本發(fā)明屬于植物基因工程領域，涉及植物FER基因及其編碼蛋白和應用，特別涉及大豆bHLH轉錄因子基因GmFER，其編碼蛋白，及其在提高酵母及煙草對鎘的耐受性中的應用。

背景技術：

隨著社會的日益發(fā)展，非農(nóng)業(yè)建設用地迅速擴張，廢棄物排放量以及農(nóng)業(yè)化肥使用量增加，土壤重金屬污染逐漸成為世界性環(huán)境問題。鎘(Cd)是一種生物毒性很強的重金屬，半衰期非常長，攝入過量會導致腎臟和骨骼的病變(參見Nawrot T.,Plusquin M.,Hogervorst J.,et al.,Environmental exposure to cadmium and risk of cancer:a prospective population-based study[J],Lancet Oncology,2006,7(2):119-126)。

大豆是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有較高經(jīng)濟價值的農(nóng)作物，含有豐富的蛋白質(zhì)和油脂，與人類的生活息息相關。但是，大豆極易積累重金屬(參見Wolnik K.A.,Fricke F.L.,Capar S.G.,et al.,Elements in major raw agricultural crops in the United States.1.Cadmium and lead in lettuce,peanuts,potatoes,soybeans,sweet corn,and wheat[J],J.Agric.Food Chem.,1983,31(6):1240-1244)，重金屬在植物體內(nèi)的大量積累，不僅嚴重影響植物的生長和發(fā)育，而且會通過食物鏈危及人類的健康。

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix，堿性/螺旋-環(huán)-螺旋)轉錄因子是植物轉錄因子中最大的家族之一。同一bHLH轉錄因子中的兩個α-螺旋之間或者不同bHLH轉錄因子的α-螺旋之間可以相互作用，形成同源或異源二聚體，與靶基因啟動子結合，調(diào)控基因的轉錄(參見Ma P.C.M.,Rould M.A.,Weintraub H.,et al.,Crystal structure of MyoDbHLH domain-DNA complex:Perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation[J],Cell,1994,77(3):451-459)。bHLH廣泛存在于植物的不同組織中，在植物的生長發(fā)育調(diào)控過程中發(fā)揮極為重要的作用。擬南芥bHLH基因(FIT、AtbHLH38和AtbHLH39)參與了植物對Cd脅迫的響應，組成性地啟動了一些參與重金屬區(qū)隔化的基因(如HMA3、MTP3、IREG2和IRT2)的表達，從而將吸收的Cd大部分區(qū)隔化在根部，減少了向地上部的轉運(參見Wu HL,Chen CL,Du J,et al.,Co-Overexpression FIT with AtbHLH38 or AtbHLH39 inArabidopsis-Enhanced Cadmium Tolerance via IncreasedCadmium Sequestration in Roots and Improved Iron Homeostasis of Shoots[J],Plant Physiology,2012,158:790-800)，但至今尚未有報道披露大豆bHLH轉錄因子基因的相關應用。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述情況，本發(fā)明根據(jù)同源克隆的方法，從栽培大豆的根系中克隆出一種bHLH轉錄因子基因GmFER，該基因?qū)d脅迫有響應。分離與克隆大豆GmFER基因不僅有利于揭示大豆的抗Cd機制，還可以通過基因操作的手段進行微生物或植物的抗Cd分子育種，以便提高抗Cd性。

具體而言，本發(fā)明提供了大豆bHLH轉錄因子基因GmFER，全長972bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供了由上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER編碼的蛋白，包含323個氨基酸(其中從N端第129位到第185位的氨基酸序列為bHLH轉錄因子的保守結構域)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

此外，包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列并且編碼如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸序列以及將如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中的一個或多個(不多于十個)氨基酸殘基進行取代和/或缺失和/或添加并且具有轉錄激活功能、調(diào)控植物抗逆性的氨基酸序列也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了包含上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER的表達載體，所述表達載體通過將上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER插入載體而得，所述載體選自p424GPD、pBI121、pCXSN、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pAHC25中的任意一種。

當使用上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER構建表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型、組織特異型、誘導型或增強型啟動子。為了便于對轉基因微生物或植物進行鑒定及篩選，可對所用表達載體進行加工，如加入具有抗性的抗生素標記物(如卡那霉素標記物、潮霉素標記物等)、抗化學試劑標記基因(如抗除草劑bar基因等)或可產(chǎn)生顏色變化的酶或蛋白(如GUS基因、GFP基因等)等。

本發(fā)明還提供了包含上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER的工程菌，所述工程菌中的宿主為大腸桿菌或酵母菌，通過PEG/LiAc介導的方法將上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER轉入。

本發(fā)明還提供了包含上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER的轉基因植物細胞系，所述植物為煙草，通過農(nóng)桿菌介導的方法將上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER轉入。

本發(fā)明還提供了一對用于擴增上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER的引物，其中正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本發(fā)明還提供了上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER及其編碼蛋白和包含其的表達載體在提高酵母對Cd的耐受性中的應用。通過將大豆bHLH轉錄因子基因GmFER導入酵母中，提高了酵母的抗Cd性。此外，上述大豆bHLH轉錄因子基因GmFER及其編碼蛋白和包含其的表達載體在提高植物(優(yōu)選單子葉和雙子葉植物)對Cd的耐受性中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明提供的大豆bHLH轉錄因子基因GmFER來自大豆(Williams 82品種)，半定量PCR檢測結果表明GmFER基因主要在大豆的根中表達。在Cd脅迫后，其表達量明顯提高，說明該基因受Cd誘導。在酵母中過表達GmFER基因能夠提高酵母對Cd的耐受性，并能提高轉GmFER基因煙草對Cd的耐受性。因此，GmFER基因可以作為目的基因?qū)胫参?包括單子葉和雙子葉植物)，從而提高植物對Cd的耐受性，具有較高的應用價值。

附圖說明

圖1為大豆bHLH轉錄因子基因GmFER編碼蛋白與其他植物bHLH結構域的氨基酸序列多重比對結果，其中：GmFER-like來自大豆，LjbHLH21來自百脈根，MtbHLH來自蒺藜苜蓿，AtFER來自擬南芥，AtbHLH來自擬南芥。

圖2為GmFER的進化樹分析圖，其中：GmFER-like(Glycine max,XP_003541980.1)；LjbHLH21(Lotus japonicus,ACN21647.1)；MtbHLH(Medicago truncatula,XP_003606331.1)；AtFER-like(Arabidopsis thaliana,NP_850114.1)；AtbHLH(Arabidopsis thaliana,AAM10938.1)；VvFER-like(Vitis vinifera,XP_002272647.1)；SlbHLH(Solanum lycopersicum,NP_001234654.1)；ZmbHLH(Zea mays,DAA38198.1)；BnbHLH(Brassica napus,CAD54298.1)；VvbHLH35(Vitis vinifera,XP_002263999.1)。

圖3為GmFERmRNA在葉、莖和根中表達豐度的半定量PCR檢測結果。

圖4為采用100μM的CdCl₂處理不同時間后對GmFERmRNA表達影響的半定量PCR檢測結果。

圖5為酵母表達載體的構建示意圖，其中：A為p424GPD空載體物理圖譜；B為p424GPD::GmFER植物表達載體物理圖譜。

圖6為GmFER基因?qū)τ诮湍笇d的耐受性的影響的檢測結果。

圖7為pCXSN::GmFER植物表達載體示意圖。

圖8為轉基因煙草在CdCl₂脅迫下的根長生長情況，其中：WT表示野生型煙草，T表示轉基因煙草。

具體實施方式

以下將結合附圖和具體實施例來說明本發(fā)明的技術方案。應當理解的是，這些實施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非另有說明，下列實施例中所使用的術語具有本領域普通技術人員通常理解的含義，未注明的實驗方法均可按照常規(guī)方法進行，例如參照J.薩姆布魯克(Sambrook J.)和D.W.拉塞爾(Russell D.W.)著《分子克隆實驗指南》(科學出版社，2005)或者按照生物試劑生產(chǎn)廠商的使用說明中記載的條件。另外，下列實施例中所使用的儀器、材料、試劑均可通過常規(guī)商業(yè)手段獲得。

實施例1：大豆bHLH轉錄因子基因GmFER的克隆。

利用生物信息學和常規(guī)聚合酶鏈式反應(PCR)相結合的方法克隆大豆GmFER基因的DNA序列，具體方法如下所述：

以Williams 82品種大豆的根系作為實驗材料，采用SV Total RNAlysis試劑盒(Promega公司，美國)提取總RNA。按照TaKaRa公司提供的方法，采用PrimeScript^TM逆轉錄酶合成出cDNA，并以其作為模板進行PCR擴增，PCR擴增過程中使用的一對引物P1(如SEQ ID NO:3所示，由上海生物工程公司合成)和P2(如SEQ ID NO:4所示，由上海生物工程公司合成)則根據(jù)NCBI中已知的GmFER序列進行設計與合成：

P1：5’-ATGGATGTTCACGAAGACACACTCA-3’；

P2：5’-TCAAGCAGGAAAAGATGCCACGAAT-3’。

通過RT-PCR方法擴增，獲得GmFER基因完整的開放閱讀框(ORF)片段。25μlPCR反應體系如下：含MgCl₂的10×PCR緩沖液2.5μl，正向、反向引物各1.0μl(10μM)，dNTP(10mM)1.0μl，cDNA樣品2.0μl，Ex-Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)0.25μl，雙蒸水17.5μl。PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃復性45s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。將擴增得到的大約800bp的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳分離，采用凝膠回收試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)并按照試劑盒中提供的方案進行回收，并克隆到pEASY-T1(Clontech)載體上，進行測序分析(由上海invitrogen公司完成)，測序結果和NCBI中的GmFER基因序列完全相同。

實施例2：GmFER轉錄本的時空分布以及Cd脅迫對GmFER基因表達的影響。

利用半定量PCR的方法，檢測GmFER在大豆植株中的組織分布情況，并采取以下措施保證檢測結果的可靠性：利用擴增級別DNase I消化提取的總RNA中可能存在的少量的基因組DNA的污染，為了檢測基因組DNA是否消除干凈，可以取出一部分用DNase I消化的總RNA樣品進行常規(guī)PCR反應。當發(fā)現(xiàn)沒有擴增條帶產(chǎn)生時，再進行反轉錄步驟，同時為了進一步驗證實時定量PCR擴增的條帶是否就是GmFER，將PCR產(chǎn)物切膠回收進行測序。具體方法為：取大豆不同生長時期根、莖、葉、花和莢等材料提取總RNA為模板，半定量PCR的引物為P1和P2。

以大豆激動蛋白(GmActin)cDNA作為內(nèi)參，半定量PCR引物P3(如SEQ ID NO:5所示，由上海生物工程公司合成)和P4(如SEQ ID NO:6所示，由上海生物工程公司合成)的核苷酸序列如下：

P3(actin-F)：5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’；

P4(actin-R)：5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’。

先取1μg總RNA，加入擴增級別DNase I(Sigma公司，美國)，于室溫放置30min以除去基因組DNA的污染，然后加入停止緩沖液(50mM EDTA)，于70℃加熱10min變性DNase I和RNA，然后采用寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄試劑盒并按照試劑盒中說明書記載的方法進行反轉錄，每個樣品取1μg總RNA，于42℃反應1h，于70℃加熱10min后取出，置于冰上，以使反轉錄酶失活，最后取1μl反轉錄產(chǎn)物進行半定量PCR擴增，檢測結果如圖3所示，從中可以看出GmFER基因主要在大豆根系中表達。

為了研究GmFER基因?qū)d脅迫的響應，采用半定量PCR的方法檢測GmFER基因在Cd脅迫下的表達模式。將三葉期大豆以100μM的CdCl₂處理0h、1h、3h和24h，以未做任何處理的三葉期大豆作為對照，然后采用與上述相同的方法檢測大豆根系中GmFER基因的表達情況，同樣以大豆的actin(激動蛋白)cDNA作為內(nèi)參，以P1和P2作為引物，檢測結果如圖4所示，從中可以看出，在Cd脅迫后，大豆根系中GmFER的表達量表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。

實施例3：包含GmFER基因的酵母表達載體的構建以及轉基因酵母對Cd的耐受性檢測。

(1)酵母表達載體的構建：

以GmFERcDNA全長序列為模板，在含有酶切位點的正向引物P5(如SEQ ID NO:7所示，由上海生物工程公司合成)和反向引物P6(如SEQ ID NO:8所示，由上海生物工程公司合成)的引導下，PCR擴增5’端添加BamHI識別位點、3’端添加SmaI識別位點的GmFERcDNA全長序列，引物的核苷酸序列如下：

P5：5′-CGCGGATCCATGGATGTTCACGAAGACACACTCA-3′(帶下劃線的堿基為限制內(nèi)切酶BamHI識別位點)；

P6：5′-TCCCCCGGGTCAAGCAGGAAAAGATGCCACGAAT-3′(帶下劃線的堿基為限制內(nèi)切酶SmaI識別位點)。

反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化972bp的目的片段，將其用BamHI和SmaI酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體p424GPD采用T₄DNA連接酶于4℃連接過夜(20μl反應體系含1×T₄DNA連接酶緩沖液，p424GPD片段0.03pmol，GmFER片段0.3pmol，T₄DNA連接酶350U)。

將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(轉化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，1992，科學出版社，第55～56頁)，將轉化后的大腸桿菌DH5α細胞懸液涂布在含有80mg/L氨芐青霉素的平板上，將對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，得到酵母表達載體p424GPD::GmFER(如圖5所示)。

(2)PEG/LiAc法介導的酵母轉化與篩選鑒定：

采用PEG/LiAc法轉化酵母細胞W303B，涂布在缺色氨酸(-Trp)的SD固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)3d，從培養(yǎng)平板中挑取單克隆進行PCR檢測，采用引物P1和P2，25μl PCR反應體系如下：含MgCl₂的10×PCR緩沖液2.5μl，正向、反向引物各1.0μl(10μM)，dNTP 1.0μl(10mM)，基因組DNA模板1.0μl，雙蒸水18.5μl，以及Ex-Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)0.25μl。擴增反應條件如下：95℃預變性4min，95℃變性30s，62℃復性50s，72℃延伸1min，35次循環(huán)后，72℃延伸min。將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，在鑒定的9個單克隆中有3個陽性轉p424GPD::GmFER的單克隆，得到含有p424GPD::GmFER的酵母菌株。

(3)基因功能分析：

把含有p424GPD::GmFER表達載體的酵母及帶有空載體p424GPD的酵母分別以1％的接種量接種于100ml缺色氨酸(-Trp)的SD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，直至OD600＝1，用SD(-Trp)液體培養(yǎng)基進行稀釋至OD600＝0.1、0.01、0.001，分別滴在含有50μMCdCl₂和不含有CdCl₂的SD(-Trp)固體培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)3d，觀察菌落的生長情況，其結果如圖6所示。

從圖6中可以看出，在含有50μM CdCl₂的培養(yǎng)基上，含有p424GPD::GmFER表達載體的酵母明顯比帶有空載體p424GPD的酵母生長得好，帶空載體p424GPD的酵母菌株在含有50μM CdCl₂的培養(yǎng)基上幾乎不能生長。由此可見，GmFER基因能夠提高酵母對Cd的耐受性。將GmFER基因作為目的基因?qū)胫参?包括單子葉和雙子葉植物)也可以提高植物對Cd的耐受性，具有較高的應用價值。

實施例4：包含GmFER基因的植物表達載體的構建以及轉基因煙草對Cd的耐受性檢測。

(1)植物表達載體的構建：

以GmFERcDNA全長序列為模板，通過P和P2進行PCR擴增。反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化972bp的目的片段，通過TA克隆的方法，把GmFER的ORF連接到植物表達載體pCXSN。

將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(轉化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，1992，科學出版社，第55～56頁)，將轉化后的大腸桿菌DH5α細胞懸液涂布在含有80mg/L卡那霉毒的平板上，將卡那霉毒的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采取測序的方法驗證連接的正確性，得到植物表達載體pCXSN::GmFER(如圖7所示)。采用凍融轉化法將此載體轉化根癌農(nóng)桿菌EH105，得到含有pCXSN::GmFER的農(nóng)桿菌菌株。

(2)農(nóng)桿菌介導的煙草轉化與篩選鑒定：

從培養(yǎng)平板中挑取單個農(nóng)桿菌菌落，在2ml YEB培養(yǎng)基(含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平)中培養(yǎng)過夜；以1％的接種量接種于100ml YEB培養(yǎng)基(含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平)中培養(yǎng)過夜，6000rpm離心收集菌體，用侵染培養(yǎng)基重新懸浮，菌液濃度調(diào)整至OD₆₀₀約為0.5，作為侵染菌液。采用葉圓盤轉化法，用無菌刀片將無菌煙草試管苗葉片切成4～6mm的葉盤，葉盤外植體在OD₆₀₀約0.5的pCXSN::GmFER農(nóng)桿菌侵染溶液中感染10min，取出后用無菌濾紙吸干表面液體，放入含有共培養(yǎng)液(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L，pH＝5.8)的濾紙上黑暗條件下，25℃共培養(yǎng)2天。經(jīng)共培養(yǎng)2天的葉盤用含有500mg/L的羧芐青霉素水溶液洗滌3次，用無菌濾紙吸干表面液體轉入篩選分化培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)。轉化體的篩選在篩選分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.1mg/L、卡那霉素80mg/L、羧芐青霉素400mg/L、蔗糖30g/L，pH＝5.8)中進行。待葉片邊緣長出叢生再生芽至2～3cm時，用解剖刀將再生芽切下，并轉入生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH＝5.8)中培養(yǎng)25天。轉化細胞再生的植株具有卡那霉素抗性，為正常綠色植株，獲得轉基因植株。

提取pCXSN::GmFER轉基因煙草基因組DNA，以基因組DNA為模板進行PCR反應。將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，并回收PCR產(chǎn)物進行測序。為了進一步鑒定轉基因植株，提取通過基因組檢測為陽性的轉pCXSN::GmFER煙草葉片總RNA，用1μg葉片總RNA經(jīng)反轉錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉錄得到的cDNA為模板，PCR引物為實例4中的引物P1和P2，25μl PCR反應體系含2.5μl含MgCl₂的10×PCR緩沖液、正、反向10μM的引物各1.0μl、1.0μl 10mM的dNTP(脫氧核苷酸混合物)、1.0μl cDNA模板和18.5μl雙蒸水，以及0.25μl rTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。擴增反應條件如下：95℃預變性4min，95℃30s，55℃50s，72℃1min，33次循環(huán)，72℃延伸10min。將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，獲得GmFER基因進行正常表達的轉基因植株。

(3)基因功能分析：

將轉基因煙草T0代種子及野生型種子在濾紙上進行萌發(fā)，28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10天后，取出大小生長一致的轉GmFER基因陽性煙草苗與對照煙草苗，將其分別轉移至含有50μM CdCl₂的濾紙上，在28℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處理4天后，測量根長，其結果如圖8所示。結果顯示，GmFER基因在煙草中的過量表達能夠提高煙草轉基因植株對Cd脅迫的抗性。