專利名稱：位點特異性聚乙二醇化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)、肽和其他分子中具有未氧化的巰基側(cè)鏈和游離a-氨基的半胱氨酸殘基的化學(xué)選擇性聚乙二醇化的方法。
背景技術(shù)：
不像通常通過口服途徑施用的小分子藥物，基于蛋白質(zhì)和肽的治療劑 由于它們極其低的口服生物利用度通常通過注射施用。注射后大多數(shù)蛋白 質(zhì)和肽會被酶快速斷裂并從機體清除，導(dǎo)致短暫的體內(nèi)循環(huán)半衰期。這種 短暫的循環(huán)半衰期是效能較低、施用更頻繁、患者順應(yīng)性減少以及蛋白質(zhì) 和肽治療法成W高的主要原因。因此，強烈需要開發(fā)延長蛋白質(zhì)和肽藥 物作用的持續(xù)時間的方法。
蛋白質(zhì)或肽與聚乙二醇(PEG)的共價連接(Covalent attachment)已證 明是增加機體中蛋白質(zhì)和肽的循環(huán)半衰期的有用方法(Abuchowski， A.等人， Cancer Biochem. Biophys" 1984， 7:175-186; Hershfield， M.S.等人，N. Engl. 丄Medicine 316:589-596;和Meyers, F. J.等人,Clin. Pharmacol. Ther.， 1991， 49:307-313)。 PEG與蛋白質(zhì)和肽的共價連接不僅保護分子免遭酶降 解，而且降低它們從機體中清除的速率。與蛋白質(zhì)連接的PEG的大小對蛋 白質(zhì)的循環(huán)半衰期有顯著的影響。通常PEG越大，結(jié)合的蛋白質(zhì)的體內(nèi)半 衰期越長。幾種大小的PEG市售可得(Nektar Advanced PEGylation Catalog 2005-2006;和NOF DDS Catalogue Ver 7.1)，它們適用于產(chǎn)生具 有靶向循環(huán)半衰期的蛋白質(zhì)和肽。PEG部分還增加蛋白質(zhì)、肽和其他分子 的水溶性并且降低免疫原性(Katre， N.V.等人，Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 1998， 84:1487-1491; 和Katre N.V.等人，J. Immunology, 19卯，144:209-213)。
已經(jīng)在文獻中報道對蛋白質(zhì)進行聚乙二醇化的幾種方法。例如，N-羥 基琥珀酰亞胺(NHS)-PEG用于聚乙二醇化蛋白質(zhì)的N-末端和賴氨酸殘基 的游離氨基。由于蛋白質(zhì)通常包含多個賴氨酸殘基和末端氨基，所以通過 使用這種方法蛋白質(zhì)的多個位點將被聚乙二醇化。這種非選擇性聚乙二醇 化導(dǎo)致聚乙二醇化蛋白質(zhì)的功效降低，因為多個PEG部分通常會擾亂蛋白 質(zhì)與其生物靼分子之間的相互作用(Teh， L.-C.和Chapman, G.E.， Biochem. Biophys. Res. Comm., 1988， 150:391畫398;及Clark， R.等人，J. Biol. Chem. 1996， 271:21969-21977)。多位點的非選擇性聚乙二醇化還造成終產(chǎn)物的非 均質(zhì)混合物。很多這些非均質(zhì)的聚乙二醇化的蛋白質(zhì)由于低的比活性而不 適于醫(yī)療用途。很難純化和表征非均質(zhì)的聚乙二醇化的蛋白質(zhì)。不同批的 非均質(zhì)的聚乙二醇化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間含量的變化通常很高，并且很難對 這些混合物進行質(zhì)量控制。
盡管含有醛基的PEG已用于在還原劑的存在下對蛋白質(zhì)的氨基末端 進行聚乙二醇化，但是這樣的方法不產(chǎn)生唯一的N-末端聚乙二醇化的蛋白 質(zhì)，蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基也被聚乙二醇化。因此，所得的蛋白質(zhì)也是非均 質(zhì)混合物(Kinstler O. B.等人，U.S. Application No. 09/817,725)。這種方法 也具有使用苛刻的還原反應(yīng)條件的缺點。還原劑如氰基硼氫化物能損害蛋 白質(zhì)，造成較低的反應(yīng)產(chǎn)率。
具有馬來酰亞胺官能團的PEG用于選擇性聚乙二醇化蛋白質(zhì)中的半 胱氨酸殘基的游離巰基。這種方法經(jīng)常需要帶來新半胱氨酸的點突變。由 于大多數(shù)蛋白質(zhì)包含一個或多個半胱氨酸殘基，所以為選擇性阻止該新的 "非天然"半胱氨酸殘基的巰基與其他半胱氨酸殘基形成二硫鍵、并且然后 為了選擇性聚乙二醇化該特定的新半胱氨酸，需要復(fù)雜的反應(yīng)條件(2004 年6月22日授權(quán)的美國專利第6,753,165號；和2003年8月19日授權(quán)的 美國專利第6，608，183號)。甚至在受控的反應(yīng)條件下，其他半胱氨酸殘基 也可被聚乙二醇化并且獲得非均質(zhì)材料。
曾報道生長激素類似物的乙酰苯丙氨酸殘基的位點特異性聚乙二醇
16化。這種方法需要帶來非天然氨基酸乙酰苯丙氨酸的點突變(于2005年1 月28號提交的美國專利申請第11/046,432號)。這種方法的缺點之一是含 非天然氨基酸如乙酰苯丙氨酸的蛋白質(zhì)的聚乙二醇化只可在細菌中進行但 不可在哺乳動物細胞中進行。
由胺硫內(nèi)酯與白介素-2的游離氨基的反應(yīng)所產(chǎn)生的游離巰基和氨基已 用于聚乙二醇化所述蛋白質(zhì)。然而，在這種方法中，所用的胺硫內(nèi)酯與蛋 白質(zhì)的N-末端和賴氨酸殘基中的任何氨基官能團均反應(yīng)，這種方法不是位 點選擇性的(2001年10月30日授權(quán)的美國專利第6，310，180號)。
因此，盡管來自不同研究組的先前努力，但是仍強烈需要開發(fā)容易且 實用的蛋白質(zhì)、肽和其他分子的位點特異性聚乙二醇化的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明一般涉及用于位點特異性聚乙二醇化蛋白質(zhì)、肽和其他分子的 新方法。發(fā)現(xiàn)含有醛官能團的PEG(PEG-醛)與帶有未氧化的巰基側(cè)鏈和游 離a-氨基的半胱氨酸可以在寬pH范圍內(nèi)于水溶液中自發(fā)地反應(yīng)，生成噻 唑烷，這使得PEG-醛可以與含有各種各樣官能團的肽片段反應(yīng)，而這由 于PEG的親水性質(zhì)和大尺寸(例如30千道爾頓)在以前是不確定的。我們 還發(fā)現(xiàn)僅有帶未氧化的巰基側(cè)鏈和游離a-氨基的半胱氨酸殘基與PEG-醛 反應(yīng)。其他殘基中的其他官能團(例如不含游離a-氨基的半胱氨酸的巰基、 Arg的胍基、Lys的絲、Asp的側(cè)鏈氛基、Glu的側(cè)鏈氛基、Tyr的羥基 和Ser的羥基)不與PEG-醛反應(yīng)。
通過使用本發(fā)明，蛋白質(zhì)、肽和其他分子中僅含未氧化的巰基側(cè)鏈和
游離(X-氨基的半胱氨酸殘基被聚乙二醇化，而任何其他氨基酸均不被聚乙
二醇化。因此，本方法是高位點選擇性的。本發(fā)明聚乙二醇化方法的位點 特異性性質(zhì)導(dǎo)致更為均質(zhì)的產(chǎn)物，所述均質(zhì)產(chǎn)物容易表征、純化和制備并 且其不同批次之間的含量差異較小。連接在蛋白質(zhì)和肽的特異性位點(即 N-末端半胱氨酸)的PEG應(yīng)該有較少的機會與生物靶點相互作用，并因此 應(yīng)導(dǎo)致更有效的治療劑。在本發(fā)明中，PEG的醛官能團可以與蛋白質(zhì)或肽的N-末端的半胱氨 酸殘基的氨基和巰基官能團在pH范圍(例如pH 2-8)內(nèi)在不同溫度(例如室 溫)在水溶液中自發(fā)地反應(yīng)。在PEG和蛋白質(zhì)或肽之間新產(chǎn)生的官能團是 1,3-噻唑烷。谷氨酸和天冬氨酸殘基的M和C-末端羧基、賴氨酸殘基的 氨基、精氨酸殘基的胍基、中間半胱氨酸殘基的巰基與絲氨酸、蘇氨酸和 酪氨酸殘基的羥基在這種聚乙二醇化條件下不與PEG的醛官能團反應(yīng)。因 此，本發(fā)明提供N-末端半胱氨酸殘基的位點特異性聚乙二醇化。為了在聚 乙二醇化期間防止二硫鍵生成，可以使用還原劑如三(羧乙基)膦(TCEP)并 且所述反應(yīng)可以在氮和氬下進行?？梢允褂?-4當(dāng)量的PEG-醛。反應(yīng)通常 在2至72小時完成，這取決于溶液的pH和所用PEG-醛的當(dāng)量。如果聚 乙二醇化在未折疊蛋白上發(fā)生，則所述蛋白產(chǎn)物可在聚乙二醇化后重折疊。 如果聚乙二醇化在正確折疊的蛋白上進行，則重折疊步驟可省略。
用于本發(fā)明的PEGs可具有不同的分子量(例如2-40千道爾頓)，具有 線性、支鏈和多臂(multi-arm)結(jié)構(gòu)并且包含一個或一個以上醛官能團。當(dāng) 使用包含兩個醛官能團的PEG時，終產(chǎn)物將是蛋白質(zhì)或肽二聚物并且之間 的連接基團(linker)是PEG。含有多個醛官能團的PEG將產(chǎn)生聚乙二醇化
的蛋白質(zhì)或肽的多聚體。
緩沖溶液體系如PBS可用于控制反應(yīng)溶液的pH。該反應(yīng)溶液還可包 含其他試劑如EDTA以促進所述反應(yīng)。
最終的聚乙二醇化的蛋白質(zhì)和肽可通過不同純化方法如反相高效液相 色譜法(RP-HPLC)、尺寸排阻色語法和離子交換色譜法來純化，并且可以 通過MALDI-MS、色鐠法、電泳、氨基酸分析和蛋白質(zhì)及肽測序技術(shù)來表 征。
在第 一 實施方案中，本發(fā)明涉及使含游離醛基的PEG與分子的半胱氨 酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離ot-氨基化學(xué)綴合的方法，所述方法包括使 所述PEG的游離醛基與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-氨 基反應(yīng)以在產(chǎn)物中生成1，3-噻唑烷基團，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
18其中Ri是所述PEG，且R2是所述分子。
在第二實施方案中，本發(fā)明涉及使含游離醛基的PEG與分子的半胱氨 酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-JL^化學(xué)綴合的方法，所述方法包括使 所述PEG的游離醛基與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-氨 基在反應(yīng)溶液中反應(yīng)以在中間體中生成1，3-噻唑烷基團，和將該反應(yīng)溶液 的pH調(diào)節(jié)至約為7，由此所述中間體重排以生成終產(chǎn)物，其中所述中間體 具有以下結(jié)構(gòu)
其中R!是所述PEG，且R2是所述分子。在這里，術(shù)語"約，，表示± 10%。 在第三實施方案中，本發(fā)明涉及使含游離醛基的PEG與分子的青霉胺 殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-氨基化學(xué)綴合的方法，所述方法包括使所 述PEG的游離醛基與所述青審胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-M反 應(yīng)以在產(chǎn)物中生成5，5-二甲基-1，3-噻唑烷基團，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié) 構(gòu)
其中R是所述PEG ，且R2是所述分子。
在第四實施方案中，本發(fā)明涉及使含游離醛基的PEG與分子的青霉胺 殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包括使所
且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu):
19述PEG的游離趁基與所述青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-氨基在 反應(yīng)溶液中反應(yīng)以在中間體中生成5，5-二曱基-1，3-噻唑烷基團，和將該反 應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約為7，由此所述中間體重排以形成終產(chǎn)物，其中所述 中間體具有以下結(jié)構(gòu)
且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
hq
s、
n一 \r h
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。在這里，術(shù)語"約，，表示± 10%。 在第五實施方案中，本發(fā)明涉及使含游離醛基的PEG與分子的同型半 胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包 括使所述PEG的游離醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和 游離a-氨基反應(yīng)以在產(chǎn)物中生成六元環(huán)系統(tǒng)，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
其中&是所述PEG，且R2是所述分子。
在第六實施方案中，本發(fā)明涉及使含游離醛基的PEG與分子的同型半 胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離(X-J^化學(xué)綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和 游離a-氨基在反應(yīng)溶液中反應(yīng)以在中間體中生成六元環(huán)系統(tǒng)，和將該反應(yīng) 溶液的pH調(diào)節(jié)至約為7，由此所述中間體重排以形成終產(chǎn)物，其中所述中 間體具有以下結(jié)構(gòu)
20且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu):
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。在這里，術(shù)語"約，，表示± 10%。 在第七實施方案中，本發(fā)明涉及將含游離醛基的PEG與分子的硒代半 胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和 游離a-氨基反應(yīng)以在產(chǎn)物中生成五元環(huán)系統(tǒng)，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。
在第八實施方案中，本發(fā)明涉及將含游離醛基的PEG與分子的硒代半 胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-^化學(xué)綴合的方法，所述方法包 將所述PEG的游離醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游 離a-tJ^在反應(yīng)溶液中反應(yīng)以在中間體中生成五元環(huán)系統(tǒng)，并且將該反應(yīng) 溶液的pH調(diào)節(jié)至約為7，由此所述中間體重排以形成終產(chǎn)物，其中所述中 間體具有以下結(jié)構(gòu)
其中！^是所述PEG,且R2是所述分子。在這里，術(shù)語"約，，表示± 10%。 在第九實施方案中，本發(fā)明涉及將含游離醛基的PEG與分子的N-甲 基-半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-甲基-tt化學(xué)綴合的方法，
且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu):
21所述方法包括將所述PEG的游離醛基與所述N-甲基-半胱氨酸殘基的未氧 化巰基側(cè)鏈和游離a-曱基-氨基反應(yīng)以在產(chǎn)物中生成3-甲基-l，3-噻唑烷基 團，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
<formula>formula see original document page 22</formula> ，
其中是所述PEG，且R2是所述分子。
在本發(fā)明的每一個前述實施方案中-即本發(fā)明的第一到第九實施方案 -所述游離醛基通過連接基團與所述PEG連接，所述連接基團可包含酰 胺、酯、磺酰胺、磺?；?、巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬 來酰亞胺或胺官能團或其任何組合。
在第十實施方案中，本發(fā)明涉及將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與分 子的N-甲基-半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法 包括將所述PEG的游離馬來酰亞胺基團與所述N-曱基-半胱氨酸的未氧化 巰基側(cè)鏈反應(yīng)以生成綴合產(chǎn)物，其中所述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
其中R,是所述PEG，且R2是所述分子。
在第十一實施方案中，本發(fā)明涉及將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與 分子的青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所 述PEG的游離馬來酰亞胺基團與所述青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈反應(yīng) 以生成綴合產(chǎn)物，其中所述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中R！是所述PEG ，且R2是所述分子。
在第十二實施方案中，本發(fā)明涉及將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與 分子的同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離馬來酰亞胺基團與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化 巰基側(cè)鏈反應(yīng)以生成綴合產(chǎn)物，其中所述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
其中Ri是所述PEG，且R2是所述分子。
在第十三實施方案中，本發(fā)明涉及將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與 分子的硒代半胱氨酸殘基的未氧化竭基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法包 括將所述PEG的游離馬來酰亞胺基團與所述硒代半胱氨酸殘基的未氧化 硒基側(cè)鏈反應(yīng)以生成綴合產(chǎn)物，其中所述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)
其中R!是所述PEG，且Rz是所述分子。
在本發(fā)明的每一個前述實施方案-即本發(fā)明的第十到第十三實施方案 一中，游離馬來酰亞胺基團通過連接基團與所述PEG連接，所述連接基團 可包含酰胺、S旨、磺酰胺、磺?；?、巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團或其任何組合。
在本發(fā)明的所有前述實施方案中，PEG可具有線性結(jié)構(gòu)、支鏈結(jié)構(gòu)或 多臂結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的所有前述實施方案中，PEG具有約100道爾頓至約500,000 道爾頓的平均分子量，且更優(yōu)選具有約1,000道爾頓至約50,000道爾頓的 平均分子量。
發(fā)明詳述
本領(lǐng)域技術(shù)人員被認為可以根據(jù)本文描述利用本發(fā)明至其最充分的程 度。因此，下面特定的實施方案應(yīng)理解為僅僅是舉例說明性的，而無論如 何并不限定本發(fā)明的剩余部分。
除非另有定義，本文所用的所述^L術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。同樣，本文所提到的所有出版 物、專利申請、專利和其他參考文獻各自以其全部內(nèi)容通過引用并入。
命名法和縮寫符號含義
Ala或A丙氨酸
Arg或R精氨酸
Asn或N天冬酰胺
Asp或D天冬氨酸
Cys或C半胱氨酸
hCys同型半胱氨酸
Gln或Q谷氨酰胺
Glu或E谷氨酸
Gly或G甘氨酸
His或H組氨酸
Ile或I異亮氨酸Lieu或L Lys或K Met或M Nle
N-Me-Cys或NmeCys
PEG Pen
Phe或F Pro或P Ser或S sdcuoCys Thr或T Trp或W Tyr或Y Val或V
亮氨酸 賴氨酸 甲硫氨酸 正亮氨酸
N-曱基-半胱氨酸，其具有以下結(jié)構(gòu):
HS
N
CH3 6 聚乙二醇
青
霉胺
苯丙氨酸
脯氨酸
絲氨酸
硒代半胱氨酸 蘇氨酸 色氨酸 酪氨酸
本文所用的某些其他縮寫如下定義:
Boc 叔丁氧羰基
Bzl 千基
DCM 二氯曱烷
DIC N，N-二異丙基碳二亞胺
DIEA 二異丙基乙胺
Dmab 4-{]\-(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)己亞基)-3畫曱丁基)-氨基} 千基
DMAP 4-(二甲^&)吡啶<image>image see original document page 26</image><formula>formula see original document page 27</formula>馬來酰亞胺具有以下結(jié)構(gòu)
O
N
Prd
O
吡咯烷-2，5-二酮，其具有以下結(jié)構(gòu):O
N
O
NMeCys(Prd-PEG)具有以下結(jié)構(gòu):
O
PEG—NS.
O
PEG — N
O
S
HN
O
hCys(Prd-PEG)具有以下結(jié)構(gòu):
O
Pen(Prd-PEG)具有以下結(jié)構(gòu):
O
NIC
28selenoCys(Prd-PEG)具有以下結(jié)構(gòu)
<formula>formula see original document page 29</formula>
PEG是眾所周知的、水溶性聚合物，它是市售可得的或可根據(jù)本領(lǐng)域 已知的方法通過乙二醇的開環(huán)聚合來制備(Sandler和Karo， Polymer Synthesis, Academic Press, New York,第3巻，第138-161頁)。術(shù)語"PEG，， 按廣義使用，包括任何聚乙二醇分子，而不涉及PEG的大小和末端修飾。 PEG可具有線性、支鏈或多臂結(jié)構(gòu)。
實施例
實施例1)制備H-NMeCys-Lys-Phe-NH;
<formula>formula see original document page 29</formula>
將Rink酰胺MBHA樹脂(211mg， 0.152毫摩爾)(Novabiochem， San Diego, Calif.)在二氯曱烷(DCM)中溶脹，并用二甲基甲酰胺(DMF)洗滌。 通過用25。/。哌咬/DMF (10mL)溶液處理2 x 10分鐘，使樹脂脫封閉 (debolck)。將樹脂用DMF (lOmL)洗滌三次。通過用Fmoc-Phe-OH(Novabiochem， San Diego, Calif.) (235mg， 0.606毫摩爾)、l畫羥基苯并三喳 (HOBt) (92.3mg， 0.606毫摩爾)和二異丙基碳二亞胺(DIC) (77mg， 0.606亳 摩爾)在N-曱基吡咯烷酮(NMP) (2mL)中的溶液處理l小時，將第一個氨 基酸偶聯(lián)到樹脂。將樹脂過濾，并用DMF(10mL)洗滌三次。
通過用25。/。哌咬/DMF (10mL)溶液處理2 x 10分鐘，將Fmoc保護基 去除，并且將樹脂用DMF (10mL)洗滌三次。于存在NMP (2mL)中的HOBt (0.606毫摩爾)和DIC (0.606毫摩爾)的情況下1小時，將Fmoc-Lys(Boc)-OH (Novabiochem, San Diego, Calif.) (285mg， 0.606毫摩爾)偶聯(lián)到所得的游離 胺樹脂。
如上重復(fù)脫封閉和洗滌操作。通過使用NMP(2mL)中的HOBt(51mg， 0.33 毫摩爾)和DIC (83.8mg， 0.66 毫摩爾)12 小時，將 Fmoc-N誦Me-Cys(Trt)-OH (Timen Chemicals, Lodz， Poland.) (100mg， 0.167 亳摩爾)偶聯(lián)到所得的肽-樹脂。通過使用NMP(2mL)中的四甲基氟代甲脒 鏞五氟磷酸鹽(TFFH) (20mg, 0.075毫摩爾)和二異丙基乙胺(DIEA) (19.4mg， 0.150毫摩爾)l小時，重復(fù)Fmoc-N-Me-Cys(Trt)-OH (45mg， 0.075 亳摩爾)的偶聯(lián)。如上重復(fù)脫封閉和洗滌操作。將樹脂用DCM洗滌三次， 然后用甲醇洗滌三次。在空下干燥所述樹脂。
通過用三異丙基硅烷(trispr叩ylsilane)/三氟乙酸(TFA) pmL)振搖樹 脂2小時，將肽從所述樹脂上斷裂下來。將樹脂過濾并用DCM (2mL)洗滌。 將濾液合并，且濃縮至lmL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。離心后收集沉 淀的肽。將沉淀物溶解于水和乙腈中，然后凍干。
將所得的粗品在反相HPLC系統(tǒng)(Lima 5微米C8 (2) 100 X 20mm柱) 上純化，從100o/o緩沖液A(水中的0.iy。TFA)和00/0緩沖液B(乙腈中的 0.1% TFA)至80%緩沖液A和20%緩沖液B洗脫30分鐘并在235nm下 監(jiān)控。凍干后，獲得51.2 mg終產(chǎn)物。通過ESI質(zhì)譜分析法檢測到410.3 道爾頓的M+l離子，這與計算的分子量409.6道爾頓相符。
實施例2) 制備mPEG-Tmc-Lvs-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。CH30(CH2CH20)n-CH2CH
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
將實施例1的肽產(chǎn)物(0.5mg， 1.22微摩爾)溶解于l.OmL pH 4緩沖液 (20毫摩爾NaOAc， 150毫摩爾NaCl和1毫摩爾EDTA)。將mPEG-醛(1.5 當(dāng)量，平均分子量為31378道爾頓，NOF Corp., Tokyo, Japan)加至所得溶 液中。根據(jù)通過使用反相分析型HPLC系統(tǒng)(Vydac C18 5^i肽/蛋白質(zhì)柱，4.6 x 250mm)所進行的分析，反應(yīng)在室溫下27小時后大約完成卯％。將反應(yīng) 〉'昆合物上才羊于5mL ZebaTM脫鹽自方走柱(Pierce Biotechnology, Rockford， IL)。凍干后獲得白色泡沫狀物(36.7mg)。
實施例3) 制備H-NMeCvs(Prd-PEG)畫Lvs-Phe-NH2
將實施例1的肽產(chǎn)物(0.5mg， 1.22樹摩爾)溶解于1.0mL pH 7緩沖液 (20毫摩爾NaOAc)。將a-(3-(3-馬來酰亞氨基-l-氧代丙基)^J^)丙基-co-甲 氧基-聚氧乙烯(1.5當(dāng)量，平均分子量為11962道爾頓，NOF Corp., Tokyo, Japan)和2當(dāng)量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)加至所得溶液。根據(jù)通過 使用反相分析型HPLC系統(tǒng)(Vydac C18 ^/蛋白質(zhì)柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應(yīng)在室溫下1小時后完成。將反應(yīng)混合物上樣于5mL ZebaTM 脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)。凍干后獲得白色泡沫狀 物(15.1mg)。將該產(chǎn)物在High Trap SPXL陽離子交換柱(GEHealthcare, Piscataway， NJ)上進一步純化。經(jīng)純化的產(chǎn)物的分子量分布通 過使用MALDI-TOF質(zhì)譜分析法來確定。所獲得的實驗結(jié)果與計算的分子 量分布一致。
實施例4) 制備H-Cys-Lys-Phe-NH2
使用Rink酰胺MBHA樹脂(347mg， 0.25毫摩爾)(Novabiochem， San Diego, Calif.)在LibertyTM型微波肽合成儀(CEM Corp., Matthews, NC)上 合成標(biāo)題肽。利用HBTU活化，以四倍過量使用氨基酸Fmoc-Phe-OH、 Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH (Novabiochem， San Diego, CA)， 并且重復(fù)進行每個偶聯(lián)。
通過用三異丙^J^烷/三氟乙酸(TFA)和1%二硫蘇糖醇(10mL)振搖 樹脂3小時，將肽從所述樹脂上斷裂。將樹脂過濾并用DCM (5mL)洗滌。 將該濾液合并，且濃縮至3mL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。離心后收集 沉淀的肽。將沉淀物溶解于水和乙腈中，然后凍干。
將所得的粗品在反相HPLC系統(tǒng)(Luna5微米C8 (2) 100 X 20mm柱) 上純化，從100。/o緩沖液A(水中的0.1。/。TFA)和0。/0緩沖液B(乙腈中的 0.1% TFA)至70%緩沖液A和30%緩沖液B洗脫35分鐘并在235nm下 監(jiān)控。凍干后，獲得89.1 mg終產(chǎn)物。通過ESI質(zhì)譜分析法檢測396.5道 爾頓的M+1離子，這與計算的分子量395.5道爾頓相符。
實施例5)制備mPEG-Tha-Lvs-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。
32CH30(CH2CH20)n-CH2CH
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
將實施例4的肽產(chǎn)物(O.Smg, 126微摩爾)溶解于1.0mLpH4緩沖液 (20毫摩爾NaOAc)。將mPEG-醛(1.5當(dāng)量，平均分子量為20644道爾頓， NOF Corp., Tokyo, Japan)和TCEP (2.0當(dāng)量)加至所得溶液中。根據(jù)通過 使用反相分析型HPLC系統(tǒng)(Vydac C18 5|n肽/蛋白質(zhì)柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應(yīng)在室溫下3小時后大約完成85%。將反應(yīng)混合物加樣于 lOmL ZebaTM脫鹽自》走柱(Pierce Biotechnology, Rockford， IL)。凍干后獲 得白色泡沫狀物。
實施例6) 制備H-hCvs- Lvs-Phe-NH2
使用Rink酰胺MBHA樹脂(347mg， 0.25毫摩爾)(Novabiochem, San Diego， Calif.)在LibertyTM型微波肽合成儀(CEM Corp" Matthews, NC)上 合成標(biāo)題肽。利用HBTU活化，以四倍過量使用氨基酸Fmoc-Phe-OH、 Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc-hCys(Trt)畫OH (Novabiochem, San Diego, CA)，并且重復(fù)進行每個偶聯(lián)。
通過用三異丙M烷/三氟乙酸(TFA)和1%二硫蘇糖醇(10mL)振搖 樹脂3小時，將M所述樹脂上斷裂。將樹脂過濾并用DCM (10mL)洗滌。 將該濾液合并，且濃縮至3mL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。離心后收集 沉淀的肽。將沉淀物溶解于7JC和乙腈中，然后凍干。
將所得的粗品在反相HPLC系統(tǒng)(Luna5微米C8 (2) 100X20mm柱) 上純化，從100。/。緩沖液A(水中的0.1。/oTFA)和0。/。緩沖液B(乙腈中的0.1% TFA)至75%緩沖液A和25%緩沖液B洗脫35分鐘并在235nm下 監(jiān)控。凍干后，獲得85.7 mg終產(chǎn)物。通過ESI質(zhì)鐠分析法檢測到410.5 道爾頓的M+1離子，這與計算的分子量409.6道爾頓相符。 實施例7) 制備H-Pen- Lys-Phe-NBb
使用Rink酰胺MBHA樹脂(347mg, 0.25毫摩爾)(Novabiochem, San Diego， Calif.)在LibertyTM型微波肽合成儀(CEM Corp., Matthews, NC)上 合成標(biāo)題肽。利用HBTU活化，以四倍過量使用氨基酸Fmoc-Phe-OH、 Fmoc Lys(Boc)-OH和Fmoc畫Pen(Trt)-OH (Novabiochem， San Diego， CA)， 并且重復(fù)進行每個偶聯(lián)。
通過用三異丙基硅烷/三氟乙酸(TFA)和1%二硫蘇糖醇(10mL)振搖 樹脂3小時，將M所述樹脂上斷裂。將樹脂過濾并用DCM (5mL)洗滌。 將該濾液合并，且濃縮至3mL。加入乙醚(35mL)以沉淀肽。離心后收集 沉淀的肽。將沉淀物溶解于水和乙腈中，然后凍干。
將所得的粗品在反相HPLC系統(tǒng)(Luna 5微米C8 (2) 100 X 20mm柱) 上純化，從100y。緩沖液A(水中的0.1。/oTFA)和0。/。緩沖液B(乙腈中的 0.1% TFA)至80%緩沖液A和20%緩沖液B洗脫35分鐘并在235nm下 監(jiān)控。凍干后，獲得83.9 mg終產(chǎn)物。通過ESI質(zhì)譜分析法檢測到424.5 道爾頓的M+1離子，這與計算的分子量423.6道爾頓相符。
實施例8) 制備mPEG-Dma- Lys-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20)n-(CH2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。CH30(CH2CH20)n-CH2CH:
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
KF-NH2
將實施例7的肽產(chǎn)物(0.5mg, 1.18獨源爾)溶解于1.0mLpH4緩沖液 (20毫摩爾NaOAc)。將mPEG-醛(1.5當(dāng)量，平均分子量為20644道爾頓， NOF Corp., Tokyo, Japan)和TCEP (2.0當(dāng)量)加至所得溶液中。根據(jù)通過 l吏用反相分析型HPLC系統(tǒng)(Vydac C18 5fi肽/蛋白質(zhì)柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應(yīng)在室溫下3小時后大約完成80%。將反應(yīng)混合物加樣于 10mL ZebaTM脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford， IL)。凍干后獲 得白色泡沫狀物。
實施例9) 制備mPEG-Thc-Lvs-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。
將實施例6的肽產(chǎn)物(0.5mg，1.22賴b學(xué)爾)溶解于l.OmL pH 4緩沖液 (20毫摩爾NaOAc)。將mPEG-醛(1.5當(dāng)量，平均分子量為20644道爾頓， NOF Corp., Tokyo, Japan)和TCEP (2.0當(dāng)量)加至所得溶液中。根據(jù)通過 4吏用反相分析型HPLC系統(tǒng)(Vydac C18 5jt肽/蛋白質(zhì)柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，反應(yīng)在室溫下3小時后大約完成卯％。將反應(yīng)混合物加樣于 10mL ZebaTM脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)。凍干后獲 得白色泡沫狀物。
CH30(CH2CH20)n-CH2CH
H2N 、 O
KF-NH
35實施例10) 制備selenoCys- Lys-Phe-NB^
HSe、
,y'詣2
6
基本上依照實施例1中所述的操作合成標(biāo)題肽。Fmoc-selenoCys (4畫MeOBzl)-OH (Novabiochem, San Diego， CA)用于在N-末端并入硒代半 胱氨酸。
實施例11) 制備mPEG-Sez- Lys-Phe-NH2
mPEG在此具有CH30(ch2ch20)n-(ch2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。
HSe、
.0
CH30(CH2CH20)n-CH2CH2^^+ h n^^^KF-NH:
H 2
O
Se、
~^ CH30(CH2CH20)n-CH2CH2"
3 22 n 22 XN^\ /KF-NHc
H
O
基本上依照實施例2中所述的操作合成標(biāo)題肽。從實施例10獲得的產(chǎn) 物是肽起始材料。
O
H
CH30(CH2CH20)n-CH2ClV 〇 實施例12)制備_^
mPEG在此具有CH30(ch2ch20v(ch2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。
在60°C、 mPEG-C(O)OH銫鹽與溴代乙醛二甲基乙縮醛在DMF中反
應(yīng)2天。去除溶劑后，在0。C將產(chǎn)物用DCM中的40% TFA和少量水處
理約30分鐘。
實施例13) 制備mPEG-Hth-Lys-Phe-NH2
HO ,S
CH30(CH2CH20)n-CH2CH2
n, y KF—NH2
O
在此mPEG具有ch30(ch2ch20)n-(ch2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù):基本上依照實施例2中所述的操作合成標(biāo)題肽。肽起始材料是從實施 例4獲得的產(chǎn)物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產(chǎn)物。存在調(diào)節(jié) 緩沖液溶液的pH的額外步驟在pH4于室溫靜置2小時后，將反應(yīng)溶液 的pH調(diào)節(jié)至7，并在室溫靜置3天后純化。
實施例14) 制備mPEG-Hdm-Lvs-Phe-NH7
此處mPEG具有CHbO(CH2CH20V(CH2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。 基本上依照實施例8中所述的操作合成標(biāo)題肽。肽起始材料是從實施 例7獲得的產(chǎn)物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產(chǎn)物。存在調(diào)節(jié) 緩沖液溶液的pH的額外步驟在室溫靜置過夜后，將反應(yīng)溶液的pH調(diào) 節(jié)至7，并在純化前于室溫靜置溶液3天。
實施例15) 制備mPEG-Haz-Lys-Phe-NBb
此處mPEG具有CH30(CH2CH20V(CH2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)。 基本上依照實施例9中所述的操作合成標(biāo)題肽。肽起始材料是從實施 例6獲得的產(chǎn)物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產(chǎn)物。存在調(diào)節(jié) 緩沖液溶液的pH的額外步驟在pH4于室溫靜置過夜后，將反應(yīng)溶液的 pH調(diào)節(jié)至7，并在純化前于室溫靜置溶液3天。 實施例16) 制備mPEG-Hsz-Lys-Phe-NH^
在此mPEG具有CH30(CH2CH20)n-(CH2)2-的結(jié)構(gòu)，其中n為正整數(shù)?；旧弦勒諏嵤├?1中所述的操作合成標(biāo)題肽。肽起始材料是從實施
例IO獲得的產(chǎn)物。PEG-醛起始材料是從實施例12獲得的產(chǎn)物。存在調(diào)節(jié) 緩沖液溶液的pH的額外步驟在pH4于室溫靜置2小時后，將反應(yīng)溶液 的pH調(diào)節(jié)至7，并在純化前于室溫靜置溶液3天。 實施例17) 制備H-Pen(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH，
基本上依照實施例3中所述的操作合成標(biāo)題肽。肽起始材料是從實施 例7獲得的產(chǎn)物。
實施例18) 制備H-hCys(Prd-PEG)-Lys-Phe-NBb
將實施例6的肽產(chǎn)物(l.Omg， 2.44孩傳爾)溶解于l.OmL pH 7緩沖液 (20毫摩爾NaOAc)。將a-(3-(3-馬來酰亞氨基-l-氧代丙基)M)丙基-to-曱 氧基-聚氧乙烯(1.5當(dāng)量，平均分子量為11962道爾頓，NOF Corp., Tokyo, Japan)和2當(dāng)量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)加至所得溶液。根據(jù)通過 使用反相分析型HPLC系統(tǒng)(Vydac C18 肽/蛋白質(zhì)柱，4.6 x 250mm)所進 行的分析，在室溫下1小時后反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物加樣于lOmL ZebaTM 脫鹽自旋柱(Pierce Biotechnology, Rockford，IL)。凍干后獲得白色泡沫狀 物。
實施例19) 制備H畫selenoCvs(Prd-PEG)-Lys-Phe-NH2
38<formula>formula see original document page 39</formula>基本上依照實施例3中所述的操作合成標(biāo)題肽。肽起始材料是從實施 例IO獲得的產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種將含游離醛基的PEG與分子的半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離α-氨基化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離α-氨基反應(yīng)以在產(chǎn)物中生成1，3-噻唑烷基團，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中R1是所述PEG，且R2是所述分子。
2. —種將含游離醛基的PEG與分子的半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè) 鏈和游離(x-氨基化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基 與所述半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-tj^在反應(yīng)溶液中反應(yīng)以 在中間體中生成1，3-噻唑烷基團，和將所述反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約為7， 由此所述中間體重排以形成終產(chǎn)物，其中所述中間體具有以下結(jié)構(gòu)其中Ri是所述PEG,且R2是所述分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中游離醛基通過連接基團與所述 PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、S旨、磺酰胺、磺酰基、巰基、氧基、 烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其任何組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu):
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中一個或多個游離醛基與所述PEG 連接。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述PEG具有約1,000道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基為L型。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基為D型。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)中。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基在肽中。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述半胱氨酸殘基在有機分子中。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述產(chǎn)物或所述終產(chǎn)物包含一 個或多個蛋白質(zhì)、肽或有機分子部分、或其任何組合。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述中間體包含一個或多個蛋白質(zhì)、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
19. 一種將含游離醛基的PEG與分子的青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈 和游離a-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與 所述青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-M反應(yīng)以在產(chǎn)物中生成5，5-二曱基-l，3-噻唑烷基團，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 3</formula>其中Ri是所述PEG ，且R2是所述分子。
20. —種將含游離醛基的PEG與分子的青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-tj^化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與 所述青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-氨基在反應(yīng)溶液中反應(yīng)以在中 間體中生成5，5-二曱基-1，3-噻唑垸基團，和將所述反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約 為7，由此所述中間體重排以形成終產(chǎn)物，其中所述中間體具有以下結(jié)構(gòu)其中R!是所述PEG，且R2是所述分子。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中游離醛基通過連接基團與所 述PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺?；?、巰基、氧 基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其任何組合。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中一個或多個游離醛基與PEG 連接。
26. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述PEG具有約IOO道爾頓 至約500,000道爾頓的平均分子量。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述PEG具有約1,000道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
28. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述青霉胺殘基為L型。
29. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述青霉胺殘基為D型。
30. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述青霉胺殘基在蛋白質(zhì)中。
31. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述青霉胺殘基在肽中。且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu):
32. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述青霉胺殘基在有機分子中。
33. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述產(chǎn)物或所述終產(chǎn)物包含 一個或多個蛋白質(zhì)、肽或有機分子部分、或其任何組合。
34. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述中間體包含一個或多個 蛋白質(zhì)、肽或有機分子部分、或其任何組合。
35. 根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
37. —種將含游離醛基的PEG與分子的同型半胱氨酸殘基的未氧化巰 基側(cè)鏈和游離a-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-氨基反應(yīng)以在產(chǎn) 物中生成六元環(huán)系統(tǒng)，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中R是所述PEG，且R2是所述分子。
38. —種將含游離醛基的PEG與分子的同型半胱氨酸殘基的未氧化巰 基側(cè)鏈和游離a-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-氨基在反應(yīng)溶液 中反應(yīng)以在中間體中生成六元環(huán)系統(tǒng)，和將該反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約為 7，由此所述中間體重排以形成終產(chǎn)物，其中所述中間體具有以下結(jié)構(gòu)且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu):R1 R2其中Rt是所述PEG，且R2是所述分子。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中游離醛基通過連接基團與所 述PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺酰基、巰基、氧 基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其任何組合。
40. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
42. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中一個或多個游離醛基與所述 PEG連接。
44. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓 至約500,000道爾頓的平均分子量。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述PEG具有約1，000道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
46. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為L型。
47. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為D型。
48. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在蛋 白質(zhì)中。
49. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在肽中。
50. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在有 機分子中。
51. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述產(chǎn)物或終產(chǎn)物包含一個 或多個蛋白質(zhì)、肽或有機分子部分、或其任何組合。
52. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中所述中間體包含一個或多個 蛋白質(zhì)、肽或有機分子部分、或其任何組合。
53. 根據(jù)權(quán)利要求37或38的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
55. —種將含游離醛基的PEG與分子的硒代半胱氨酸殘基的未氧化游 離硒基和游離a-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-M反應(yīng)以在產(chǎn) 物中生成五元環(huán)系統(tǒng)，其中所述產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中&是所述PEG，且R2是所述分子。
56. —種將含游離醛基的PEG與分子的硒代半胱氨酸殘基的未氧化游 離竭基和游離a-tJ^化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 醛基與所述竭代半胱氨酸殘基的未氧化游離硒基和游離a-氨基在反應(yīng)溶液 中反應(yīng)以在中間體中生成五元環(huán)系統(tǒng)，和將該反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)至約為 7,由此所述中間體重排以形成終產(chǎn)物，其中所述中間體具有以下結(jié)構(gòu)其中R,是所述PEG,且R2是所述分子。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中游離醛基通過連接基團與所 述PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺?；?、巰基、氧 基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其任何組合。且所述終產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu):
58. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
59. 才艮據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
60. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
61. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中一個或多個游離醛基與所述 PEG連接。
62. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓 至約500,000道爾頓的平均分子量。
63. 根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中所述PEG具有約l，OOO道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
64. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基為L型。
65. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基為D型。
66. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述躅代半胱氨酸殘基在蛋 白質(zhì)中。
67. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基在肽中。
68. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基在有 機分子中。
69. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中所述產(chǎn)物或所述終產(chǎn)物包含 一個或多個蛋白質(zhì)、肽或有^f幾分子部分、或其任何組合。
70. 根據(jù)權(quán)利要求56的方法,其中所述中間體包含一個或多個蛋白質(zhì)、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
71. 根據(jù)權(quán)利要求55或56的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基或未氧化游離硒基的化合物組成的組。
73. —種將含游離醛基的PEG與分子的N-甲基-半胱氨酸殘基的未氧 化巰基側(cè)鏈和游離a-甲基-M化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離醛基與所述N-曱基-半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈和游離a-曱基-氨基反應(yīng)以在產(chǎn)物中生成3-甲基-l，3-噻唑烷基團，其中所述產(chǎn)物具有以下 結(jié)構(gòu)其中R是所述PEG，且R2是所述分子。
74. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中游離醛基通過連接基團與所述PEG 連接，所述連接基團可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺酰基、巰基、氧基、烷 基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其任何組合。
75. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
76. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
77. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
78. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中一個或多個游離醛基與所述PEG 連接。
79. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至約 500,000道爾頓的平均分子量。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79的方法，其中所述PEG具有約l，OOO道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
81. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基為L型。
82. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基為D型。
83. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基在蛋白 質(zhì)中。
84. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基在肽中。
85. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在有機 分子中。
86. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述產(chǎn)物包含一個或多個蛋白質(zhì)、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
87. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87的方法，其中所述還原劑選自由TCEP和含未氧 化巰基的化合物組成的組。
89. —種將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與分子的N-甲基-半胱氨酸 殘基的未氧化巰基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離 馬來酰亞胺基團與所述N-曱基-半胱氨酸的未氧化巰基側(cè)鏈反應(yīng)以生成綴 合產(chǎn)物，其中所述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中Ri是所述PEG,且R2是所述分子。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中游離馬來酰亞胺基團通過連接基團 與所述PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺酰基、巰基、 氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其任何組 合。
91. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
92. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
93. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
94. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中一個或多個游離馬來酰亞胺基團與 所述PEG連接。
95. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至約 500,000道爾頓的平均分子量。
96. 根據(jù)權(quán)利要求95的方法，其中所述PEG具有約l，OOO道爾頓至約 50,000道爾頓的平均分子量。
97. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基為L型。
98. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述N-曱基-半胱氨酸殘基為D型。
99. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在蛋白 質(zhì)中。
100. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在肽中。
101. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中所述N-甲基-半胱氨酸殘基在有機 分子中。
102. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，所述綴合產(chǎn)物包含一個或多個蛋白質(zhì)、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
103. 根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
104. 根據(jù)權(quán)利要求103的方法，其中所述還原劑為TCEP。
105. —種將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與分子的青霉胺殘基的未 氧化巰基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離馬來酰亞 胺基團與所述青霉胺殘基的未氧化巰基側(cè)鏈反應(yīng)以生成綴合產(chǎn)物，其中所 述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中R!是所述PEG,且R2是所述分子。
106. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述游離馬來酰亞胺基團通過連 接基團與所述PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺?；?、 巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其 任何組合。
107. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
108. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
109. 才艮據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
110. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中一個或多個游離馬來酰亞胺基團 與所述PEG連接。
111. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
112. 根據(jù)權(quán)利要求lll的方法，其中所述PEG具有約1，000道爾頓至 約50,000道爾頓的平均分子量。
113. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述青霉胺殘基為L型。
114. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述青霉胺殘基為D型。
115. 才艮據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述青霉胺殘基在蛋白質(zhì)中。
116. 才艮據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述青霉胺殘基在肽中。
117. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述青霉胺殘基在有機分子中。
118. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中所述綴合產(chǎn)物包含一個或多個蛋 白質(zhì)、肽或有機分子部分、或其任何組合。
119. 根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
120. 根據(jù)權(quán)利要求119的方法，其中所述還原劑是TCEP。
121. —種將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與分子的同型半胱氨酸殘 基的未氧化巰基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離馬 來酰亞胺基團與所述同型半胱氨酸殘基的未氧化巰基側(cè)鏈反應(yīng)以生成綴合 產(chǎn)物，其中所述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中R!是所述PEG,且R2是所述分子。
122. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述游離馬來酰亞胺基團通過連 接基團與所述PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、S旨、磺酰胺、磺?；?、 巰基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團，或其 任何組合。
123. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
124. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
125. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
126. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中一個或多個馬來酰亞胺基團與所 述PEG連接。
127. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
128. 根據(jù)權(quán)利要求127的方法，其中所述PEG具有約1，000道爾頓至 約50,000道爾頓的平均分子量。
129. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為L型。
130. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基為D型。
131. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)中。
132. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在肽中。
133. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中所述同型半胱氨酸殘基在有機分 子中。
134. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，所述綴合產(chǎn)物包含一個或多個蛋白質(zhì)、 肽或有機分子部分、或其任何組合。
135. 根據(jù)權(quán)利要求121的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
136. 根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述還原劑是TCEP。
137. —種將含游離馬來酰亞胺基團的PEG與分子的硒代半胱氨酸殘 基的未氧化竭基側(cè)鏈化學(xué)綴合的方法，所述方法包括將所述PEG的游離馬 來酰亞胺基團與所述硒代半胱氨酸殘基的未氧化硒基側(cè)鏈反應(yīng)以生成綴合 產(chǎn)物，其中所述綴合產(chǎn)物具有以下結(jié)構(gòu)其中Ri是所述PEG,且R2是所述分子。
138. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中游離馬來酰亞胺基團通過連接基 團與所述PEG連接，所述連接基團可包含酰胺、酯、磺酰胺、磺?；?、巰 基、氧基、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、馬來酰亞胺或胺官能團或其任何 組合。
139. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述PEG具有線性結(jié)構(gòu)。
140. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述PEG具有支鏈結(jié)構(gòu)。
141. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述PEG具有多臂結(jié)構(gòu)。
142. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中一個或多個游離馬來酰亞胺基團 與所述PEG連接。
143. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述PEG具有約100道爾頓至 約500,000道爾頓的平均分子量。
144. 根據(jù)權(quán)利要求143的方法，其中所述PEG具有約1,000道爾頓至 約50,000道爾頓的平均分子量。
145. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基為L型。
146. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述竭代半胱氨酸殘基為D型。
147. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)中。
148. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基在肽中。
149. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述硒代半胱氨酸殘基在有機分 子中。
150. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中所述綴合產(chǎn)物包含一個或多個蛋 白質(zhì)、肽或有機分子部分、或其任何組合。
151. 根據(jù)權(quán)利要求137的方法，其中還原劑用于所述反應(yīng)中。
152.根據(jù)權(quán)利要求151的方法，其中所述還原劑是TCEP。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)、肽和其他分子中具有未氧化的巰基側(cè)鏈和游離α-氨基的半胱氨酸殘基的化學(xué)選擇性聚乙二醇化的方法。本發(fā)明提供同型半胱氨酸、硒代半胱氨酸、青霉胺和N-甲基-半胱氨酸殘基的化學(xué)選擇性聚乙二醇化的類似方法。
文檔編號C08G63/00GK101495536SQ200780028146
公開日2009年7月29日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者J·S·埃耶昂, 董正新 申請人:科學(xué)研究和應(yīng)用咨詢股份公司