本發(fā)明涉及一種熒光化學(xué)傳感材料的制備方法和用途，特別涉及一種基于雙席夫堿的熒光傳感材料的制備方法和用途，屬于化學(xué)熒光傳感材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

作為環(huán)境中主要污染物的重金屬離子一直都是人們關(guān)注的焦點。隨著工業(yè)的進步和社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們對自然界中重金屬進行了大肆的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造，對周圍的環(huán)境造成了嚴重的重金屬離子污染，嚴重的影響了生態(tài)和人類的健康與安全。煤礦、金屬硫化物礦、鐵礦及冶金等生產(chǎn)企業(yè)往往會產(chǎn)生大量含金屬離子的廢水，處理不當(dāng)就會對環(huán)境造成嚴重危害。重金屬污染物在自然環(huán)境中不能夠被微生物降解，一旦進入環(huán)境或者生態(tài)系統(tǒng)中就會長期存留、蓄積，并且其極易被生物體所吸收，不同形態(tài)的重金屬離子會通過生物的遷徙，富集等方式作用于動植物，最終通過食物鏈進入人體危害健康。

作為重金屬之一的汞離子具有極強的毒理性，汞對人體的危害主要涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及腎臟，即使是低水平的暴露也會損害神經(jīng)系統(tǒng)，表現(xiàn)為精神和行為障礙，能引起感覺異常、共濟失調(diào)、智能發(fā)育遲緩、語言和聽覺障礙等。此外汞對呼吸系統(tǒng)、皮膚、血液及眼睛也有一定影響，汞離子可與體內(nèi)酶或蛋白質(zhì)中許多帶負電的基團如巰基等結(jié)合，使細胞內(nèi)許多代謝途徑，如能量的生成、蛋白質(zhì)和核酸的合成受到影響，從而影響了細胞的功能和生長。此外汞能與細胞膜上的巰基結(jié)合，引起細胞膜通透性的改變，導(dǎo)致細胞膜功能的嚴重障礙。婦孺皆知的“水俁病”的罪魁禍?zhǔn)渍枪x子，2004年 《民主與法制》 報道的四川簡陽市簡城鎮(zhèn)民旺村的飲用水含汞量超標(biāo)3倍以上，十多年來奪去45條生命，另有20多人因此癡呆變殘；汞對人體損害極大，不容小覷。 鋅是人體必需的一種微量元素, 它存在于各種基本的生物過程，包括神經(jīng)信號傳導(dǎo)、細胞凋亡、金屬酶調(diào)控和基因轉(zhuǎn)錄等等。鋅元素能夠參加一些酶的組成和反應(yīng)，進而通過酶在人體內(nèi)反應(yīng)中所起的催化作用對人體機能的各項反應(yīng)例如生長發(fā)育、新陳代謝、組織修復(fù)等起著極為重要的作用。盡管如此對于鋅的攝入也不可盲目，當(dāng)鋅的含量低于正常水平，會引起皮膚受損、食欲不振、發(fā)育阻滯，同時也會抑制蛋白質(zhì)代謝、改變免疫系統(tǒng)現(xiàn)狀、損傷視力等等；同樣鋅過量也會引起中毒，出現(xiàn)腹痛、便血、腸功能失調(diào)、腸壞死或引起潰瘍, 嚴重者甚至?xí)?dǎo)致胃穿孔引起腹膜炎、休克以及死亡。

為了減少和避免過量汞和鋅對生態(tài)環(huán)境及人類的危害，有效的監(jiān)測分析是必不可少的，因此開發(fā)一種快速、便捷、靈敏有效的檢測技術(shù)成為了一項新的挑戰(zhàn)。熒光傳感材料由于其具有高靈敏度，選擇性好，易于可視化等優(yōu)點而備受青睞。該方法避免了傳統(tǒng)的檢測技術(shù)如原子吸收分光光度法，火焰原子化法以及電感耦合等離子體法等嚴格的預(yù)處理的過程，操作簡單無需大型的檢測儀器，可實現(xiàn)可視化現(xiàn)場檢測。近年來用熒光傳感材料來檢測重金屬及過渡金屬離子的研究越來越受到關(guān)注。熒光傳感材料自身具有獨特的光學(xué)性質(zhì)，當(dāng)其結(jié)合目標(biāo)離子時，材料的光物理特性受到影響，熒光信號的輸出形式發(fā)生改變，基于結(jié)合目標(biāo)離子前后熒光的變化作為響應(yīng)信號來實現(xiàn)對特定離子的快速檢測。

因此，本發(fā)明制備了一種基于雙席夫堿的熒光響應(yīng)型傳感材料。研究發(fā)現(xiàn)該傳感材料由于雙C=N 基團的存在增強了結(jié)合目標(biāo)離子的能力。氨基硫脲的引入更是增強了傳感材料整體的水溶性和生物相容性，可以實現(xiàn)在水溶液介質(zhì)中對目標(biāo)離子進行檢測應(yīng)用，也為生物細胞中目標(biāo)離子的成像分析提供了前提。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服傳統(tǒng)檢測技術(shù)的限制，目的在于提供一種基于雙席夫堿衍生物的熒光傳感材料及其制備方法和用途，本發(fā)明涉及的傳感材料能夠很好的實現(xiàn)環(huán)境水樣及生物細胞中痕量Zn²⁺和Hg²⁺的兩種重金屬離子的有效檢測，具有成本低，合成簡單，多重響應(yīng)和檢測靈敏度高等特點。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種基于雙席夫堿衍生物的熒光傳感材料，所述材料是由2, 6-二羥甲基對甲基苯酚和氨基硫脲作為基礎(chǔ)原料，活性二氧化錳作為氧化劑，將2, 6-二羥甲基對甲基苯酚氧化成醛，再采用冰乙酸作為催化劑，經(jīng)親核反應(yīng)與氨基硫脲制得熒光傳感材料。

本發(fā)明還提供一種基于雙席夫堿衍生物的熒光傳感材料的制備方法，包括如下步驟：

步驟1. 制備2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：將2, 6-二羥甲基對甲基苯酚置于圓底燒瓶中，用乙腈將其溶解，65℃油浴鍋中攪拌30min后加入活性二氧化錳，高溫攪拌回流反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氧化劑二氧化錳，收集濾液，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在乙醇中重結(jié)晶純化得淡黃色固體。

其中，2, 6-二羥甲基對甲基苯酚的用量為1~3g；乙腈用量為20mL~40mL；活性二氧化錳用量為6~18g；

所述的回流反應(yīng)溫度為110～130℃，反應(yīng)時間為65～80h。

步驟2. 制備基于雙席夫堿的熒光傳感材料：將2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和氨基硫脲置于圓底燒瓶中，用無水乙醇將其溶解，滴加2滴冰乙酸作為催化劑。油浴鍋中攪拌回流，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在正己烷中重結(jié)晶純化得黃色固體。

其中，2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚的用量為0.164～0.492g, 氨基硫脲的用量為0.182～0.546g , 無水乙醇用量為20~40mL，回流反應(yīng)溫度為65～75℃，反應(yīng)時間為5～7h。

本發(fā)明還提供一種基于雙席夫堿的熒光傳感材料用于環(huán)境水樣中Zn²⁺和Hg²⁺痕量檢測的用途。

本發(fā)明還提供一種基于雙席夫堿的熒光傳感材料用于生物體細胞中Zn²⁺和Hg²⁺的成像分析檢測。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，有益效果為：

（1）本發(fā)明采用2, 6-二羥甲基對甲基苯酚作為基礎(chǔ)原料，其具有均勻的對稱結(jié)構(gòu)，是制備雙席夫堿衍生物的良好選擇，其酚羥基上的氧原子也可提供電子作為結(jié)合位點。將對稱的羥甲基氧化成醛并與兩倍的氨基硫脲相結(jié)合制備雙席夫堿熒光傳感材料，對稱的雙席夫堿結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，氨基硫脲具有良好的水溶性，它的引入使得制得的傳感材料的水溶性也大大被增強。

（2）制備2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚過程中，采用了活性二氧化錳作為強氧化劑，一步高溫回流將羥甲基氧化成醛的制備方法。

（3）制備基于雙席夫堿的熒光傳感材料過程中，采用冰乙酸作為催化劑大大的縮短了反應(yīng)時間。

（4）本發(fā)明制備的熒光傳感材料具有雙重響應(yīng)，分別對重金屬Zn²⁺和Hg²⁺具有靈敏的選擇性識別性能，表現(xiàn)出不同的熒光發(fā)射，響應(yīng)時間快，在紫外燈下熒光信號的變化肉眼可見，其他常見金屬離子干擾性小。

（5）本發(fā)明制備的熒光傳感材料檢測條件更為溫和，采用HEPHS緩沖溶劑作為檢測介質(zhì)，避免了大量有機溶劑引入而造成的二次污染。

附圖說明

圖1為實施例3所制備的基于雙席夫堿衍生物的熒光傳感材料的合成過程示意圖。

圖2為實施例3所制備的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚的¹H NMR圖，其中溶劑為CDCl₃。

圖3為實施例3所制備熒光傳感材料的¹H NMR圖，其中溶劑為DMSO-D₆。

圖4為實施例3所制備熒光傳感材料的¹³C NMR圖, 其中溶劑為DMSO-D₆。

圖5為實施例3所制備熒光傳感材料的MS圖。

圖6為實施例3所制備熒光傳感材料在不同金屬離子存在時的熒光光譜圖。圖中的1表示的是本發(fā)明制備的熒光傳感材料。

圖7為實施例3所制備熒光傳感材料在不同濃度Zn²⁺和Hg²⁺存在時的熒光光譜圖。

圖8為實施例3所制備熒光傳感材料的熒光增強程度[I-I₀]與存在的Zn²⁺和Hg²⁺濃度的線性關(guān)系圖。

圖9為實施例3所制備熒光傳感材料的 1/[I-I₀]與1/[Zn²⁺]和1/[Hg²⁺]的線性關(guān)系圖。

圖10為實施例3所制備熒光傳感材料與Zn²⁺和Hg²⁺離子的Job曲線。

圖11為實施例3 所制備熒光傳感材料用于生物體活細胞中Zn²⁺和Hg²⁺的成像圖；圖中a為加入熒光傳感材料培養(yǎng)后的細胞在明場下的成像，b為加入熒光傳感材料培養(yǎng)后的細胞在熒光場下的成像，c為加入20μM Zn²⁺后細胞在熒光場下的成像，d為加入20μM Hg²⁺后細胞在熒光場下的成像。

圖12為實施例3所制備熒光傳感材料對實際長江水樣中Zn²⁺和Hg²⁺的檢測。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施實例對本發(fā)明作進一步說明：

實施例1：

步驟1. 制備2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：將1g 2, 6-二羥甲基對甲基苯酚置于圓底燒瓶中，用20 mL乙腈將其溶解，65℃油浴鍋中攪拌30min后加入6g活性二氧化錳， 110℃高溫攪拌回流反應(yīng)65h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氧化劑二氧化錳，收集濾液，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在乙醇中重結(jié)晶純化得淡黃色固體。

步驟2. 制備基于雙席夫堿的熒光傳感材料：將0.164g的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和0.182g的氨基硫脲置于圓底燒瓶中，用20mL無水乙醇將其溶解，滴加2滴冰乙酸作為催化劑。65℃油浴鍋中攪拌回流5h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在正己烷中重結(jié)晶純化得黃色固體。

實施例2：

步驟1. 制備2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：將3g 2, 6-二羥甲基對甲基苯酚置于圓底燒瓶中，用40 mL乙腈將其溶解，65℃油浴鍋中攪拌30min后加入18g活性二氧化錳， 130℃高溫攪拌回流反應(yīng)80h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氧化劑二氧化錳，收集濾液，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在乙醇中重結(jié)晶純化得淡黃色固體。

步驟2. 制備基于雙席夫堿的熒光傳感材料：將0.492g的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和0.546g的氨基硫脲置于圓底燒瓶中，用40mL無水乙醇將其溶解，滴加2滴冰乙酸作為催化劑。75℃油浴鍋中攪拌回流7h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在正己烷中重結(jié)晶純化得黃色固體。

實施例3：

步驟1. 制備2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：將2g 2, 6-二羥甲基對甲基苯酚置于圓底燒瓶中，用30 mL乙腈將其溶解，65℃油浴鍋中攪拌30min后加入12g活性二氧化錳， 120℃高溫攪拌回流反應(yīng)72h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾除去氧化劑二氧化錳，收集濾液，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在乙醇中重結(jié)晶純化得淡黃色固體。

步驟2. 制備基于雙席夫堿的熒光傳感材料：將0.328g的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和0.364g的氨基硫脲置于圓底燒瓶中，用30mL無水乙醇將其溶解，滴加2滴冰乙酸作為催化劑。70℃油浴鍋中攪拌回流6h，待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，減壓旋蒸移除溶劑得粗產(chǎn)品，在正己烷中重結(jié)晶純化得黃色固體

如圖1所示是基于雙席夫堿衍生物的熒光傳感材料的合成過程示意圖。

如圖2所示為2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚的 ¹H NMR 圖， ¹H NMR (CDCl₃), δ: 2. 33 (s, 3H); 7. 85 (s, 2H); 10. 07 (s, 2H); 11.4(s, 1H)。通過核磁譜圖可以確定2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚化學(xué)結(jié)構(gòu)的正確性。

如圖3和圖4所示分別是熒光傳感材料的¹H NMR和¹³C NMR圖。¹H NMR (CDCl₃), δ (ppm): 11.53(s, 2H), 9.57 (s, 1H), 8.33(s, 2H), 8.14 (d, 4H), 8.19 (s, 2H), 7.65 (s, 2H), 2.33(s, 3H)，通過核磁譜圖可以確定熒光傳感材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

如圖5所示為熒光傳感材料(C₁₁H₁₄N₆S₂O，M_n=310)的質(zhì)譜圖，其中，333.13為 [M+Na]對應(yīng)的分子量, 進一步證實了該熒光傳感材料的結(jié)構(gòu)。

實施例4：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對Zn²⁺和Hg²⁺檢測的特異性驗證

將實施例3中制備的熒光傳感材料制備成1mM的儲備液待用。取1mL上述儲備液用HEPES緩沖溶液（0.05M, pH=7.4）定容到100mL配制成10μM熒光傳感材料溶液。分別移取4mL上述10μM的待用溶液，分別加入10當(dāng)量不同種常見的金屬離子（Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Pb²⁺, Al³⁺, Sr²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Li²⁺, Cr³⁺, Hg²⁺, K⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, Ca²⁺, Ni²⁺和 Zn²⁺），采用熒光光譜儀分別對各自的熒光光譜進行測定，其中激發(fā)波長為390nm。

熒光傳感材料自身幾乎無熒光發(fā)射，當(dāng)加入10當(dāng)量不同金屬離子后的熒光光譜如圖6所示，從圖中可以看出，熒光傳感材料對Zn²⁺和Hg²⁺表現(xiàn)出獨特的選擇性，當(dāng)Zn²⁺和Hg²⁺存在時，在478nm和580nm處分別呈現(xiàn)出強的熒光發(fā)射峰，在紫外燈照射下可呈現(xiàn)出肉眼可見的藍綠色熒光和紅色熒光。然而，其他金屬離子的存在并沒有引起傳感材料體系熒光的改變。這個結(jié)果表明本發(fā)明制備的熒光傳感材料對Zn²⁺和Hg²⁺具有雙重響應(yīng)性，可以實現(xiàn)對Zn²⁺和 Hg²⁺的選擇性識別檢測。

實施例4：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對Zn²⁺和Hg²⁺檢測的靈敏性驗證

移取實施例3中的10μM的待用溶液，分別對Zn²⁺和Hg²⁺進行熒光和紫外滴定實驗，即分別加入0～10當(dāng)量的Zn²⁺和Hg²⁺進行熒光光譜。本實施例中用到的金屬離子濃度分別為：0.1×10^-5M、0.2×10^-5M、0.3×10^-5M、0.4×10^-5M、0.5×10^-5M、0.6×10^-5M、0.7×10^-5M、0.8×10^-5M、0.9×10^-5M、1.0×10^-5M、2.0×10^-5M、3.0×10^-5M、4.0×10^-5M、6.0×10^-5M、8.0×10^-5M、10.0×10^-5M。

熒光滴定實驗的熒光發(fā)射光譜如圖7所示，從圖中可以看出，隨著金屬Zn²⁺濃度的增加，478nm處的熒光發(fā)射峰逐漸增強，同樣的，Hg²⁺加入量的增加也會引起580nm處的發(fā)射峰的增強。

圖8表明在一定的濃度范圍內(nèi)相應(yīng)的熒光增強程度（I-I₀）與金屬離子的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，對于Zn²⁺和Hg²⁺，線性方程的斜率（slope）分別為3.61×10⁷和4.78×10⁷，根據(jù)方程LOD（L）=3σ/slope（20次空白樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ=1.782和3.985）計算得最低檢出限分別可低達1.457×10^-7M和2.50×10^-7M。結(jié)果表明該熒光傳感材料對一定濃度范圍內(nèi)的Zn²⁺和Hg²⁺可進行定量檢測并具有高的靈敏性。

圖9為1/[I-I₀]與1/[M](M表示金屬離子)之間的線性關(guān)系，可以看出兩者成線性，根據(jù)Benesi-Hildebrand方程（）計算熒光傳感材料與Zn²⁺ 和Hg²⁺的結(jié)合常數(shù)K分別為1.16×10⁴ M^-1和1.13×10⁵ M^-1；其中，I₀表示單獨傳感材料溶液的熒光強度，I表示加入不同濃度的金屬離子后的熒光強度，I_c表示飽和時的熒光強度，K表示傳感材料與金屬離子之間的結(jié)合常數(shù)，[M]表示對應(yīng)的金屬離子的濃度。

實施例5：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對Zn²⁺和Hg²⁺結(jié)合比例驗證

配制10μM的Zn²⁺和Hg²⁺離子溶液，分別將實施例3中配制的10μM熒光傳感材料的待用溶液與10μM的金屬Zn²⁺和Hg²⁺溶液按不同體積比（0:10～10:0）混合，使得兩者混合物的總濃度為10μM，對一系列的混合物進行熒光光譜測定，制備Job曲線確定結(jié)合比例。本實施例中用到的體積比分別為：0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0。

圖10為熒光傳感材料與金屬離子的Job曲線，從圖中可以看出，當(dāng)金屬離子濃度為體系總濃度一半時，熒光強度達到了最高，這說明熒光傳感材料與兩種金屬離子均以1:1化學(xué)計量比進行結(jié)合。

實施例6：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對細胞的保護和成像分析

將RAMOS細胞（人B淋巴瘤細胞, 購買于Sigma）在RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，然后加入 50μM的實施例3制備的熒光傳感材料繼續(xù)培養(yǎng)30min，之后用PBS緩沖溶液洗滌三次移除殘余的熒光傳感材料，分別加入20μM Zn²⁺和Hg²⁺繼續(xù)在培養(yǎng)30min，然后再次用PBS洗滌細胞，采用倒置熒光顯微鏡對加入Zn²⁺和Hg²⁺前后的細胞進行成像分析。

熒光傳感材料對生物細胞中Zn²⁺和Hg²⁺的成像結(jié)果如圖11所示，圖11-a和圖11-b分別為加入熒光傳感材料培養(yǎng)后的細胞在明場和熒光場下的成像，圖a表明該傳感材料具有低的生理毒性，并沒有對生物細胞造成破壞，11-b表明用熒光傳感材料培養(yǎng)過的細胞并無熒光；圖11-c和圖11-d 分別為加入Hg²⁺和Zn²⁺后細胞在熒光場下的成像情況。從圖中可以看出，細胞中Zn²⁺和Hg²⁺的存在會引起細胞內(nèi)部呈現(xiàn)出強的熒光發(fā)射。這一結(jié)果充分的表明熒光傳感材料具有良好的生物膜透過性并已成功進入細胞到內(nèi)部，同時也證實了熒光傳感材料可用于生物體細胞中Zn²⁺和Hg²⁺熒光成像檢測分析。

實施例7：本發(fā)明制備的熒光傳感材料對水樣中Zn²⁺和Hg²⁺進行的加標(biāo)實驗

采集長江水水樣，對Zn²⁺和Hg²⁺進行的加標(biāo)實驗，取實施例3中的10μM的熒光傳感材料的待用溶液，兩種金屬離子的加標(biāo)量分別為5μM和10μM，混合均勻后對其熒光光譜進行測定。

熒光傳感材料對實際水樣中Zn²⁺和Hg²⁺的檢測效果如圖12所示，從結(jié)果可以看出，熒光傳感材料對實際水體中的Zn²⁺和Hg²⁺的檢測具有很高的靈敏性和很好的選擇性，水體中金屬離子濃度不同，熒光增強的程度也不同，根據(jù)圖8熒光增強程度（I-I₀）與Zn²⁺和Hg²⁺濃度之間的線性關(guān)系可以實現(xiàn)水體中目標(biāo)金屬離子的定性和定量檢測。