本發(fā)明涉及microRNA標(biāo)志物組及其在制備檢測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移試劑盒中的應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。背景知識(shí)胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的腫瘤之一，在我國(guó)發(fā)病率居各類(lèi)消化道腫瘤的首位。胃癌高死亡率最主要的原因是患者診斷明確時(shí)已經(jīng)處于胃癌晚期，胃癌患者的存活率非常低，大約5％-15％。雖然胃癌的診斷和治療有所改善，但是胃癌患者的預(yù)后非常差，尤其是有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。早期胃癌指癌組織僅局限于粘膜層和粘膜下層，判斷早期胃癌的標(biāo)準(zhǔn)不是其面積的大小和是否有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而是其浸潤(rùn)的深度。內(nèi)鏡粘膜下剝離術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的一項(xiàng)新的治療手段，也是臨床應(yīng)用前景很好的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于早期胃癌的治療。內(nèi)鏡粘膜下剝離術(shù)是在內(nèi)鏡下，使用高頻電刀與專(zhuān)用器械，將胃部早期腫瘤與其下方正常的粘膜下層逐步剝離，以達(dá)到將病灶完整切除的目的。內(nèi)鏡粘膜下剝離術(shù)允許早期胃癌病變超過(guò)2厘米及破潰的病變，并且可對(duì)切除癌組織進(jìn)行準(zhǔn)確的組織學(xué)分級(jí)的評(píng)估。另外，由于內(nèi)鏡粘膜下剝離術(shù)創(chuàng)傷小的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)年老者及高手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)的患者非常有利。但是，在早期胃癌患者進(jìn)行內(nèi)鏡粘膜下剝離術(shù)后，患者可能會(huì)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致胃癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，影響胃癌患者預(yù)后。目前為止，內(nèi)鏡粘膜下剝離術(shù)的胃癌患者是否伴隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生是不清楚的。但是，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌患者不良預(yù)后的主要原因，并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是重要單一的預(yù)后不良因子。因此，合適的分子標(biāo)志物可為預(yù)測(cè)胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供重要的線索和依據(jù)，促進(jìn)胃癌患者個(gè)體化治療目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。miRNAs是近幾年研究的熱點(diǎn)，它是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)短鏈內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)約22個(gè)堿基左右，主要通過(guò)與靶基因3’UTR完全或不完全配對(duì)，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生理及病理過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明miRNAs在腫瘤轉(zhuǎn)移，發(fā)展和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Khan等人認(rèn)為miR-27b-5p與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。許多研究顯示miR-101-5p在多種腫瘤中能抑制促轉(zhuǎn)移基因，例如EZH2，VEGF-C和HMGA2等基因。同樣地，miR-128-3p能調(diào)控上皮間質(zhì)化并且抑制癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力。miR-100-5p在多種腫瘤中通過(guò)抑制多個(gè)靶基因被認(rèn)為是抗轉(zhuǎn)移的調(diào)控者。除了以上提到的miRNAs，miR-145-5p在肺癌中表達(dá)降低，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Xing等人報(bào)道m(xù)iR-145-5p可抑制胃癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Wang等人研究表明miR-214-3p在胃癌中表達(dá)降低，與癌細(xì)胞的遷移，浸潤(rùn)及胃癌的淋巴結(jié)狀態(tài)有關(guān)。研究表明miRNAs表達(dá)譜能夠作為許多腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。Wei等人發(fā)現(xiàn)miRNAs表達(dá)譜檢測(cè)為肝癌患者的診斷和預(yù)后提供了可行的方法。Yu等人也表明miRNAs表達(dá)譜可以很好的預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后。miRNAs表達(dá)譜在胃癌中的研究揭示miRNAs的表達(dá)與胃癌發(fā)生，進(jìn)展及個(gè)性化治療有密切關(guān)系。例如，Li等人檢測(cè)了7個(gè)miRNAs(miR-10b,miR-21,miR-223,miR-338,let-7a,miR-30a-5p,miR-126)表達(dá)譜與胃癌患者總體生存和無(wú)瘤生存時(shí)間密切相關(guān)，并且這種預(yù)后相關(guān)的miRNAs表達(dá)譜可應(yīng)用于胃癌患者個(gè)體化治療。Liu等人發(fā)現(xiàn)5個(gè)miRNAs表達(dá)譜(miR-1,miR-20a,miR-27a,miR-34andmiR-423-5p)可作為胃癌檢測(cè)的新的診斷指標(biāo)，并且基于5個(gè)miRNAs的生物標(biāo)記可預(yù)測(cè)在腫瘤進(jìn)展分期。然而，miRNAs表達(dá)譜在預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的報(bào)道非常少，并且表達(dá)譜的研究較新，該領(lǐng)域的研究目前處于空白，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的應(yīng)用性研究。此外，該領(lǐng)域研究需還要克服以下幾個(gè)技術(shù)難點(diǎn)：1、大樣本臨床標(biāo)本、臨床資料的獲取(小樣本由于個(gè)體差異難獲得陽(yáng)性結(jié)果或一致結(jié)果)，長(zhǎng)期的隨訪；2、單個(gè)miRNA的局限性，低敏感性和特異性；3、許多研究多關(guān)注miRNA表達(dá)譜在癌與正常的作用，少有研究miRNA表達(dá)譜在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種microRNA標(biāo)志物組及其在制備檢測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移試劑盒中的應(yīng)用。該microRNA標(biāo)志物組可用于預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胃癌標(biāo)本中標(biāo)志物組中所涉及的4個(gè)miRNA(miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p)的表達(dá)狀況，用于評(píng)判胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。本發(fā)明技術(shù)方案如下：microRNA標(biāo)志物組，由miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p組成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-128-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。上述microRNA標(biāo)志物組在制備檢測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移試劑盒中的應(yīng)用。一種檢測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的試劑盒，包括：上述microRNA標(biāo)志物組；以及microRNA快速提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物。上述microRNA快速提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物均可采用本領(lǐng)域常規(guī)市售試劑，如microRNA快速提取試劑可采用Bioteke公司銷(xiāo)售的貨號(hào)RP5301的試劑；反轉(zhuǎn)錄試劑(包括反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物，去離子水)可采用TaKaRa公司銷(xiāo)售的貨號(hào)RR066A的試劑；實(shí)時(shí)定量PCR試劑(包括反應(yīng)緩沖液，qPCR復(fù)合物，去離子水)可采用GeneCopoeia公司銷(xiāo)售的貨號(hào)AOMD-Q020的試劑；人RNU6BmiRNA引物可采用GeneCopoeia公司銷(xiāo)售的貨號(hào)HmiRQP9001的試劑。microRNA標(biāo)志物組中各microRNA標(biāo)志物的篩選過(guò)程：發(fā)明人通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胃癌標(biāo)本中6個(gè)miRNA的表達(dá)狀況，結(jié)果顯示miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p的表達(dá)水平在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中表達(dá)下調(diào)。發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)miR-101-5p和miR-145-5p在ROC曲線(受試者工作特性曲線)分析中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將4個(gè)miRNA標(biāo)志物：miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p通過(guò)Logistic回歸構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)公式。該公式可以很好的區(qū)分胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，比傳統(tǒng)的檢測(cè)單一miRNA指標(biāo)具有更高的準(zhǔn)確性和特異性。有益效果1、本發(fā)明首次構(gòu)建了檢測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的包含4個(gè)microRNA標(biāo)志物的microRNA標(biāo)志物組，對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)有極高的準(zhǔn)確性和特異性。針對(duì)上述4個(gè)miRNA標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果與已經(jīng)建立的風(fēng)險(xiǎn)公式進(jìn)行比較，可以很好地區(qū)分胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，極大提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。2、本發(fā)明通過(guò)對(duì)所述microRNA標(biāo)志物組研制相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，用于胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)，提供個(gè)性化治療方案，具有重要的臨床意義和很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1、采用qRT-PCR方法在初篩(51例)樣本中檢測(cè)了6個(gè)miRNA的表達(dá)結(jié)果柱狀圖及這6個(gè)miRNA在初篩(51例)樣本中的ROC曲線分析圖；圖中：A為miR-27b-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；B為miR-101-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；C為miR-128-3p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；D為miR-100-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；E為miR-145-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；F為miR-214-3p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；圖2、采用qRT-PCR方法在驗(yàn)證(51例)樣本中檢測(cè)了6個(gè)miRNA的表達(dá)結(jié)果柱狀圖及這6個(gè)miRNA在驗(yàn)證(51例)樣本中的ROC曲線分析圖；圖中：A為miR-27b-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；B為miR-101-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；C為miR-128-3p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；D為miR-100-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；E為miR-145-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；F為miR-214-3p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；圖3、采用qRT-PCR方法在合并(102例)樣本中檢測(cè)了6個(gè)miRNA的表達(dá)結(jié)果柱狀圖及這6個(gè)miRNA在合并(102例)樣本中的ROC曲線分析圖；圖中：A為miR-27b-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；B為miR-101-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；C為miR-128-3p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；D為miR-100-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；E為miR-145-5p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；F為miR-214-3p的表達(dá)結(jié)果圖和ROC曲線分析圖；圖4、高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行ROC曲線分析圖；圖中：A為高風(fēng)險(xiǎn)組的胃癌患者比低風(fēng)險(xiǎn)的患者更易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；B為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組ROC曲線分析圖；圖5、miR-27b-5p，miR-101-5p，miR-100-5p和miR-145-5p組成的表達(dá)譜在合并(102例)樣本中進(jìn)行ROC曲線分析圖；具體實(shí)施方式：下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例1用于實(shí)時(shí)定量PCR的102例胃癌組織石蠟標(biāo)本均取自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2004-2007年手術(shù)切除病例。其中，65例胃癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，37例患者未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。102例患者手術(shù)前均未接受放、化療。以上石蠟組織均經(jīng)HE染色后病理證實(shí)。本研究中胃癌患者臨床參數(shù)，如表1所示。表1、4個(gè)miRNAs標(biāo)志物組在合并組(102例)標(biāo)本中的臨床病理參數(shù)分析實(shí)施例21、胃癌標(biāo)本組織中miRNA的提?。翰捎肂ioteke公司的石蠟包埋組織中miRNA的提取試劑盒。(1)切片：將胃癌標(biāo)本的已包好石蠟組織切成4μm的薄片8-10張。(2)脫蠟脫水：組織切片放在65℃恒溫箱2-4小時(shí)，然后依次放在二甲苯浸泡2次用于脫蠟，每次10min左右。然后依次浸泡在梯度酒精如75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇，每個(gè)梯度酒精缸浸5分鐘、100％無(wú)水乙醇2次，各5min，此步驟用于脫蠟，取出后待其自然晾干。(3)染色：待切片晾干后，將其放在蘇木素缸里(根據(jù)蘇木素使用時(shí)間長(zhǎng)短，估計(jì)染色時(shí)間)，大約染色1min后，再用自來(lái)水溫和沖洗切片3min。(4)挑?。禾崆皽?zhǔn)備好1ml注射器針頭并配置好240μlPTL溶液和10μl蛋白酶K混合液，于顯微鏡下觀察切片，找到所需的組織在用針頭將其輕輕刮下，放于混合液的EP中，渦旋混勻。(5)miRNA提取：1)將EP管放于55℃水浴孵育15min，取出后放于80℃水浴孵育10min。2)用移液器吸取750μl裂解液MRL加入到EP管中，吹打充分混勻，于室溫放置3min。3)繼續(xù)向EP管中加入200μl氯仿，震蕩器劇烈震蕩20秒左右，于室溫靜置2min。4)提前將4℃離心機(jī)預(yù)冷，EP管放于12000rmp離心15min，緩慢取出，可觀察到樣品分為三層，分別為上層的無(wú)色的水相層，中間層，以及有機(jī)相層，實(shí)驗(yàn)所需的RNA在無(wú)色水相層存在。隨即把水相移到新的RNasefree-EP管中估計(jì)其體積，勿吸出中間層。5)將體積濃度為70％的乙醇加入到新的RNasefree-EP管，約水相的0.6倍體積，充分混勻后，將所得液體小心移入RA吸附柱。6)將RA吸附柱放于4℃離心機(jī)，12000rmp離心45s，收集下濾液置于新的RNasefree-EP管中，肉眼評(píng)估下濾液的體積后，向EP管中加入2/3下濾液體積的無(wú)水乙醇，上下顛倒幾次達(dá)到充分混勻效果，將混合液小心移入RB吸附柱中，4℃離心機(jī)10000rmp離心30s棄掉廢液。7)往RB吸附柱中加入700μl漂洗液RW，12000rmp，4℃離心1min，棄掉廢液。8)重復(fù)上一步驟，達(dá)到充分漂洗的目的。9)將吸附柱RB放回空收集管中，4℃12000rmp離心2min,掀開(kāi)離心柱蓋,室溫放置3-5min，盡量除去漂洗液，讓乙醇揮發(fā)。10)將RB吸附柱取出后，放入一個(gè)新的RNasefreeEP管中，加入30μl左右RNasefreewater(事先在65℃水浴5-10min效果更好)，室溫放置3min，4℃12000rmp離心1min。收集得到miRNA，用光度計(jì)測(cè)miRNA的純度及濃度后保存于-80℃?zhèn)溆?。2、qRT-PCR檢測(cè)：采用All-in-oneTMmiRNAqRT-PCR檢測(cè)試劑盒(GeneCopoeia公司)。miRNA的通用下游引物序列：CAGTGCGTGTCGTGGAG和人內(nèi)參U6引物由該公司設(shè)計(jì)合成。(1)RT反應(yīng)條件：37℃1h；85℃5min。體系如下：(2)6種miRNAs(miR-27p-5p，miR-101-5p,miR-128-3p，miR-100-5p,miR-145-5p和miR-214-3p進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，其序列信息如表2所示。表2表3：相關(guān)miRNAs的引物信息序號(hào)miRNAs名稱上游引物序列7miR-27p-5pAGAGCTTAGCTGATTGGTGAACAA8miR-101-5pCAGTTATCACAGTGCTGATGCTAAA9miR-128-3pTCACAGTGAACCGGTCTCTTTAA10miR-100-5pCGTAGATCCGAACTTGTGAA11miR-145-5pAGTTTTCCCAGGAATCCCTAAA12miR-214-3pCAGGCACAGACAGGCAGTAAPCR反應(yīng)(總體系20μL)：反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10sec，60℃退火20sec，72℃延伸10sec共40個(gè)循環(huán)。(3)數(shù)據(jù)處理：記錄各樣本平均CT值，按公式△CT＝CT(miRNA)-CT(U6)和2-△CT計(jì)算每個(gè)樣本中6種miRNA的相對(duì)表達(dá)量。使用t檢驗(yàn)分析，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在51例初篩組樣本中，與沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，miR-27b-5p,miR-101-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)下調(diào)。隨后在51例驗(yàn)證組樣本中進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，并綜合分析了102例樣本中6種miRNA的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p的表達(dá)水平在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中表達(dá)下調(diào)。實(shí)施例3利用GraphPadPrism5軟件對(duì)6種miRNA區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性進(jìn)行了受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲線)分析。在51例初篩組中，結(jié)果顯示miR-27b-5p,miR-101-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲線下面積AUC＝0.7161,0.7210,0.7839,0.7150和0.7081P均<0.05)，具有較好的區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性，如圖1；而miR-145-5p的分析結(jié)果顯示其AUC＝0.6161(P>0.05)，差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖1所示。在51例驗(yàn)證組中，結(jié)果顯示miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲線下面積AUC＝0.7474,0.6972,0.7768和0.7776，P均<0.05)，具有較好的區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性，如圖2；而miR-101-5p和miR-145-5p的分析結(jié)果顯示AUC分別為0.6246和0.5956(P>0.05)，差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖2所示。綜合分析102例胃癌組織標(biāo)本，結(jié)果顯示miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲線下面積AUC＝0.7343,0.7193,0.7414和0.7306，P均<0.05)，如圖3。綜合上述三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除去miR-101-5p和miR-145-5p，將其余4個(gè)指標(biāo)采用Logistic回歸模型構(gòu)建了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)公式：miRNAscore＝(12.92×thelevelofmiR-27b-5p)+(3.686×thelevelofmiR-100-5p)–(0.972×thelevelofmiR-128-3p)+(1.789×thelevelofmiR-214-3p)-1.5。根據(jù)該公式，我們將102中的每例患者的miRNAscore計(jì)算出來(lái)，并根據(jù)cut-offvalue(敏感性和特異性最大值減去1所得)做為截點(diǎn)，將102例中的病例分成高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組的胃癌患者比低風(fēng)險(xiǎn)的患者更易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖4A)。而后再對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示以這4種miRNA形成的標(biāo)志物組具有較好的預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特異性和靈敏性(AUC＝0.760，P<0.0001)，比單一miRNA預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性好，如圖4B。實(shí)施例4一種評(píng)價(jià)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的試劑盒，包括：microRNA標(biāo)志物組；以及microRNA快速提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物。上述microRNA快速提取試劑采用Bioteke公司銷(xiāo)售的貨號(hào)RP5301的試劑；反轉(zhuǎn)錄試劑(包括反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物，去離子水)采用TaKaRa公司銷(xiāo)售的貨號(hào)RR066A的試劑；實(shí)時(shí)定量PCR試劑(包括反應(yīng)緩沖液，qPCR復(fù)合物，去離子水)采用GeneCopoeia公司銷(xiāo)售的貨號(hào)AOMD-Q020的試劑；人RNU6BmiRNA引物采用GeneCopoeia公司銷(xiāo)售的貨號(hào)HmiRQP9001的試劑。所述microRNA標(biāo)志物組，由miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p構(gòu)成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-128-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。對(duì)比例如實(shí)施例4所述的評(píng)價(jià)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的試劑盒，不同之處在于：所述microRNA標(biāo)志物組，由miR-27b-5p，miR-101-5p，miR-100-5p和miR-145-5p構(gòu)成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-101-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-145-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。實(shí)驗(yàn)例采用實(shí)施例4及對(duì)比例的試劑盒同時(shí)檢測(cè)了102例胃癌樣本中miRNA的表達(dá)情況。綜合對(duì)比例中的4個(gè)miRNA，采用Logistic回歸模型構(gòu)建了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)公式：Riskscore＝(5.013×expressionofmiR-27b-5p)+(6.451×expressionofmiR-101-5p)+(0.186×expressionofmiR-100-5p)-(0.746×expressionofmiR-145-5p)-1.397。根據(jù)該公式，計(jì)算每例患者的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示在102例胃癌樣本中，以對(duì)比例這4種miRNA形成的標(biāo)志物組具有雖然較好的區(qū)分胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特異性和靈敏性；但相比于實(shí)施例4構(gòu)成的模型，曲線下面積較小，預(yù)測(cè)效力較弱，如圖5所示。提示實(shí)施例4的標(biāo)志物組預(yù)測(cè)價(jià)值要優(yōu)于對(duì)比例。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3