本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質(zhì)，它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對(duì)人體損害的一類物質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的抗氧化劑，這些抗氧化劑可以被分為以下兩大類：1)非基因編碼的小分子無助，如維生素E、維生素C、谷胱甘肽等；2)基因編碼的大分子物質(zhì)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白等。這些抗氧化劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，包括健康、食品、化妝品及各種工業(yè)中，比如作為燃料和潤(rùn)滑劑的穩(wěn)定劑防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合從而避免引擎積垢形成的目的，單在2007年，工業(yè)用途的抗氧化劑的就創(chuàng)造了大約37億美元的收入?；诳寡趸瘎┑闹匾?，科學(xué)家們一直在孜孜不倦的尋找著新型抗氧化劑。

兩棲動(dòng)物是水生動(dòng)物過度到陸生動(dòng)物之間的重要類群，其皮膚裸露，表面沒有毛發(fā)覆蓋，直接面對(duì)各種生存壓力，承當(dāng)著諸多重要的生物學(xué)功能，比如抵御微生物入侵、體色調(diào)節(jié)、水鹽平衡調(diào)節(jié)等。已經(jīng)有大量的研究證據(jù)表明，兩棲動(dòng)物的皮膚能分泌大量的活性物質(zhì)(主要是蛋白和多肽)使得其能完成這些重要的生物學(xué)功能。最近，在兩棲動(dòng)物滇蛙的皮膚中發(fā)現(xiàn)了一類新型的抗氧化劑，其化學(xué)本質(zhì)為多肽，和傳統(tǒng)的兩大類抗氧化劑不同，其由基因編碼，但分子量卻很小。此后，在一些兩棲動(dòng)物皮膚中也發(fā)現(xiàn)了這一類物質(zhì)，但和傳統(tǒng)的抗氧化劑相比，我們對(duì)這一類新型抗氧化劑的結(jié)構(gòu)和功能了解還知之甚少。

云南臭蛙是中國(guó)特有的一種兩棲動(dòng)物，廣泛分布于強(qiáng)紫外照射的云貴高原，根據(jù)其生境，我們推測(cè)其皮膚能分泌高效的新型抗氧化多肽使得其能抵御紫外照射所造成的傷害。對(duì)這些多肽的挖掘、結(jié)構(gòu)和功能的研究一方面為我們理解兩棲動(dòng)物適應(yīng)高海拔強(qiáng)紫外照射生境提供新的分子線索，另外一方面能為我們提供新的、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗氧化劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問題，提供了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2及其制備方法與應(yīng)用，通過云南臭蛙皮膚分泌分離純化得到的AOP-OA2具有結(jié)構(gòu)新穎、簡(jiǎn)單、活性強(qiáng)的特點(diǎn)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2，抗氧化多肽AOP-OA1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還公開了一種云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2的制備方法，包括以下步驟：

1)原料預(yù)處理：取云南臭蛙皮膚分泌物，溶解于質(zhì)量濃度為0.9％的生理鹽水，真空冷凍干燥，-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)Sephadex G50分子篩：將步驟1)中制備得到的云南臭蛙皮膚分泌物凍干粉溶解于去離子水中，上Sephadex G50柱子，用Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為2.0毫升/10分鐘，每10分鐘收集一管，測(cè)定其在280納米下的吸光度，收集合并具有抗氧化活性的洗脫峰；

3)高效液相色譜反相層析：將步驟2)中制備得到的洗脫液上樣于Hypersil ODS2柱子，實(shí)驗(yàn)儀器為Waters 1525高壓液相系統(tǒng)，在流速為1毫升/分鐘的條件下，用乙腈在線性梯度條件下進(jìn)行洗脫，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為215納米，收集合并具有抗氧化活性的洗脫峰，濃縮干燥后得到目標(biāo)物。

進(jìn)一步地，步驟2)中的Sephadex G50柱子預(yù)先用20mM、pH6.8、含0.1M NaCl的Tris-HCl緩沖液平衡24h。

進(jìn)一步地，步驟3)中的Hypersil ODS2色譜柱需預(yù)先用含體積濃度為0.1％三氟乙酸的超純水平衡。

進(jìn)一步地，步驟3)中的乙腈為含0.1％三氟乙酸的乙腈。

進(jìn)一步地，步驟3)中的線性梯度洗脫具體為：乙腈濃度從0％升至60％所消耗的時(shí)間為60分鐘。

本發(fā)明還公開了一種上述云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2在制備與抗氧化相關(guān)的藥物、保健品、化妝品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明從中國(guó)產(chǎn)云南臭蛙的皮膚中得到了1個(gè)新的抗氧化多肽AOP-OA2，其抗氧化活性很強(qiáng)，約為維生素E的300倍。將本發(fā)明的云南臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA2全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。

2)純化得到的云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2在自由基ABTS+清除實(shí)驗(yàn)中顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性，揭示本發(fā)明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2有潛在的應(yīng)用前景。

3)云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、抗氧化活性強(qiáng)的特點(diǎn)。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為本發(fā)明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的G50分子篩層析圖；

圖2為本發(fā)明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的HPLC反相C₁₈柱層析圖，其中，1代表AOP-OA2峰；

圖3為本發(fā)明分離純化云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的自由基ABTS⁺清除活性圖。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1：云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2分離純化和鑒定

1、分離純化

云南臭蛙活體采自云南保山，取其皮膚分泌物(溶解于質(zhì)量濃度為0.9％的生理鹽水，這能最大化保持其生物學(xué)活性)，真空冷凍干燥濃縮至干粉，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第一步：Sephadex G50分子篩：按照上述方法獲得皮膚分泌物凍干粉，溶解于去離子水中，取1毫升(蛋白與多肽總含量為100毫克)上預(yù)先用20mM Tris-HCl緩沖液(pH＝6.8，含0.1M NaCl)平衡24小時(shí)的Sephadex G50(GE Healthcare，超細(xì))柱子(長(zhǎng)度40厘米，內(nèi)徑寬度1.5厘米)，用同樣的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為2.0毫升/10分鐘，每10分鐘收集一管，測(cè)定其在280納米下的吸光度，所得的分離純化圖譜如圖1所示，其中AOP-OA2存在于圖所示峰。

第二步：高效液相色譜反相層析：

第一步所得樣品上樣于預(yù)先用超純水(含體積濃度為0.1％的三氟乙酸)平衡好的Hypersil ODS2柱子(伊利特，尺寸為4.6毫米×300毫米)，實(shí)驗(yàn)儀器為Waters 1525高壓液相系統(tǒng)，在流速為1ml/min的條件下，用乙腈(含0.1％的三氟乙酸)在線性梯度(0-60％，60分鐘)條件下進(jìn)行洗脫，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為215毫米，所得的分離純化圖譜如圖2所示，圖中“2”所示為純化的天然云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2。

2、分子鑒定

氨基酸序列的測(cè)定：

純化得到的云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2在全自動(dòng)蛋白質(zhì)序列測(cè)定儀(島津PPSQ-31A)上經(jīng)Edman降解法，測(cè)定了云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2氨基酸全序列，結(jié)果表明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2具有本發(fā)明SEQ ID NO:1所示的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2：云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性

本發(fā)明利用自由基ABTS⁺清除活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)拉云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性，結(jié)果表明云南臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA2具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

具體步驟與結(jié)果：7mM的ABTS在水中和2.8mM的過硫酸鉀混合，室溫黑暗環(huán)境中反應(yīng)6個(gè)小時(shí)，使得ABTS被氧化成為ABTS⁺自由基，之后用去離子水稀釋50倍，取50uL稀釋液和50uL樣品混合，室溫黑暗環(huán)境下反應(yīng)30分鐘，之后，在415nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。自由基ABTS⁺的清除率(％)用下述公式進(jìn)行計(jì)算：(A_blank-A_sample)×100/A_blank。不同濃度云南臭蛙抗氧化肽AOP-OA2的抗氧化活性如圖3所示。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。