相關申請的交叉引用本申請要求于2014年10月17日提交的申請?zhí)枮?2/065122的美國臨時專利申請的優(yōu)先權，其通過引用以其整體并入本申請，并且用于所有目的。本公開涉及檢測和治療癌癥。更具體地說，其涉及生物標志物用于檢測、治療和監(jiān)測頭頸部癌癥的用途。
背景技術：
：頭頸部鱗狀細胞癌(hnscc)表示大約90％的所有頭頸部癌癥以及5％的所有惡性腫瘤。參見jemal等人(2009)和worshem等人(2013年)?？谇缓脱什堪┌Y各自是2008年美國男性中第八最常見的癌癥，并且美國2009年發(fā)現超過48000名hnscc的新患者(jemal等人)。已經發(fā)現hnscc在過去30年以增長的速度流行起來。參見worsham等人(2013年)。盡管醫(yī)學和癌癥治療在進步，但是患有hnscc的患者的存活率卻相當停滯。參見siegel等人(2013年)。這種低存活率與許多其它癌癥的存活率的增加成鮮明對比。對于hnscc不良預后的一個主要原因是超過半數的hnscc患者在診斷時已經發(fā)展為局部或轉移階段。因此，早期檢測可能是在將來改善存活率的關鍵。對于頭頸部癌癥的早期檢測，還未報道有效的方法。技術實現要素：本發(fā)明通過提供用于早期檢測某些類型的癌癥的方法使本領域前進。更具體地，公開了一組診斷性編碼微rna的甲基化基因組基因座(mgmir)標志物，其在檢測頭頸部鱗狀細胞癌(hnscc)中顯示出了90％的敏感性和100％的特異性。這些結果表示首次采用定量ms-pcr用于利用mgmir標志物來檢測甲基化水平。此外，該組微rna已經證實檢測癌癥患者旁黏膜中超甲基化的能力，表明其在早期檢測上的效用。該組還可以通過采用唾液、血液和細針抽吸(fna)組織樣品等等用于檢測癌癥。在一個實施方式中，公開了用于檢測受試者體內癌癥的方法，其可以包括(a)測定選自由mir124-1、124-2、124-3、137和9-1所組成的組的編碼至少一種微rna的至少一個基因組基因座的甲基化水平，和(b)將從受試者獲得的所述甲基化水平與來自已知無癌癥的個體的編碼相同微rna的相應基因組基因座的甲基化水平(后者在本公開中還被稱為“基礎甲基化水平”或“基礎水平”)進行比較。所公開的方法可以進一步包括提供診斷，其中受試者體內dna片段與基礎甲基化水平相比顯著更高的甲基化水平指示癌癥或癌前病變。為了本公開的目的，術語“顯著更高”可以是指至少20％、40％、50％、80％、100％、150％、200％或甚至更高。在另一個實施方式中，用于檢測癌癥的方法可以包括：(a)從受試者的組織或體液制備dna提取物，其中該dna提取物含有至少一種第一dna片段，所述至少一種第一dna片段包含選自由mir124-1、124-2、124-3、137和9-1所組成的組的編碼至少一種微rna的至少一個基因組基因座，(b)使用第一dna片段作為模板且使用特異于甲基化dna的寡核苷酸作為引物，通過聚合酶鏈反應(pcr)產生第二dna片段，(c)測定步驟(b)中產生的第二dna片段的水平，和(d)將第二dna片段的水平與基礎水平進行比較，其中第二dna片段與基礎水平相比更高的水平指示癌癥或癌前病變。在一個方面，基礎水平是從已知無癌癥的個體的相同組織或體液中以相同的方式產生的相應dna片段的水平。在另一個實施方式中，用于qms-pcr的引物是選自由seqidno.1-10組成的組的引物對。“f”表示正向引物，“r”表示反向引物。在一個方面，所公開的方法可以在修改或不修改的情況下合適于癌癥(或癌前病變)的早期檢測。癌癥的實例可以包括但不限于頭頸部鱗狀細胞癌(hnscc)、食道癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、小腸癌、泌尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、內分泌腺癌、皮膚癌、血管瘤、黑色素瘤、肉瘤、腦瘤、神經癌、眼腫瘤、腦膜癌或來自造血系統(tǒng)惡性腫瘤的實體瘤，等等。在另一個實施方式中，該至少一種微rna或者編碼該至少一種微rna的dna片段可以分離自選自由頭部組織、頸部組織、口交換物、鼻交換物、唾液、痰、血液、血清、腦脊液(csf)、尿液、fna組織、其它體液或它們的組合所組成的組的組織或體液。該編碼微rna的五個基因組基因座(也被稱為“mgmir”標志物)也可以作為組使用，其中在做出癌癥或癌前病變的陽性判斷(positivecall)之前，需要該受試者體內至少兩個、三個、四個或所有五個與基礎水平相比顯示出顯著更高的甲基化水平。在另一個實施方式中，該基礎水平可以是通過對從兩個以上已知無癌癥的個體獲得的水平取平均值而設立的預設值。通過舉例的方式，預設值用于本公開的實施例中，但是其可以被本領域的技術人員修改。在另一個實施方式中，公開了用于檢測受試者體內癌癥的方法，其可以包括(a)測定分離自受試者的組織或體液中的至少一種微rna的水平，其中至少一種微rna選自由mir124-1、124-2、124-3、137和9-1所組成的組，和(b)將該至少一種微rna的水平與基礎水平進行比較，所述基礎水平是來自已知無癌癥的個體的相同組織或體液的相同微rna的水平，其中受試者體內至少一種微rna與基礎水平相比顯著更低的水平指示癌癥或癌前病變。附圖說明圖1示出了全基因組搜索hnscc中的mgmir的流程圖。圖2示出了由qms-pcr在12個hnscc細胞系(t)和4個頭頸部對照細胞系(n)中所檢查的mgmir的相對甲基化水平。圖3示出了患者隊列1中由各個mgmir生物標志物測定的相對甲基化水平。n-來自無癌癥個體的正常頰粘膜，m-來自hnscc患者的旁粘膜，t-來自hnscc患者的腫瘤組織。圖4a示出了對于標志物mgmir124-1所揭示的對照和受試者樣品兩者的總體相對甲基化水平以及每個患者的唾液(下部)和腫瘤樣品(上部)的甲基化水平的qms-pcr結果。圖4b示出了對于標志物mgmir124-2所揭示的對照和受試者樣品兩者的總體相對甲基化水平以及每個患者的唾液(下部)和腫瘤樣品(上部)的甲基化水平的qms-pcr結果。圖4c示出了對于標志物mgmir124-3所揭示的對照和受試者樣品兩者的總體相對甲基化水平以及每個患者的唾液(下部)和腫瘤樣品(上部)的甲基化水平的qms-pcr結果。圖4d示出了對于標志物mgmir137所揭示的對照和受試者樣品兩者的總體相對甲基化水平以及每個患者的唾液(下部)和腫瘤樣品(上部)的甲基化水平的qms-pcr結果。圖4e示出了對于標志物mgmir9-1所揭示的對照和受試者樣品兩者的總體相對甲基化水平以及每個患者的唾液(下部)和腫瘤樣品(上部)的甲基化水平的qms-pcr結果。圖5示出了由hnscc的旁粘膜中的mgmir檢查出的陽性病例。圖6示出了手術切除腫瘤后患者唾液dna中的mg-mir124s和mg-mir137)的甲基化水平降低。b(手術前)，a(手術后)。圖7示出了mg-mir124s(a，上部小圖)或mgmir137(b，上部小圖)的甲基化水平與mir124(a，下部小圖)和mir137(b，下部小圖)的表達水平之間的相關性。圖8示出了在5-氮雜胞苷(5-氮雜)治療后的mir124或mir137表達的恢復圖9示出了mir124和mir137模擬物的恢復(a)抑制了細胞增殖(b)和sp尺寸(c)。圖10示出了由targetscan對mir124和mir137兩者預測出的共同靶標。圖11示出了ezh2作為mir124和mir137二者的下游共同靶標的驗證。在mir124和mir137模擬物恢復后的ezh2mrna水平(a)和蛋白質水平(b)。圖12示出了用于qms-pcr的引物的序列(seqidno.1-10)以及編碼mir124-1、124-2、124-3、137和9-1的基因組基因座的序列(seqidno.11-15)。具體實施方式微rna(mirna)的發(fā)現是分子生物學的重大事件。參見lee等人(1993)。mirna是長約18-25個核苷酸的非編碼rna。這些分子似乎是進化保守的，并且它們的主要作用是基因調控，而不是被翻譯成蛋白質。在過去二十年內，多項研究已經證實，mirna充當重要角色，并且影響基本的細胞過程，如細胞發(fā)育、分化、增殖、生存和死亡。ambros等人(2004年)。隨著研究證實一個mirna家族平均影響約500個基因，已經在人類基因組中發(fā)現了超過1000種mirna。參見lewis等人(2003)；krek等人(2005)，betel等人(2008)和friedman等人(2009)。因為這種在細胞基因組學上的突出的調節(jié)作用，研究人員已經探索了改變的mirna是否在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。有趣的是，研究已經表明，mirna可以在具有明顯不同的mirna表達信號的人類腫瘤的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。此外，mirna在腫瘤發(fā)生中似乎具有抑癌和致癌兩種作用。利用這個發(fā)現，深入的研究已經集中于mirna作為癌癥診斷和治療的潛在靶標的可能性。參見例如，garzon等人(2010)?；蜓芯恐械牧硪粋€顯著發(fā)展是越來越理解表觀遺傳學。表觀遺傳學是不由實際dna的改變所造成的基因活性的可遺傳變化的研究。大概最有名的和科學證實的表觀遺傳學方法是dna甲基化。將甲基基團添加至dna啟動子區(qū)域，特別是特定基因的富含cpg的序列的dna啟動子區(qū)域，已被證實強烈地阻抑轉錄，其與基因的實際突變或缺失等效。在過去15年左右，表觀遺傳學已被證實在癌癥發(fā)展中發(fā)揮顯著作用。具體地，在包括hnscc的許多癌癥中已經揭露了關鍵的腫瘤抑制基因的超甲基化。參見worsham等人(2013)。多數的hnscc影響上呼吸消化道的粘膜表面，其中還包括食道癌和肺癌。迄今為止，對于特定的表觀遺傳學變化是否可以作為hnscc的診斷工具，仍然沒有答案。本公開提供了使用qms-pcr在hnscc中檢查編碼微rna的基因組基因座的甲基化水平(mgmir“)的方法。經過全基因組搜索1881種微rna的1kb5utr中的cpg島并篩選編碼微rna標志物的超過五十個基因組基因座后，證實了mir124(124-1，124-2和124-3)、mir137和mir9(9-1)是用于檢測hnscc的最好標志物。該5種標志物的集合，當以組合作為組使用時，以100％的特異性和90％的敏感性檢測出hnscc。這些標志物可以在不同的位點或通過不同的機制起作用。在一個實施方式中，在旁粘膜組中的相對甲基化水平顯著低于腫瘤組中的相對甲基化水平。然而，與正常對照組相比，旁粘膜中有相對更高的甲基化水平，且是統(tǒng)計上顯著的。由于該組具有檢查周圍組織中癌前變化的潛力，這一發(fā)現具有早期診斷意義。roh等人在2011年的研究檢查了組織印跡的可行性以及利用qms-pcr評估頭頸部癌樣本的邊緣中四個基因的甲基化模式。我們的研究檢查了旁粘膜中微rna甲基化水平的存在，并且還發(fā)現，這是以足夠的敏感性和特異性檢測腫瘤周圍的看上去非常正常的組織中的癌癥的技術。在另一個實施方式中，與具有客觀數字結果的任何測試一樣，可以將閾值水平設定高于所認為測試是“陽性”的水平。除了mgmir9-1之外的所有標志物表現出無癌癥的對照組內一定水平的基線甲基化表達。為了定義和開發(fā)我們的用于潛在臨床應用的小組，對每個標志物選擇閾值甲基化水平。為此，將加權約登指數(youdenindex)用于導出每個mgmir標志物的最優(yōu)截止值。術語“癌癥”是指涉及可能侵入或擴散到機體的其它部位的異常細胞生長的一類疾病。術語“癌前病變”是指可能已經形成惡性腫瘤、或增生/發(fā)育不良但還沒有開始侵入或擴散到機體的其它部位或者獲得侵入或擴散到機體的其它部位的能力的狀態(tài)。對本領域的技術人員顯而易見的是，對本文所描述的方法的其它合適的修改和適應是明顯的，并且在不偏離本文所公開的實施方式的范圍的情況下可以利用合適的等價物來進行?，F在已經詳細地描述了某些實施方式，通過引用所包括的僅僅用于舉例說明的目的而非意圖是限制性的以下實施例，將會更清楚地理解其。實施例實施例1鑒定hnscc細胞系中編碼mir124、mir137和mir9基因組基因座的dna甲基化。為了鑒定hnscc中編碼mirna的甲基化基因組基因座，利用ucscgenomebrowser獲得mir類數據庫中的1881種智人主要(pri-)mirna的1kb5'-utr的基因組序列。然后利用cpg島預測軟件(methprimer)來鑒定具有cpg島的約90個基因組基因座(定義為島大小>200個堿基，gc含量>50％，觀察到的/預期>0.6)。通過設計甲基化特異性引物以及運行定量甲基化特異性pcr(qms-pcr)，我們篩選了這些基因組基因座，并且發(fā)現了編碼pri-mir的5個基因座，即124-1、124-2、124-3、137和9-1，其相比于正常的頭頸部細胞系，在人類hnscc細胞系中具有增加的甲基化(圖1和表1)。這些編碼mirna的甲基化基因組基因座被稱為mgmir。如表1所示，我們檢查了12種hnscc細胞系中的相對甲基化水平，包括源自年齡在22歲到70歲的范圍內、男性和女性、hpv陽性和陰性hnscc、來自范可尼貧血(fanconianemia)患者的hnscc以及頭頸部區(qū)域的不同解剖位點的細胞系。包括四個頭頸部正常細胞系作為對照。lscc：喉部scc，lnmets：淋巴結轉移，hpscc：下咽部scc，osccrec.：口腔scc復發(fā)，hpv：人乳頭狀瘤病毒，pscc：咽scc，fa-a：范可尼貧血a實施例2一組診斷性用于患者隊列1中頭頸部癌癥的mgmir生物標志物的開發(fā)。本研究遵照由相關機構的協(xié)議認可的倫理審查委員會(irb)在人類hnscc手術樣品上實施。使用了總共64個不同的組織樣本(n＝64)。表2示出了研究群體的分類。三十個樣品是來自手術切除時的hnscc樣本(n＝30個腫瘤樣本)。該群組組成我們的“腫瘤”組。這些患者中的26例還具有在手術時從鄰近于原發(fā)腫瘤的區(qū)域中收集的非常正常的組織。這些樣本構成我們的“旁黏膜”組(n＝26)，并表示來自患有已知的頭頸部癌癥的患者的看上去非常正常的組織，其在顯微鏡下具有增生/發(fā)育不良。將來自8名無惡性腫瘤史的健康患者的口腔組織用作為正常對照群體(n＝8)。(表2)。表2-患者隊列1中的研究群體組.將所有新鮮的腫瘤庫組織保存在液氮中直至dna提取時。使用dneasy血液和組織試劑盒(qiagen)從每個組織樣品提取基因組dna，并且使用nanovue分光光度計(gehealthcare)進行定量。然后使用ezdna甲基化金試劑盒(zymo)并按照制造商的說明，用硫酸氫鹽處理基因組dna。使經硫酸氫鹽轉化的dna進行基于sybr-綠的定量甲基化特異性pcr(qms-pcr)，用于五個mgmir標志物。對于每個單獨的標志物，為了鑒定適當的退火溫度和最大化結果以獲得典型的s型結果曲線，在開始運行樣品之前，對qms-pcr方案進行優(yōu)化。將熔解曲線與跑膠一起用于確定每個標志物的特異性。調整的變量包括溫度、循環(huán)次數和每次循環(huán)的長度。將β-肌動蛋白用作為內部對照。在cfxconnecttm實時檢測系統(tǒng)(biorad)上以一式三份運行qms-pcr。每個板包括患者dna樣品、陽性對照(體外甲基化的dna)、陰性對照(來自已知未甲基化的細胞系的dna)和水空白。對于在每個標志物內的每個樣品，通過標準的2-δδct方法，使用ct值的差異來計算相對甲基化水平。qms-pcr結果的統(tǒng)計分析。為了允許將所有qms-pcr結果進行比較，將一個對照患者設立為陰性對照并且將該患者的甲基化水平任意地定義為用于校準所有其它患者的結果的甲基化水平。針對每次qms-pcr實驗，由每次qms-pcr實驗中每個樣品的一式三份產生三個數據點(δδct值，+sd，-sd)。將接受者操作特性(roc)曲線用于評估每個生物標志物的性能。roc曲線是圖解在其鑒別閾(待鑒定的割點)變化時的二元分類系統(tǒng)(在該項目中，所感興趣的生物標志物)的性能的圖表。在此報道了每個繪制的roc曲線的曲線下面積(auc)。auc值越大，通常表示性能更好的生物標志物。完美的診斷性測試將具有1的auc值。使用約登指數以導出割點。最佳的割點應將約登指數最大化。未加權的約登指數定義為j＝敏感性+特異性-1。加權的約登指數定義為j＝w*敏感性+(1-w)*特異性，其中w表示給定的權重。當然，未加權的約登指數同等地重視敏感性和特異性。為了增強特異性，我們分配了較高的權重至特異性而非敏感性。分別鑒定了將兩種約登指數最大化的最佳割點。對于加權的約登指數，任意地將20％的權重分配至敏感性以及將80％的權重分配至特異性(在未加權約登中，可以認為敏感性和特異性均具有50％的權重)。然后使用具有不等方差的雙側t檢驗計算正常對照、旁粘膜和腫瘤組之間的差異的顯著性。單獨地對每個標志物，并且對作為整體的標志物組，檢驗顯著性。p<0.05被認為是統(tǒng)計學上顯著。以下示出了通過qms-pcr測定的每個甲基化的微rna標志物的相對甲基化水平，并且還總結于表3中。表3.來自hnscc患者的腫瘤組織和旁粘膜以及來自對照患者的正常組織中陽性甲基化的微rna案例的百分數腫瘤旁粘膜正常粘膜mgmir124-170％(21/30)15.4％(4/26)0％(0/8)mgmir124-270％(21/30)3.8％(1/26)0％(0/8)mgmir124-363.3％(19/30)23.1％(6/26)0％(0/8)mgmir13760％(18/30)3.8％(1/26)0％(0/8)mgmir9-156.7％(17/30)11.5％(3/26)0％(0/8)組合90％(27/30)38.5％(10/26)0％(0/8)mgmir124-1：在正常對照群體中，mgmir124-1的相對甲基化水平為6.60。在腫瘤組內，平均相對甲基化水平是128.08(se30.62)，并且在旁粘膜組內，平均相對甲基化水平是18.14(se6.13)(圖3a)。mgmir124-2：在正常對照群體中，mgmir124-2的相對甲基化水平為6.29。在腫瘤組內，平均相對甲基化水平是40.21(se6.24)，并且在旁粘膜組內，平均相對甲基化水平是5.73(se1.23)(圖3b)。mgmir124-3：在正常對照群體中，mgmir124-3的相對甲基化水平為4.37。在腫瘤組內，平均相對甲基化水平是57.66(se16.29)，并且在旁粘膜組內，平均相對甲基化水平是18.22(se7.57)(圖3c)。mgmir137：在正常對照群體中，mgmir137的相對甲基化水平為3.19。在腫瘤組內，平均相對甲基化水平是109.30(se25.31)，并且在旁粘膜組內，平均相對甲基化水平是8.08(se0.82)(圖3d)。mgmir9-1：mgmir9-1在該組標記物中是唯一一個在對照群體內不顯示基線甲基化水平而僅在癌癥樣本中具有甲基化水平的標志物。在腫瘤組內，平均相對甲基化水平是25.14(標準誤差(se)7.44)，并且在旁粘膜組內，平均相對甲基化水平是1.80(se0.79)(圖3e)。5個生物標志物的組合：當比較作為整體的所有5個mgmir標志物的相對甲基化水平時，正常對照群體的相對甲基化信號是4.09，而腫瘤群體的相對甲基化信號是72.08。這種差異是統(tǒng)計學顯著的(p<0.001)。在旁粘膜中的相對甲基化水平是10.39。當與正常對照的甲基化水平相比時，這種差異也表現出統(tǒng)計學顯著性(p＝0.005)。在已經測定了該五個mgmir生物標志物的相對甲基化水平后，采用接收者操作特性曲線和加權約登指數以導出截止值。有關更多的詳情，參見以上的材料和方法部分。對于每個標志物和每個樣品由qpcr結果完成這些計算。以組合成組的方式使用這5個標志物，這些結果示出了，在30個腫瘤樣本內，在檢測鱗狀細胞癌上敏感性為90％且特異性為100％(表3和4)。有趣的是，在旁粘膜樣本內，對于檢測鱗狀細胞癌，敏感性為38.5％且特異度為100％(表3和4)。表4來自患者隊列1的hnscc組織和對照組織的敏感性和特異性實施例3針對hnscc患者隊列2鑒定并采用唾液mgmir作為新的非侵入性生物標志物。本研究在人類hnscc組織樣品以及來自患者的唾液樣品中實施。這項研究由倫理審查委員會(irb)認可并且在使用樣品之前獲得患者的同意。從作為隊列的36名患者收集組織和/或唾液樣品。將組織和唾液樣品標記為受試者(腫瘤)或對照。受試者組由診斷為hnscc的患者組成。組織和唾液從24名hnscc患者獲得。基于臨床檢查和/或先前的活檢確定來自這些患者的組織是hnscc組織。當患者經受手術切除或活檢時從手術室獲得腫瘤組織。經受手術切除之前從患者收集唾液。對照組由無癌癥的患者組成。從12名經受扁桃體切除術的對照患者獲得組織和唾液。扁桃體切除術的適應癥是阻塞性睡眠呼吸暫停和/或慢性扁桃體炎。在手術室中收集組織并且該組織由來自前扁桃體支柱(anteriortonsillarpillar)的正常粘膜和/或扁桃體組織組成。經受手術切除之前從患者收集唾液。唾液還收集自五名無疾病的健康志愿者。該研究中還收集患者的人口統(tǒng)計信息，以及人乳頭狀瘤病毒(hpv)狀態(tài)、煙草產品和酒精的使用、任何既往化療和/或放療、癌癥病史和家族癌癥史。在受試者組中，一旦最后定下組織樣品的病理，還將回顧和編輯關于臨床階段和腫瘤組織的等級以及病理特征和分子標志物的信息。將所有收集的信息置于加密的數據庫中并且在不帶患者標識符的情況下列出樣品。在收集組織后后，立刻將組織送到實驗室冷凍并儲存在液氮中，直到隨后dna提取。在唾液收集前30分鐘，患者/志愿者需要停止進食、飲水、嚼口香糖和吸煙。在唾液收集時，患者用正常的鹽水沖洗他們的嘴兩次，每次間隔2分鐘。然后指示患者/志愿者將他們的唾液吐到falcon50ml的收集管中2-3次，該2-3次間的間隔為2分鐘。從多數患者獲得大約4-5ml的唾液，一些樣品由于口腔干燥而具有有限的體積。一旦收集，將樣品送到實驗室，將其儲存在-20攝氏度的冰箱中。基因組dna的分離和亞硫酸氫鹽轉化。根據制造商的說明，使用dneasy血液和組織試劑盒(qiagen)，從每個組織樣品中提取基因組dna。對于唾液基因組dna提取，將冷凍的唾液樣品在室溫下緩慢熔化，并且加入額外的5ml唾液制備緩沖液至每個唾液樣品，用于在室溫下穩(wěn)定基因組dna。然后以5000rpm將唾液樣品離心15分鐘。測試了五種不同的基因組dna提取試劑盒。qiaampdnamini試劑盒給出了來自唾液的基因組dna的最佳收率和質量。然后，使用nanovue分光光度計(gehealthcare)對基因組dna定量。然后使用ezdna甲基化金試劑盒(zymo)，并按照制造商的說明，用亞硫酸氫鹽處理基因組dna。定量甲基化特異性pcr(qms-pcr)。使經硫酸氫鹽轉化的dna進行基于sybr-綠的qms-pcr，用于五個mgmir標志物(用于qms-pcr的引物序列示于seqidno.1-10中)。對于每個單獨的標志物，為了鑒定適當的退火溫度和最大化結果以獲得典型的s型結果曲線，在開始運行樣品之前，對qms-pcr方案進行優(yōu)化。將熔解曲線與跑膠一起用于確定每個標志物的特異性。使用sybrgreenmix(biorad)按照以下熱條件運行qms-pcr：40次循環(huán)的95c3min，95c30sec，55-60c30sec。將β-肌動蛋白用作為內部對照。在cfxconnecttm實時檢測系統(tǒng)(biorad)上以一式三份運行qms-pcr。對于在每個標志物內的每個樣品，通過標準的2-δδct方法，使用ct值的差異來計算相對甲基化水平。qms-pcr結果的統(tǒng)計分析。為了允許將所有qms-pcr結果進行比較，將一個對照患者設立為陰性對照并且將該患者的甲基化水平任意地定義為用于校準所有其它患者的結果的甲基化水平。針對每次qms-pcr實驗，由每次qms-pcr實驗的每個樣品的一式三份產生三個數據點(δδct值，+sd，-sd)。將接受者操作特性(roc)曲線用于評估每個生物標志物的性能。roc曲線是圖解在其鑒別閾(待鑒定的割點)變化時的二元分類系統(tǒng)(在該項目中，所感興趣的生物標志物)的性能的圖表。在此報道了每個繪制的roc曲線的曲線下面積(auc)。auc值越大，通常表示性能更好的生物標志物。完美的診斷性測試將具有1的auc值。使用約登指數以導出割點。最佳的割點應將約登指數最大化。未加權的約登指數定義為j＝敏感性+特異性-1。加權的約登指數定義為j＝w*敏感性+(1-w)*特異性，其中w表示給定的權重。當然，未加權的約登指數同等地重視敏感性和特異性。為了增強特異性，將較高的權重分配至特異性而非敏感性。分別鑒定了將兩種約登指數最大化的最佳割點。對于加權的約登指數，任意地將20％的權重分配至敏感性以及將80％的權重分配至特異性(在未加權約登中，可以認為敏感性和特異性均具有50％的權重)。然后使用具有不等方差的雙側t檢驗計算正常對照、旁粘膜和腫瘤組之間的差異的顯著性。單獨地對每個標志物，并且對作為整體的標志物組，檢驗顯著性。p<0.05被認為是統(tǒng)計學上顯著。以下分析了五個mgmir：mgmir124-1、2、3，mgmir137和mgmir9-1。圖4(小圖a-e)中所示的是，揭示了對于每個標志物的對照和受試者樣品兩者的總體相對甲基化水平以及每個患者的唾液和腫瘤樣品的甲基化水平的qms-pcr結果。獲得了比較這些mgmir生物標志物的熱圖(heatmap)，并且利用約登指數計算唾液和組織樣品中每個mirna標志物的敏感性和特異性。另外，當所有的mirna標志物一起使用時，測定整體的敏感性和特異性。這些結果列于表5和表6中。表5hnscc患者組織中的敏感性和特異性表6hnscc患者唾液中的敏感性和特異性實施例4生物標志物作為用于評估hnscc治療效果以及用于治療后監(jiān)測的手段將這兩個患者隊列組合在一起，并對總共51個hnscc組織進行了評估，包括來自口腔的23個，來自口咽的9個，來自下咽部的2個，來自喉部的14個，以及3個皮膚hnscc病例。來自患者隊列2的21個唾液樣品包括10例口腔，5例口咽，1例下咽部和5個喉部hnscc病例。陽性病例和解剖部位或t階段之間沒有觀察到顯著差異。如表7中所示，當腫瘤是處于t1階段時，從組織檢測到88％的陽性病例以并且唾液樣品檢測到75％的陽性病例。這些結果表明，當腫瘤都還小時，這些mgmir可以用作早期檢測標志物。在患者隊列1中相同的截止點被用于二分旁粘膜組(圖3)。在26個旁粘膜樣品中鑒定了10例(38.5％)陽性病例。如圖5所示，組織學檢查顯示了在7例發(fā)育不良病例中的5例(71.4％)陽性病例，以及在7例增生病例中的4例(57.1％)陽性病例。該百分數比12個正常旁黏膜樣品中的1例(9.1％)陽性病例高，這表明使用五個mgmir生物標志物用于早期檢測hnscc的可能性。表7由5個mgmir檢查的陽性病例組織唾液t17/8(88％)3/4(75％)t214/17(82％)4/5(80％)t310/11(91％)5/6(83％)t414/15(93％)5/6(83％)另外，如圖6所示，在三名手術切除其腫瘤后的hnscc患者中，患者的唾液dna中的mgmir124-1、124-2、124-3和137的甲基化水平顯著降低。因此，患者唾液dna中的mgmir的甲基化水平與腫瘤負荷相關。這一結果支持了使用mgmir與患者的唾液dna用于手術后的hnscc監(jiān)控的可行性。這項研究的一個目的是調查患有hnscc的患者對于可能具有腫瘤抑制作用的特定mirna(mir124-1，124-2，124-3，137，9-1)在5個基因組基因座上是否具有更高的甲基化比率。假定不僅可以在組織樣品中也可以從患者唾液中檢測到這種差異。所公開的數據揭示了在受試者和對照樣品之間的甲基化的不同。所有對照和受試者組織樣品的比較證實了對于所有五個mgmirna在甲基化上的差異顯著。類似地，當將對照和組織唾液樣品進行編輯和比較時，觀察到所有5個mgmirna的甲基化水平更高，其中124-1、124-2和137在對照和受試者樣品之間顯示出顯著差異。受試者群體中的甲基化水平更高可以突出它們相應編碼的mirna的下調并且強調它們在腫瘤發(fā)生中的可能的抑制作用。將甲基化數據進一步分解成每個單獨的對照和受試者樣品，進一步地顯示了受試者樣品比對照樣品具有更高的甲基化水平的趨勢。敏感性和特異性值證實了，在唾液樣品中mgmir124-2是最敏感的mirna標志物，隨后是137、124-3、9-1和124-1。在組織樣品中，mgmir124-2也是最敏感的mirna標志物，隨后是137、124-1、124-3和9-1。組織樣品整體上比唾液樣品更敏感，其中組織樣品中所有五個mirna標志物具有大于50％的敏感性。組織和唾液樣品兩者中的mgmir標志物的特異性較高，全都具有大于80％的特異性。在十個mirna標志物(5個唾液和5個組織)中，六個具有100％的特異性。總體而言，相比于唾液樣品，更多的組織樣品是陽性的。由于組織應該具有穩(wěn)健的hnsccdna而唾液樣品可能含有一些來自腫瘤剝離的hnsccdna，因此該結果不是出乎意外的。有趣的是，超過80％的陽性唾液樣品在它們相關的組織樣品中也是陽性的，這存在強關聯(lián)。來自這些數據的最有效的結果是當將所有五個mirna一起使用時的整體敏感性和特異性的計算結果。該結果表明這些發(fā)現在dna微陣列上的潛在應用。在將其完成時，分別地，唾液樣品的敏感性和特異性是81％和100％，并且組織樣品的敏感性和特異性是90.5％和100％(表5和6)。采用臨床和病理信息，基于多個不同的變量，獨立地分析受試者樣品。表8示出了在每個陽性和陰性mgmir生物標志物之間的年齡差異。表8.hnscc患者中陽性和陰性mgmir的平均年齡陽性陰性mgmir13762.2歲63.2歲表9按性別劃分的hnscc患者中的陽性mgmir病例表10按位置劃分的陽性mgmirhnscc病例osccopscclsccmgmir124-170.6％(12/17)77.8％(7/9)73.3％(11/15)mgmir124-235.3％(6/17)66.7％(6/9)46.7％(7/15)mgmir124-358.8％(10/17)55.6％(5/9)53.3％(8/13)mgmir13755％(11/20)45.5％(5/11)56.3％(9/16)mgmir9-160％(12/20)54.5％(6/11)25％(4/16)表11按hpv狀態(tài)劃分的陽性mgmirhnscc病例hpv+hpv-mgmir124-171.4％(15/21)79.2％(19/24)mgmir124-276.2％(16/21)*25％(6/24)mgmir124-352.4％(11/21)50％(12/24)mgmir13756％(14/25)46.4％(13/28)mgmir9-144％(11/25)48.1％(13/27)*p<0.01表9示出了每個陽性mgmir生物標志物的性別差異。表10示出了每個mgmir生物標志物與解剖位點之間的相關性。在每個陽性mgmir生物標志物中的解剖位置。表11示出了每個mgmir生物標志物與人乳頭狀瘤病毒(hpv)狀態(tài)之間的相關性。總體而言，在每個mgmir陽性和陰性病例之間沒有年齡差異。在每個mgmir病例之間沒有性別差異，除了mgmir124-2，其中女性中的陽性病例的百分數比男性中的陽性比例顯著更高。在每個mgmir生物標志物與解剖位置之間沒有顯著差異。除了mgmir124-2，mgmir生物標志物與hpv狀態(tài)之間不存在顯著相關性，其中hpv+hnscc患者中mgmir124-2陽性病例的百分數顯著更高。在本研究中，與對照患者相比，患有hnscc的患者中具有假定的腫瘤抑制作用的特定腫瘤抑制mirna具有更高比例的dna甲基化。在患者的組織和唾液二者中都可以檢測到這種甲基化的差異(discrepancy)，并可能強調這些mirna在腫瘤發(fā)生中的作用。此外，利用來自該研究的數據，其證實組織和唾液樣品中超過90％的整體敏感性和特異性，可以將這種表觀遺傳差異用于診斷測試。實施例5在hnscc中，編碼mir124和mir137的基因組基因座的甲基化使mir124和mir137的表達沉默。檢查了十二個人類hnscc細胞系和四個正常人類頭頸部細胞系，以確定dna甲基化水平和表達水平之間的相關性。觀察到mir124和mir137的dna甲基化水平與表達水平之間負相關。一個實例示于圖7中。mir124的所有這三個基因組基因座在hnscc細胞系(fadu)中比在人永生化頭頸部細胞系(okf6)中以更高的水平甲基化(圖7a，上部小圖)。相應地，mir124在fadu細胞系中的表達水平比在okf6細胞系中的表達水平更低(圖7a，下部小圖)。在相同細胞系中的mgmir137的甲基化水平和mir137的表達水平之間觀察到類似的負相關。(圖7b，上部小圖和下部小圖)。在用脫甲基化試劑，5-氮雜胞苷(5-氮雜)處理后，進一步地證實了mir124和mir137的表達由于dna甲基化而被沉默。如圖8所示，在5-氮雜處理后，mir124和mir137的表達水平恢復。實施例6評估hnscc中mir124和mir137的腫瘤抑制功能。為了確定mir124和mir137在hnscc腫瘤發(fā)生中的功能性作用，通過轉染將mir124或mir137的mirna模擬物引入到fadu細胞系中(圖9a)。在轉染后72小時進行mtt細胞增殖試驗。通過恢復mir124或mir137表達，細胞增殖受到顯著抑制(圖9b)。進一步地評估了mir124或mir137對調節(jié)hnscc的腫瘤起始細胞(tic)的影響。使用兩種功能上相關的試驗測定了mir124和mir137在tic形成和膨脹上的作用：球形成能力和側群細胞(sp)。球體形成試驗已經被驗證為在評估hnscc中tic的自我更新和形成的能力是可靠的。另外，sp試驗，一種依賴于干細胞外排hoechst染料的能力的功能性分選方法，對于測定hnscc中的tic膨脹是一種可靠的標志物。當將mir124或mir137模擬物引入至fadu細胞中時，顯著地破壞tic的球形成能力并且sp的百分數降低。這些結果表明，mir124和mir137二者都抑制hnscc中的ict形成和膨脹(圖9c)。實施例7鑒定hnscc中mir124和mir137的下游共同靶標假定mir124和mir137的下游共同靶標(一個或多個)可以顯性地介導mir124和mir137在hnscc腫瘤發(fā)生中的功能。通過搜索targetscan微mirna數據庫(6.2版本)，發(fā)現了3個潛在mir124和mir137的共同靶標，即ezh2、cdk6、akt2和e2f6。對于脊椎動物中保守的mir124和mir137兩者，這些潛在的共同靶標中的每一個在它們的3'-utr內具有>7-mer結合位點(圖10)。鑒于它維持角化細胞和tic中的正常干細胞的功能相關性，ezh2是主要的焦點。如圖11所示，mir124或mir137的恢復顯著降低ezh2在mrna(a)和蛋白質(b)水平兩者上的表達。參考文獻：可以在整個本申請中所引用的或以下列出的所有引用的參考文獻(包括文獻參考、專利、專利申請和網站)的內容通過引用以其全部內容在此明確地并入本公開以用于任何目的。除非另有規(guī)定，本公開可以使用在本領域公知的免疫學、分子生物學和細胞生物學的常規(guī)技術。本公開還通過引用以其全部內容并入了在分子生物學的領域熟知的技術和方法。這些技術包括，但不限于，在下面出版物中描述的技術。1.watsonjd,crickfh.molecularstructureofnucleicacids；astructurefordeoxyribosenucleicacid.nature.1953；171(4356):737-8.2.leerc,feinbaumrl,ambrosv.thec.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallrnaswithantisensecomplementaritytolin-14.cell.1993；75(5):843-54.3.ambrosv.thefunctionsofanimalmicrornas.nature.2004；431(7006):350-5.4.lewis,b.,shih,i.,jones-rhoades,m.,bartel,d.&burge,c.predictionofmammalianmicrornatargets.cell115,787–798(2003).5.krek,d.等人.combinatorialmicrornatargetpredictions.naturegenet.37,495–500(2005).6.betel,d.,wilson,m.,gabow,a.,marks,d.s.&sander,c.themicrorna.orgresource:targetsandexpression.nucleicacidsres.36,d149–d153(2008).7.friedman,r.c.,farh,k.k.,burge,c.b.&bartel,d.p.mostmammalianmrnasareconservedtargetsofmicrornas.genomeres.19,92–105(2009).8.garzonr,marcuccig,crocecm.targetingmicrornasincancer:rationale,strategiesandchallenges.natrevdrugdiscov.2010；9(10):775-89.9.worshammj,alih,dragovicj,schweitzervp.molecularcharacterizationofheadandneckcancer:howclosetopersonalizedtargetedtherapy？.moldiagnther.2012；16(4):209-22.10.minorj,wangx,zhangf,等人.methylationofmicrorna-9isaspecificandsensitivebiomarkerfororalandoropharyngealsquamouscellcarcinomas.oraloncol.2012；48(1):73-8.11.boylejo,maol,brennanja,等人.genemutationsinsalivaasmolecularmarkersforheadandnecksquamouscellcarcinomas.amjsurg.1994；168(5):429-32.12.worshammj,chenkm,ghanemt,stephenjk,divineg.epigeneticmodulationofsignaltransductionpathwaysinhpv-associatedhnscc.otolaryngolheadnecksurg.2013；149(3):409-16.13.jemal,a.；siegel,r.；ward,e.；hao,y.；xu,j.；thun,m.j.,cancerstatistics,2009.ca:acancerjournalforclinicians2009,59(4),225-49.14.siegel,r.；naishadham,d.；jemal,a.,cancerstatistics,2013.ca:acancerjournalforclinicians2013,63(1),11-30.15.jemal,a.；siegel,r.；ward,e.；hao,y.；xu,j.；thun,m.j.,cancerstatistics,2009.ca:acancerjournalforclinicians2009,59(4),225-49.16.siegel,r.；naishadham,d.；jemal,a.,cancerstatistics,2013.ca:acancerjournalforclinicians2013,63(1),11-30.17.iorio,m.v.；croce,c.m.,micrornadysregulationincancer:diagnostics,monitoringandtherapeutics.acomprehensivereview.embomolmed2012,4(3),143-59.18.croce,c.m.,causesandconsequencesofmicrornadysregulationincancer.natrevgenet2009,10(10),704-14.19.lujambio,a.；calin,g.a.；villanueva,a.；ropero,s.；sanchez-cespedes,m.；blanco,d.；montuenga,l.m.；rossi,s.；nicoloso,m.s.；faller,w.j.；gallagher,w.m.；eccles,s.a.；croce,c.m.；esteller,m.,amicrornadnamethylationsignatureforhumancancermetastasis.procnatlacadsciusa2008,105(36),13556-61.20.(a)gangaraju,v.k.；lin,h.,micrornas:keyregulatorsofstemcells.natrevmolcellbiol2009,10(2),116-25；(b)rosenfeld,n.；aharonov,r.；meiri,e.；rosenwald,s.；spector,y.；zepeniuk,m.；benjamin,h.；shabes,n.；tabak,s.；levy,a.；lebanony,d.；goren,y.；silberschein,e.；targan,n.；ben-ari,a.；gilad,s.；sion-vardy,n.；tobar,a.；feinmesser,m.；kharenko,o.；nativ,o.；nass,d.；perelman,m.；yosepovich,a.；shalmon,b.；polak-charcon,s.；fridman,e.；avniel,a.；bentwich,i.；bentwich,z.；cohen,d.；chajut,a.；barshack,i.,micrornasaccuratelyidentifycancertissueorigin.natbiotechnol2008,26(4),462-9.21.iorio,m.v.；piovan,c.；croce,c.m.,interplaybetweenmicrornasandtheepigeneticmachinery:anintricatenetwork.biochimbiophysacta2010,1799(10-12),694-701.22.saito,y.；liang,g.；egger,g.；friedman,j.m.；chuang,j.c.；coetzee,g.a.；jones,p.a.,specificactivationofmicrorna-127withdownregulationoftheproto-oncogenebcl6bychromatin-modifyingdrugsinhumancancercells.cancercell2006,9(6),435-43.23.hildebrandt,m.a.；gu,j.；lin,j.；ye,y.；tan,w.；tamboli,p.；wood,c.g.；wu,x.,hsa-mir-9methylationstatusisassociatedwithcancerdevelopmentandmetastaticrecurrenceinpatientswithclearcellrenalcellcarcinoma.oncogene29(42),5724-8.24.saito,y.；jones,p.a.,epigeneticactivationoftumorsuppressormicrornasinhumancancercells.cellcycle2006,5(19),2220-2.25.minor,j.；wang,x.；zhang,f.；song,j.；jimeno,a.；wang,x.j.；lu,x.；gross,n.；kulesz-martin,m.；wang,d.；lu,s.l.,methylationofmicrorna-9isaspecificandsensitivebiomarkerfororalandoropharyngealsquamouscellcarcinomas.oraloncol2012,48(1),73-8.26.jones,p.a.；baylin,s.b.,theepigenomicsofcancer.cell2007,128(4),683-92.27.ha,p.k.；califano,j.a.,promotermethylationandinactivationoftumour-suppressorgenesinoralsquamous-cellcarcinoma.lancetoncol2006,7(1),77-82.28.babu,j.m.；prathibha,r.；jijith,v.s.；hariharan,r.；pillai,m.r.,amir-centricviewofheadandneckcancers.biochimbiophysacta2011,1816(1),67-72.29.roh,j.l.；westra,w.h.；califano,j.a.；sidransky,d.；koch,w.m.,tissueimprintformolecularmappingofdeepsurgicalmarginsinpatientswithheadandnecksquamouscellcarcinoma.headneck2012,34(11),1529-36.當前第1頁12