本發(fā)明屬于動(dòng)物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞毒支原體熒光定量檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)感染是雞慢性呼吸道病的一種，感染MG的雞臨床癥狀包括咳嗽、打噴嚏、鼻炎、結(jié)膜炎，呼吸時(shí)伴有鼻分泌物，也有可能患上單側(cè)或者雙側(cè)鼻竇炎。感染后會(huì)引起蛋雞產(chǎn)蛋率下降，肉雞體重減輕。雞毒支原體不同菌株的感染性和致病性不同，有時(shí)感染性并不明顯。傳播方式主要為垂直傳播和水平傳播，1943年，Delaplane等首次從感染雞群中分離出該病原體，此病流行范圍遍布世界，我國支原體感染陽性率已達(dá)50％～80％，成為威脅我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一。

雞毒支原體感染，主要表現(xiàn)為慢性呼吸道癥狀，無其他特征性的臨床癥狀，同時(shí)易與其他細(xì)菌或病毒繼發(fā)和混合感染，給臨床診斷帶來困難。支原體培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，體外培養(yǎng)生長緩慢，耗時(shí)較長，所以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法不能滿足臨床診斷的需要，目前分子生物學(xué)方法在臨床診斷中因快速、靈敏的特點(diǎn)，應(yīng)用越來越廣泛。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，目的在于提供一種雞毒支原體熒光定量檢測試劑盒及其檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種雞毒支原體熒光定量檢測試劑盒，包括：熒光定量PCR反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照，所述熒光定量PCR反應(yīng)液中包含上游引物和下游引物。

上述方案中，所述上游引物的序列為：5’-GAGCTAATCTGTAAAGTTGGTC-3’；所述下游引物的序列為：5’-GCTTCCTTGCGGTTAGCAAC-3’。

上述方案中，所述熒光定量PCR反應(yīng)液中還包含SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)。

上述方案中，所述熒光定量PCR反應(yīng)液的組成為：10μmol/L上游引物0.25μL，10μmol/L下游引物0.25μL，SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)5μL。

上述方案中，所述陰性對照為DEPC處理水。

上述方案中，所述陽性對照為：滅活的雞毒支原體活疫苗按1:1000倍稀釋的稀釋液。

利用上述試劑盒進(jìn)行雞毒支原體熒光定量PCR的檢測方法，包括如下步驟：

(1)將待測樣品溶于DEPC水，煮沸、冰浴、離心后取上清作為待測樣品檢測模板DNA；

(2)取步驟(1)所得樣品檢測模板DNA與熒光定量PCR反應(yīng)液配成反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；同時(shí)配制陽性對照反應(yīng)體系、陰性對照反應(yīng)體系同步進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；

(3)讀取樣品檢測通道、陽性對照檢測通道和陰性對照檢測通道的熒光數(shù)據(jù)，進(jìn)行結(jié)果判定：陰性對照檢測通道應(yīng)均無Ct值并且無擴(kuò)增曲線；陽性對照檢測通道應(yīng)均有特征性“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值小于32，Tm值為84.7℃±1.5℃，則表明實(shí)驗(yàn)成功，可進(jìn)行樣品的陰性/陽性結(jié)果判斷，否則實(shí)驗(yàn)視為無效；

樣品陰性結(jié)果判斷：樣品檢測通道無特征性擴(kuò)增曲線、或Ct值≥32但Tm值不在84.1℃±1.5℃范圍內(nèi)，則表明樣品中不含雞毒支原體；

樣品陽性結(jié)果判斷：樣品檢測通道出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值小于32，且Tm值為84.1℃±1.5℃，則表明樣品中含有雞毒支原體。

上述方案中，所述熒光定量PCR反應(yīng)為：第一階段，預(yù)變性，95℃3min；第二階段，95℃15s，59℃40s，40個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)的59℃退火延伸時(shí)收集熒光信號；第三階段，生成融解曲線。

本發(fā)明所述雞毒支原體熒光定量PCR檢測方法中，若檢測樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值大于或等于32，且Tm值在84.1℃±1.5℃范圍內(nèi)，應(yīng)將樣品進(jìn)行10倍稀釋后復(fù)檢；若仍出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值大于或等于32，且Tm值為84.1℃±1.5℃，則判為陽性，否則判為陰性。

本發(fā)明分別選擇雞毒支原體(MG)的16s rRNA基因的保守序列設(shè)計(jì)引物。引物長度為22個(gè)堿基左右，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)性，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列，引物間的融解溫度(Tm值)相差小于5℃。

本發(fā)明的有益效果：

(1)采用本發(fā)明所述試劑盒對樣品進(jìn)行雞毒支原體熒光定量PCR檢測，樣品的預(yù)處理過程非常簡單，即不需要對樣品進(jìn)行支原體培養(yǎng)，也不需要對樣品中進(jìn)行支原體基因提取，只需將樣品直接煮沸后冷卻即可，本發(fā)明所述檢測方式簡化了常規(guī)熒光定量PCR檢測方法中樣品的預(yù)處理過程，具有省時(shí)、省操作、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)全封閉反應(yīng)，無需PCR后處理，操作安全；并且通過PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光監(jiān)控，PCR結(jié)束即可獲得結(jié)果，具有快速檢測的優(yōu)勢；

(2)本發(fā)明所述雞毒支原體熒光定量檢測試劑盒具有檢測靈敏度高、特異性好、重復(fù)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)：試劑盒的靈敏度可達(dá)100拷貝/反應(yīng)；使用試劑盒檢測大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、葡萄球菌等細(xì)菌，均顯示無交叉反應(yīng)，使用試劑盒檢測雞毒支原體顯示出良好的特異性；使用試劑盒多次對含有不同濃度模板DNA的樣品進(jìn)行重復(fù)檢測，均能檢測出來，說明可重復(fù)度高；

(3)本發(fā)明所述試劑盒及其檢測方法非常適用于雞咽喉拭子中雞毒支原體(MG)的檢測，適用于隱性感染或帶毒雞群的快速篩查。

附圖說明

圖1為以滅活的雞毒支原體活疫苗(F36株)為樣品的檢測結(jié)果，曲線從左到右依次為樣本進(jìn)行10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀釋后的擴(kuò)增曲線。

圖2為以滅活的雞毒支原體活疫苗(F36株)為樣本的檢測結(jié)果，峰高從高到低的曲線依次為樣本進(jìn)行10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀釋、擴(kuò)增后融解曲線。

圖3為以大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、葡萄球菌為樣本，以滅活的雞毒支原體活疫苗為陽性對照的檢測結(jié)果，其中“S”型曲線為陽性對照的擴(kuò)增曲線，其他樣本的均為起線。

圖4為以大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、葡萄球菌為樣本，以滅活的雞毒支原體活疫苗為陽性對照的檢測結(jié)果，其中，有融解峰的曲線為陽性對照融解曲線，其他樣本均沒有出現(xiàn)融解峰。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1

(1)引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank登錄的已發(fā)表的雞毒支原體(MG)16S rRNA基因序列(Genbank登錄號KC995374.1)設(shè)計(jì)引物。通過分析實(shí)驗(yàn)，得到以下引物：

雞毒支原體-上游引物：5’-GAGCTAATCTGTAAAGTTGGTC-3’

雞毒支原體-上游引物：5’-GCTTCCTTGCGGTTAGCAAC-3’。

(2)待檢樣品處理

a.取滅菌的1.5mL離心管，加入400μL無菌的PBS，將采集的咽喉拭子于PBS中旋轉(zhuǎn)洗滌，保留洗滌液；

b.將上述洗滌液12000r/min離心10min，棄上清，保留沉淀物；

c.將沉淀物加入400μL DEPC水混勻，于100℃水浴鍋中煮沸10min，煮沸后冰浴10min，2000r/min離心3min，上清作為樣品檢測模板DNA；

d.同時(shí)取陽性對照10μl加入400μLDEPC水混勻，重復(fù)步驟c的操作，上清作為陽性對照檢測模板DNA。

(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系配制

5μL SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)分別加入0.25μL、10μmol/L上游引物、0.25μL、10μmol/L下游引物，充分混合均勻后，即得到熒光PCR反應(yīng)液(見表1)，再在熒光PCR反應(yīng)液中加入4.5μL樣品檢測模板DNA/陽性對照檢測模板DNA/陰性對照檢測模板DNA，最終配成10μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(1羽份)。

表1熒光PCR反應(yīng)液(1羽份，5.5μl)

其中，SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)購于大連寶生物生物工程有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

實(shí)施例2雞毒支原體熒光定量PCR檢測

(1)將上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR檢測，熒光定量PCR反應(yīng)的參數(shù)設(shè)計(jì)如下：第一階段：預(yù)變性，95℃3min；第二階段：95℃15s，59℃40s，40個(gè)循環(huán)，在第二階段每次循環(huán)的59℃退火延伸時(shí)收集熒光；第三階段，生成融解曲線。

(2)分別讀取樣品檢測通道、陽性對照檢測通道和陰性對照檢測通道的熒光數(shù)據(jù)，進(jìn)行結(jié)果判定：陰性對照檢測通道應(yīng)均無Ct值并且無擴(kuò)增曲線，陽性對照檢測通道應(yīng)均有特征性“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值小于32，Tm值為84.7℃±1.5℃，則表明實(shí)驗(yàn)成功，可進(jìn)行樣品的陰性/陽性結(jié)果判斷，否則實(shí)驗(yàn)視為無效；

樣品陰性結(jié)果判斷：樣品檢測通道無特征性擴(kuò)增曲線、或Ct值≥32但Tm值不在84.1℃±1.5℃范圍內(nèi)，則表明樣品中不含雞毒支原體；

樣品陽性結(jié)果判斷：樣品檢測通道出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線，且Ct值小于32，且Tm值為84.1℃±1.5℃，則表面樣品中含有雞毒支原體。

同時(shí)，若檢測樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值大于或等于32，且Tm值在84.1℃±1.5℃范圍內(nèi)，應(yīng)將樣品進(jìn)行10倍稀釋后復(fù)檢；若仍出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值大于或等于32，且Tm值為84.1℃±1.5℃，則判為陽性，否則判為陰性。

實(shí)施例3可行性實(shí)驗(yàn)

以滅活的雞毒支原體活疫苗為樣品，采用實(shí)施例1、實(shí)施例2的方法進(jìn)行雞毒支原體熒光定量PCR檢測，檢測結(jié)果顯示：樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值小于32，Tm值為84.1℃。說明本發(fā)明所述試劑盒及其檢測方法具有確定的可行性。

實(shí)施例4靈敏性實(shí)驗(yàn)

以滅活的雞毒支原體活疫苗為樣品，將其用DEPC水進(jìn)行10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀釋后，采用實(shí)施例1、實(shí)施例2的方法進(jìn)行雞毒支原體熒光定量PCR檢測，檢測結(jié)果如圖1、圖2所示，圖1從左到右的曲線分別代表稀釋了10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的雞毒支原體活疫苗樣品，圖2中峰高從高到低的曲線分別代表稀釋了10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的雞毒支原體活疫苗樣品，從圖1和圖2可以看出：雞毒支原體稀釋10^-6倍數(shù)后仍然能被本發(fā)明所述試劑盒及其檢測方法檢出，說明本發(fā)明所述試劑盒具有非常好的特異性和非常高的靈敏性。通過對雞毒支原體活疫苗樣品進(jìn)行拷貝數(shù)測定后，再采用本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述試劑盒的靈敏度能達(dá)到100拷貝/反應(yīng)；同時(shí)使用本發(fā)明所述試劑盒多次對含有不同濃度模板DNA的樣品進(jìn)行重復(fù)檢測，均能檢測出來，說明可重復(fù)度高。

實(shí)施例5特異性實(shí)驗(yàn)

分別以大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、葡萄球菌為樣品，以雞毒支體為陽性對照，采用實(shí)施例1、2的方法進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果如圖3、圖4所示，從圖3和圖4可以看出：大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、副雞嗜血桿菌、葡萄球菌樣品均無特征性擴(kuò)增曲線，無特異性融解峰，而陽性對照(雞毒支原體樣品)出現(xiàn)“S”型曲線擴(kuò)增曲線和特異性融解峰，表明本發(fā)明所述試劑盒具有非常好的特異性。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對實(shí)施方式的限制。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。