Val Val Thr Glu Ala Glu Lys Trp Ala35 40 45Leu Arg Ala Glu Gly Lys Arg Phe Phe Asp Ile Thr Glu Arg Ala Ser50 55 60Ser Leu Glu Leu Ala Ser Asn Lys Lys Gln Lys Leu Ala Val Thr Tyr65 70 75 80Pro Asp Ser Val Gln His Asn Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys Ser85 90 95Leu Asp Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe100 105 110His Asn Arg Tyr Tyr Lys Ser Asp Asn Gly Lys Lys Ser Ser Glu Trp115 120 125Leu Gln Gly Lys Ile Gln Glu Ile Ile Ser Ala Ser Gly Ala Lys Gly130 125 140Val Thr Val Glu Pro Phe Lys His Ser Phe Pro Gln Ser Ser Leu Ile145 150 155 160Ala Lys Ile Pro Gly Lys Ser Asp Lys Thr Ile Val Leu Gly Ala His165 170 175Gln Asp Ser Ile Asn Leu Asp Ser Pro Ser Glu Gly Arg Ala Pro Gly180 185 190Ala Asp Asp Asp Gly Ser Gly Val Val Thr Ile Leu Glu Ala Phe Arg195 200 205Val Leu Leu Thr Asp Glu Lys Val Ala Ala Gly Glu Ala Pro Asn Thr210 215 220Val Glu Phe His Phe Tyr Ala Gly Glu Glu Gly Gly Leu Leu Gly Ser225 230 235 240Gln Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Ser Gln Lys Ser Arg Asp Val Lys Ala245 250 255Mer Leu Gln Gln Asp Met Thr Gly Tyr Thr Lys Gly Thr Thr Asp Ala260 265 270Gly Lys Pro Glu Ser Ile Gly Ile Ile Thr Asp Asn Val Asp Glu Asn275 280 285Leu Thr Lys Phe Leu Lys Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro290 295 300Thr Val Asp Ser Lys Cys Gly Tyr Gly Cys Ser Asp His Ala Ser Ala305 310 315 320Thr Lys Tyr Gly Tyr Pro Ala Ala Phe Ala Phe Glu Ser Ala Phe Gly325 330 335Asp Asp Ser Pro Tyr Ile His Ser Ala Asp Asp Thr Ile Glu Thr Val340 345 350Asn Phe Asp His Val Leu Gln His Gly Lys Leu Thr Leu Gly Phe Ala355 360 365Tyr Glu Leu Ala Phe Ala Asp Ser Leu370 375(2)SEQ ID No.3的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID No.3TCTACRTTRT CTGTTATTAT YTCTACT 26(2)SEQ ID No.4的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID No.4GARACTGTTC ARAAYCTTACT 20(2)SEQ ID No.5的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型引物(iii)假說無(iv)反義否(xi)序列描述SEQ lD No.5GAYAARAARA AYTTYGAWAC IGT 23(2)SEQ ID No.6的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQ ID No.6Tyr Pro Asp Ser Val Gln His Xaa Glu Thr Val Gln Asn Leu Ile Lys1 5 10 15(2)SEQ ID No.7的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQ l D No.7Gly Val Thr Val Glu Pro Phe Lys1 5(2)SEQ ID No.8的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQ ID No.8Val Ile Val Asp Ala Tyr Cys Thr Ile Pro Thr Val Asp Ser Lys1 5 10 15(2)SEQ ID No.9的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQ ID No.9Gly Thr Thr Asp Ala Gly Lys Pro Glu Ser Ile Glu Ile Ile Thr Asp1 5 10 15Asn Val Asp Glu Asn Leu Thr Lys20(2)SEQ ID No.10的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度29個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID No.10Tyr Pro Asp Ser Val Gln His Xaa Glu Thr Val Gln Asn Teu Ile Lys1 5 10 15Ser Leu Asp Lys Lys Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro20 25(2)SEQ ID No.11的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型肽(iii)假說無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID No.11Asn Phe Glu Thr Val Leu Gln Pro Phe Ser Glu Phe His Asn Arg Tyr Tyr Lys1 5 10 15(2)SEQ ID No.12的情況(i)序列性質(zhì)(A)長(zhǎng)度1272個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈況單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(vi)來源(B)菌種米曲霉A01568(xi)序列描述SEQ ID No.12CTCGAGCATT CCGTTCGTAT CGACTTGGTG GTACACGCTT TCGTTCTCTC AAGATGCGTT 60TCCTCCCCTG CATCGCGACT TTGGCAGCCA CGGCCTCTGC CCTTCCTATT GGAGACCATG120TACGCTCGGA CGATCAGTAT GTCCTAGAAC TCGCCCCGGG ACAAACGAAA GTTGTGACGG180AAGCAGAGAA ATGGGCTCTG AGAGCTGAGG GCAAGCGTTT CTTCGATATA ACCCAACGGG240CCAGTAGCCT GGAACTCGCA TGGAACAAGA AACAAAAGCT CGCGGTTACC TACCCCGATT300CCGTGCAACA CAACGAGACC GTGCAAAATC TGATCAAGTC GCTGGACAAA AAGAACTTCG360AAACCGTTCT CCAGCCGTTC TCGGAGTTCC ACAAGCGCTA TTACAAGAGC GACAATGGCA420AGAAATCATC CGAGTGGCTG CAAGGCAAGA TTCAGGAAAT CATCTCCGCC AGTGGAGCAA480AGGGAGTCAC TGTGGAGCCT TTCAAACACT CCTTCCCGCA GTCGAGTCTG ATTGCGAAAA540TCCCCGGCAA GAGTGACAAG ACCATCGTGC TTGGAGCGCA TCAGGACTCC ATCAACCTTG600ATTCACCCTC AGAGGGCCGT GCACCGGGAG CTGATGACGA TGGATCCGGC GTTGTTACCA660TTCTCGAAGC CTTCCGCGTT CTCCTGACGG ACGAGAAGGT CGCAGCCGGT GAGGCTCGGA720ACACCGTTGA GTTCCACTTC TATGCCGGAG AGGAGGGTGG TCTGCTGGGA AGTCAGGACA780TCTTCGAGCA GTACTCGCAG AAAAGCCGAG ACGTGAAAGC CATGCTTCAA CAGGATATGA840CGGGTTATAC TAAAGGCACA ACCGAGGCTG GAAAGCCGGA GTCGATCGGT ATCATCACTG900ACAATGTCGA TGAGAACCTG ACCAAGTTCC TGAAGGTCAT TGTCGATGCT TATTGCACTA960TCCCGACCGT CGATTCGAAA TGCGGATACG GATGCTCTGA CCATGCTTCT GCCACGAAGT1020ATGGTTATCC CGCCGCATTC GCATTCGAGT CAGCCTTTGG CGACGACAGC CCTTACATTC1080ACTCGGCTGA TGATACGATT GAGACCGTCA ACTTTGACCA TGTGCTGCAA CACGGCAAAC1140TGACTCTTGG ATTTGCATAT GAGCTTGCCT TCGCAGATTC GCTGTAAGGC TTATGACGAC1200GGTTGTATGA GCGAGAGATC CAGTCCAACA GTGTGTATAA TATGTGGGCC CGTGTTCAAA1260TAGCACTTAA AA1272INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM(PCTRule 13bis)
權(quán)利要求
1.一種來自真菌微生物、表現(xiàn)氨肽酶活性的酶，該酶通過SDS-PAGE所測(cè)定的表觀分子量(Mw)為35kDa。
2.依據(jù)權(quán)利要求1的酶，估計(jì)其等電點(diǎn)(pI)范圍約為4.9。
3.依據(jù)權(quán)利要求1至2的酶，其中估計(jì)前體形式酶的分子量約為41kDa。
4.依據(jù)權(quán)利要求3的酶，其中前體形式酶包括一個(gè)分泌信號(hào)。
5.依據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的酶，衍生自絲狀真菌或酵母。
6.依據(jù)權(quán)利要求5的酶，衍生自絲狀真菌，如曲霉屬，特別是米曲霉，尤其是米曲霉A01568，或木霉屬、青霉屬、鐮孢霉屬或腐殖霉屬。
7.依據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的酶，該酶包括或歸入如SEQ ID No.6所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，如SEQ ID No.7所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，和/或如SEQ ID No.8所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，和/或如SEQ ID No.9所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物，和/或如SEQ ID No.10所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物和/或如SEQ ID No.11所示的部分氨基酸序列或所述序列的類似物。
8.依據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的酶，該酶包括或歸入如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或所述序列的類似物。
9.依據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的酶，該酶與衍生自米曲霉A01568、如SEQ ID No.2所示的純化氨肽酶所針對(duì)的抗體有免疫反應(yīng)性。
10.依據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的酶，該酶含有范圍在35-45％的非極性氨基酸，優(yōu)選為37-41％，和/或范圍為30-40％的極性氨基酸，優(yōu)選為33-37％，和/或范圍在10-20％的酸性氨基酸，優(yōu)選為12-16％。
11.依據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的酶，該酶含有范圍在7-17％的酸性氨基酸，優(yōu)選為10-14％。
12.含有編碼表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的DNA序列的DNA構(gòu)建體，該DNA序列包括a)如SEQ ID No.1所示的DNA序列的氨肽酶編碼部分，和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列，b)如a)定義所示DNA序列的類似物，其i)與如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列同源，ii)與如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的相同寡核苷酸探針雜交，iii)編碼一種多肽，該多肽與由含如SEQ ID No.1所示的DNA序列和/或得自大腸桿菌DSM 9965的DNA序列的DNA序列所編碼的多肽同源，iv)編碼一種多肽，該多肽與衍生自米曲霉A01568和/或得自大腸桿菌DSM 9965的SEQ ID No.1所示的DNA序列所編碼的純化氨肽酶所針對(duì)的抗體有免疫反應(yīng)性。
13.依據(jù)權(quán)利要求12的DNA構(gòu)建體，含有如SEQ ID No.3所示的部分DNA序列，和/或如SEQ ID No.4所示的部分DNA序列，和/或如SEQ ID No.5所示的部分DNA序列。
14.依據(jù)權(quán)利要求12-13中任意一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體，其中DNA序列得自真菌微生物，如絲狀真菌或酵母。
15.依據(jù)權(quán)利要求14的DNA構(gòu)建體，其中DNA序列得自曲霉屬菌株，如米曲霉，特別是來自保藏的米曲霉ATCC 20386，或木霉屬、青霉屬、鐮孢霉屬、腐殖霉屬或大腸桿菌DMS 9965。
16.依據(jù)權(quán)利要求30的DNA構(gòu)建體，其中DNA序列分離自或依據(jù)米曲霉A01568的核酸文庫。
17.含有依據(jù)權(quán)利要求12-16中任意一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
18.含有依據(jù)權(quán)利要求12-16的DNA構(gòu)建體或依據(jù)權(quán)利要求17的重組表達(dá)載體的細(xì)胞。
19.依據(jù)權(quán)利要求18的細(xì)胞，其為真核細(xì)胞，特別是真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞。
20.依據(jù)權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中細(xì)胞為曲霉屬的菌株，特別為米曲霉或黑曲霉菌株；酵母菌屬的菌株，特別是釀酒酵母、克魯弗酵母或葡萄汁酵母；裂殖酵母屬的菌株，如粟酒裂殖酵母；漢遜酵母屬的菌株；畢赤酵母屬的菌株；Yarrowia的菌株，如Yarrowia.lipolytica；或克魯維酵母屬的菌株，如乳酸克魯維酵母。
21.依據(jù)權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中細(xì)胞屬于曲霉屬的菌株，特別是米曲霉或黑曲霉的菌株。
22.生產(chǎn)表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的方法，該方法包括，在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)依據(jù)權(quán)利要求18-21中任何一項(xiàng)的細(xì)胞，培養(yǎng)條件使依據(jù)權(quán)利要求12-16中任意一項(xiàng)的DNA構(gòu)建體或依據(jù)權(quán)利要求17的表達(dá)載體得以表達(dá)，并從培養(yǎng)物中回收酶。
23.用于降低食料中蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物苦味的一種酶制劑，該制劑用依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶進(jìn)行富集。
24.依據(jù)權(quán)利要求23的酶制劑，該制劑富集因子為1.1-10之間，優(yōu)選2-8之間，特別在4-6之間。
25.依據(jù)權(quán)利要求23和24的酶制劑，其另外含有至少一種其它酶活性，包括纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、漆酶、木聚糖酶、肽酶和內(nèi)蛋白酶。
26.含有依據(jù)權(quán)利要求1-11中的任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物。
27.依據(jù)權(quán)利要求26的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物，其進(jìn)一步含有解淀粉酶，選自α-淀粉酶、β-淀粉酶、生麥α-淀粉酶、酸穩(wěn)定性淀粉酶、1，6-支鏈淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。
28.依據(jù)權(quán)利要求26和27的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物，其進(jìn)一步含有另外的酶，如纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、漆酶和木聚糖酶。
29.依據(jù)權(quán)利要求26-28中任意一項(xiàng)的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物，其進(jìn)一步含有另外的面包或面團(tuán)改進(jìn)劑。
30.從面粉面團(tuán)制備烘烤產(chǎn)品的方法，該方法包括，在面團(tuán)制作過程中在面團(tuán)或面團(tuán)組分中添加依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶，并在適宜的條件下將所制作的面團(tuán)進(jìn)行烘烤。
31.依據(jù)權(quán)利要求30的從面粉面團(tuán)制備烘烤產(chǎn)品的方法，該方法包括，在面團(tuán)制作過程中在面團(tuán)或面團(tuán)組分中進(jìn)一步添加解淀粉酶并在適宜的條件下將所制作的面團(tuán)進(jìn)行烘烤。
32.依據(jù)權(quán)利要求3 1的方法，其中解淀粉酶選自α-淀粉酶、β-淀粉酶、生麥α-淀粉酶、酸穩(wěn)定性淀粉酶、1，6-支鏈淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。
33.依據(jù)權(quán)利要求11-18中任意一項(xiàng)的方法，其中將其它酶如纖維素酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、過氧化物酶、氧化酶、漆酶、淀粉酶、木聚糖酶加入到面團(tuán)或面團(tuán)組分中。
34.依據(jù)權(quán)利要求30-34中任意一項(xiàng)的方法，其中加入依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的酶，數(shù)量為每kg面粉30-1000 LAPU，優(yōu)選為50-500 LAPU，特別是80-300 LAPU，如約100 LAPU。
35.依據(jù)權(quán)利要求30-34中任意一項(xiàng)的方法，其中加入如權(quán)利要求26-29中任意一項(xiàng)所定義的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物形式的酶。
36.制作冷凍面團(tuán)的方法，該方法包括，在面團(tuán)制作過程中在面團(tuán)或面團(tuán)組分中添加依據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶并在適宜的條件下將所制作的面團(tuán)進(jìn)行冷凍。
37.依據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中將解淀粉酶同依據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶一起加入。
38.依據(jù)權(quán)利要求36和37任意一項(xiàng)的方法，其中加入如權(quán)利要求26-29中任意一項(xiàng)所定義的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物形式的酶。
39.通過如權(quán)利要求30-38中任意一項(xiàng)的方法制作的烘烤產(chǎn)品或面團(tuán)。
40.含有依據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)的改進(jìn)面包或面團(tuán)的組合物的面團(tuán)用預(yù)混物。
41.利用依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求26-29中任意一項(xiàng)的組合物來改善烘烤產(chǎn)品的味道。
42.利用依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求26-29中任意一項(xiàng)的組合物來改善烘烤產(chǎn)品的面團(tuán)粘性。
43.利用依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求26-29中任意一項(xiàng)的組合物來改善烘烤產(chǎn)品的面心結(jié)構(gòu)。
44.利用依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求26-29中任意一項(xiàng)的組合物來改善烘烤產(chǎn)品的外皮色澤。
45.將依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求23-25中任意一項(xiàng)的酶制劑用于食料的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
46.依據(jù)權(quán)利要求45的應(yīng)用，用于去除食料中蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味。
47.依據(jù)權(quán)利要求45和46的應(yīng)用，其中待水解的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物為動(dòng)物來源的，如酪蛋白或乳清蛋白。
48.依據(jù)權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中食料為奶酪。
49.依據(jù)權(quán)利要求45和46的應(yīng)用，其中待水解的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物為植物來源的，如大豆蛋白。
50.依據(jù)權(quán)利要求49的應(yīng)用，其中食料包括可可。
51.利用依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求23-25中任意一項(xiàng)的酶制劑清洗接觸透鏡。
52.將依據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的表現(xiàn)氨肽酶活性的酶或如權(quán)利要求23-25中任意一項(xiàng)的酶制劑用于釀造。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表現(xiàn)氨肽酶活性、衍生自真菌微生物的35kDa的酶,一種含編碼該酶的DNA序列的DNA構(gòu)建體,一種含該DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體以及一種含該DNA序列的細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供表現(xiàn)氨肽酶活性的該酶的生產(chǎn)方法,以及含該酶的酶制劑,含本發(fā)明氨肽酶的改善面包和面團(tuán)的組合物。最后,本發(fā)明還涉及對(duì)表現(xiàn)氨肽酶活性的該酶、或其酶制劑及其組合物的利用。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1178551SQ96192610
公開日1998年4月8日 申請(qǐng)日期1996年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月16日
發(fā)明者S·卡比內(nèi), J·Q·司, T·斯彼德勒, C·達(dá)穆比瑪恩, T·哈勒吉爾, P·R·奧斯特加德 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司