本發(fā)明屬于新城疫疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新城疫病毒樣顆粒、制備方法及其應(yīng)用的專利申請(qǐng)。

背景技術(shù)：

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽類為主的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，被OIE列為必報(bào)動(dòng)物疫病，也是我國中長期規(guī)劃五大優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在病毒學(xué)分類中屬于副黏病毒科、禽副黏病毒屬的一個(gè)種，即禽副黏病毒1型，是一種不分節(jié)段的單分子負(fù)鏈RNA病毒。

新城疫病毒基因組結(jié)構(gòu)模式為3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次編碼六種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphor protein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L）。新城疫病毒顆粒為有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直徑約為120nm~300nm，囊膜表面覆蓋有8nm長的纖突，病毒粒子內(nèi)部為一直徑17nm左右的卷曲核衣殼。基質(zhì)蛋白M位于囊膜和核衣殼之間，既與膜結(jié)合又與核衣殼結(jié)合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驅(qū)動(dòng)力。

病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs）是由某種病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的空心蛋白顆粒，不含病毒核酸，無法自主復(fù)制，不存在基因重組或重配和毒力回復(fù)的可能，安全性高，在形態(tài)上與天然病毒顆粒相似，能夠通過與病毒感染一樣的途徑，以接近真實(shí)構(gòu)象的形式遞呈給免疫細(xì)胞，更容易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。

病毒樣顆粒的制備可基于大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及昆蟲桿狀病毒這四種表達(dá)系統(tǒng)，而利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的病毒樣顆粒種類已占到了30%以上，其主要原因在于該系統(tǒng)具有不同于其他表達(dá)系統(tǒng)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)：（1）承載量大：桿狀病毒可容納較大的外源DNA插入(約l0kb)而不影響病毒的復(fù)制與裝配；(2)高效表達(dá)：多角體基因和p10基因有非常強(qiáng)大的啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)靶基因的高水平表達(dá)，外源基因表達(dá)量往往是其他系統(tǒng)的幾十到幾百倍；(3)表達(dá)產(chǎn)物后加工較完善：昆蟲細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的后加工系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接近，具有表達(dá)產(chǎn)物能糖基化、磷酸化、脂肪酞化、酞胺化、切割信號(hào)膚和形成三級(jí)或四級(jí)高級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，所以在結(jié)構(gòu)、生物活性、抗原性和免疫性等方面與天然蛋白有很高的相似性；(4)借助多元表達(dá)載體或借幾個(gè)不同重組病毒共感染，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)外源蛋白，便于研究肽鏈的裝配和蛋白寡聚體的結(jié)構(gòu)和功能；(5)適合表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白：應(yīng)用晚期多角體蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)外源基因，即使表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞毒性蛋白，也不影響表達(dá)水平，因?yàn)樵谶@些有毒產(chǎn)物表達(dá)之前，病毒已經(jīng)完成復(fù)制并釋放出大量成熟的子代毒粒，不會(huì)干擾病毒的復(fù)制；(6)安全性好，桿狀病毒是昆蟲或者節(jié)肢動(dòng)物病毒，對(duì)人畜無害，外源基因插入多角體蛋白基因位點(diǎn)引起其缺失或失活，因此重組病毒不能產(chǎn)生包涵體，這不僅為重組病毒提供了選擇標(biāo)記，而且重組病毒無多角體蛋白形成，失去了病毒粒子的天然防護(hù)物一多角體蛋白結(jié)晶體，極易在自然環(huán)境中失活，不能像野生病毒那樣在環(huán)境中長期存在，在自然界生存能力弱，所以更加安全；(7)桿狀病毒表達(dá)載體通用性廣，能用于表達(dá)來自病毒、細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物幾乎所有蛋白，并且能表達(dá)帶有內(nèi)含子的外源基因。因此，用該系統(tǒng)生產(chǎn)病毒樣顆粒容易形成產(chǎn)業(yè)化。

雞新城疫自1946年在我國首次報(bào)道至今已在中國存在60多年，表現(xiàn)出一定新的臨床及流行特點(diǎn)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)充分證明基因VII型已經(jīng)成為我國NDV流行的主要優(yōu)勢(shì)基因型，但也存在基因III、IX和VI型等散發(fā)，基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升趨勢(shì)。與此同時(shí)，NDV經(jīng)過世界范圍內(nèi)四次大流行后，其宿主范圍也不斷擴(kuò)大，迄今能自然或人工感染的禽類已超過250多種。過去認(rèn)為，NDV一般不對(duì)鴨、鵝等水禽有致病性，而近十幾年，在鴨群、鵝群中常見新城疫的暴發(fā)與流行。大量流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)前我國NDV的優(yōu)勢(shì)流行株屬于基因VII型，而目前國內(nèi)普遍使用的疫苗LaSota為基因II型，雖然它們同屬一個(gè)血清型，但在遺傳距離上相差較遠(yuǎn)，對(duì)當(dāng)前NDV強(qiáng)株的攻擊并不能提供理想的免疫保護(hù)效力。

目前常用的生產(chǎn)活疫苗的毒株有Mukteswar株（I系苗）、Hitchner B1株（II系苗）、F株（III系苗）、LaSota株（IV系苗）以及V4弱毒苗。其中I系苗為中等毒力型，II、III、IV系疫苗毒力較弱。弱毒苗可通過大規(guī)模飲水、噴霧和氣霧進(jìn)行免疫，進(jìn)而刺激黏膜免疫，而且疫苗毒可以從免疫禽傳播給未免疫禽。其不足之處在于污染環(huán)境，并且有毒力返強(qiáng)可能，在機(jī)體抵抗力下降時(shí)，可能引起發(fā)病。生產(chǎn)滅活苗的毒種一般包括LaSota、Ulster等，實(shí)際生產(chǎn)中多用來制造二聯(lián)或多聯(lián)疫苗。滅活苗產(chǎn)生抗體水平較高，持續(xù)時(shí)間較長，比較容易儲(chǔ)存，受母源抗體影響小，免疫不良反應(yīng)小；但滅活苗免疫時(shí)需要較大劑量，所以成本較高。

目前，對(duì)于新城疫疫情通常采取封鎖疫點(diǎn)、全群撲殺，并消毒直到最后一例病例處理完畢后14天內(nèi)無新病例為止，因此疫苗免疫成為預(yù)防該病的主要手段之一。鑒于新城疫的流行對(duì)我國整個(gè)養(yǎng)禽業(yè)造成的巨大的經(jīng)濟(jì)損失，研制新的預(yù)防疫苗仍然具有十分重要的應(yīng)用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種新城疫病毒樣顆粒及其制備方法，從而為新的新城疫疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種新城疫病毒樣顆粒，為由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行組裝形成的空心化結(jié)構(gòu)的蛋白顆粒；其中M蛋白對(duì)應(yīng)的M1基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，F(xiàn)蛋白對(duì)應(yīng)的F1基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白對(duì)應(yīng)的NP1基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白對(duì)應(yīng)的HN1基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

所述新城疫病毒樣顆粒作為預(yù)防禽新城疫病毒感染滅活疫苗的應(yīng)用。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟：

（1）人工合成并PCR擴(kuò)增各結(jié)構(gòu)蛋白基因序列，即分別人工擴(kuò)增序列表中SEQ ID NO.1~4所示的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的堿基序列；

（2）構(gòu)建表達(dá)新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒，具體為，

將步驟（1）中的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分別克隆至轉(zhuǎn)移載體pFastBac1中，獲得重組質(zhì)粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1；

將重組質(zhì)粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1分別轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH10 Bac 感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1；

利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1分別轉(zhuǎn)染宿主Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

（3）新城疫病毒樣顆粒的制備和純化，具體為，

將重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1共接種感染宿主Sf9昆蟲細(xì)胞，四種結(jié)構(gòu)蛋白在表達(dá)并自行組裝后，所形成的病毒樣顆粒會(huì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，在初步離心去除細(xì)胞碎片后，進(jìn)行切向流濃縮，再經(jīng)分子篩過濾和陰離子交換層析后得到純化的病毒樣顆粒。

需要說明的是，上述宿主Sf9昆蟲細(xì)胞，也可為昆蟲Sf21細(xì)胞株或昆蟲High Five細(xì)胞株。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，步驟（3）中，重組桿狀病毒共接種感染宿主Sf9昆蟲細(xì)胞時(shí)，含有重組桿病毒的溶液體積比為：rBV-M1：rBV-F1：rBV-NP1：rBV-HN1=3:2:1:2。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，步驟（3）中，切向流濃縮操作時(shí)，采用50kDa分子量截留的切向流濃縮管在3500r/min水平離心15分鐘。

所述新城疫病毒樣顆粒的制備方法，步驟（3）中，提純操作時(shí)，采用不連續(xù)的20%-40%-60%蔗糖密度梯度離心方法，替代分子篩過濾和陰離子交換層析操作。

本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為：將新城疫病毒四種結(jié)構(gòu)蛋白基因序列克隆、重組至昆蟲桿狀病毒基因組中，分別得到四種能夠表達(dá)新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒，將四種重組桿狀病毒經(jīng)條件優(yōu)化后，按一定比例共感染昆蟲Sf9細(xì)胞，重組桿狀病毒高效表達(dá)四種新城疫結(jié)構(gòu)蛋白并形成完整的病毒樣顆粒，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)純化后獲得大量新城疫病毒樣顆粒。

總體而言，本發(fā)明的主要技術(shù)優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：

1、病毒樣顆粒自行組裝，免疫原性與真實(shí)病毒粒子更為接近，本發(fā)明將四種新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白組合表達(dá)，表達(dá)后，這四種結(jié)構(gòu)蛋白自行組裝形成了新城疫病毒樣顆粒，由于為自組裝形成，因而所提供的病毒樣顆粒在形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫原性方面更加接近真實(shí)病毒粒子；

2、病毒樣顆粒的產(chǎn)量和純度較高，經(jīng)表達(dá)和純化條件優(yōu)化后，新城疫病毒樣顆粒的產(chǎn)量和純度均有較大提升，具有較好產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景；

3、具有較好免疫效果，利用本發(fā)明所提供的新城疫病毒樣顆粒所制備的滅活疫苗，在免疫雞后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，具有較好免疫效果。

附圖說明

圖1為四種重組桿粒的特異性引物PCR鑒定圖譜；其中M：5000bp DNA Marker；1：重組桿粒rBacmid-M1采用M1上游引物/M1下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為1100bp；2：重組桿粒rBacmid-F1采用F1上游引物/F1下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為1700bp；3：重組桿粒rBacmid-NP1采用NP1上游引物/NP1下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為1500bp；4：重組桿粒rBacmid-HN1采用HN1上游引物/HN1下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為1700bp；

圖2為四種重組桿粒的通用引物M13上游引物/M13下游引物PCR鑒定圖譜；其中M：5000bp DNA Marker；1：重組桿粒rBacmid-M1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為3400bp；2：重組桿粒rBacmid-F1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為4000bp；3：重組桿粒rBacmid-NP1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為3800bp；4：重組桿粒rBacmid-HN1采用M13上游引物/M13下游引物的PCR結(jié)果，片段大小約為4000bp；

圖3為正常Sf9細(xì)胞與重組桿粒轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)病變的Sf9細(xì)胞示意圖，其中（a）正常Sf9細(xì)胞，（b）重組桿粒轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)病變的Sf9細(xì)胞；

圖4為新城疫病毒樣顆粒的透射電鏡圖；

圖5為新城疫病毒樣顆粒免疫雞群后的血凝抑制抗體效價(jià)規(guī)律圖；

圖6為新城疫病毒樣顆粒免疫雞群后的免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)做進(jìn)一步的解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中涉及部分生物材料、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備等情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

pFastBac1質(zhì)粒、sf9昆蟲細(xì)胞、DH10Bac感受肽細(xì)胞、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等均為Thermo公司產(chǎn)品；

T載體，購自大連寶生物有限公司；

實(shí)驗(yàn)試劑：

Taq聚合酶，購自北京全式金公司；

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，為Roche公司產(chǎn)品；

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，購自康寧公司；

昆蟲無血清培養(yǎng)基SFM-II，為Thermo公司產(chǎn)品；

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

實(shí)驗(yàn)過程中所用超純水由超純水發(fā)生裝置（Christ Spetron Line）制備；

低溫臺(tái)式高速離心機(jī)，美國ICE公司產(chǎn)品；

PCR儀，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；

紫外凝膠成像儀，Alpha Innotech Corporation公司產(chǎn)品；

切向流設(shè)備、陰離子交換設(shè)備為德國賽多利斯公司產(chǎn)品。

還需說明的是，文本簡要期間，下述實(shí)施例中未具體描述操作，參考現(xiàn)有技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作即可，不再贅述。

實(shí)施例1

本發(fā)明所提供的新城疫病毒樣顆粒，為由M蛋白、F蛋白、NP蛋白和HN蛋白自行組裝形成的空心化結(jié)構(gòu)的蛋白顆粒；其中M蛋白對(duì)應(yīng)的M1基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，F(xiàn)蛋白對(duì)應(yīng)的F1基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，NP蛋白對(duì)應(yīng)的NP1基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，HN蛋白對(duì)應(yīng)的HN1基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

需要解釋的是，制備新城疫病毒樣顆粒時(shí)，由于一般采用的為基因工程的方法，即通過基因工程技術(shù)將特定基因序列整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，并進(jìn)而在宿主細(xì)胞中得以表達(dá)，最后通過特定的分離、提純技術(shù)獲得純化的蛋白顆粒樣品。為使相應(yīng)基因序列能夠與宿主細(xì)胞更好的結(jié)合，發(fā)明人參考新城疫病毒強(qiáng)毒株NA-1株的全基因組序列（GenBank登錄號(hào)：DQ659677），根據(jù)相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)了特異性引物，并進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，在保證堿基序列遺傳信息不發(fā)生根本性改變的基礎(chǔ)上，對(duì)相關(guān)基因序列進(jìn)行了優(yōu)化，最終獲得了SEQ ID NO.1~4所示的堿基序列。

實(shí)施例2

本實(shí)施例就新城疫病毒樣顆粒制備過程中關(guān)鍵的表達(dá)新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒的構(gòu)建過程簡要介紹如下。

（1）擴(kuò)增各結(jié)構(gòu)蛋白基因序列

根據(jù)實(shí)施例1中SEQ ID NO.1~4所示的目的堿基序列，參考現(xiàn)有技術(shù)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR法）人工擴(kuò)增獲得M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因的堿基序列。

PCR擴(kuò)增用引物序列具體為：

M1上游引物：5’-ATGGACTCATCTAGGACTATTGGACT-3’，

M1下游引物：5’-TTATTTACGGAAGGGGTTGTATTTAGC-3’；

F1上游引物：5’-ATGGGTTCGAAGCCATCCACCCG-3’，

F1下游引物：5’-TTAGGCTCTCGTTGTAGCCCT-3’；

NP1上游引物：5’-ATGTCCAGCGTCTTCGACG-3’，

NP1下游引物：5’-TTAGTAACCCCAGTCAGTATCGTTGT-3’；

HN1上游引物：5’-ATGGACCGCGCCGTGAA-3’，

HN1下游引物：5’-TTACACTCTATCGTCCTTCAGAATCT-3’；

PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分鐘30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10分鐘。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收擴(kuò)增產(chǎn)物備用。

（2）構(gòu)建穿梭質(zhì)粒

按照現(xiàn)有技術(shù)，將步驟（1）中克隆獲得的M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因分別克隆至T載體（pMD19T Simple vector）中，轉(zhuǎn)化后測(cè)序驗(yàn)證，獲得構(gòu)建正確的重組克隆質(zhì)粒pT-M1、pT-F1、pT-NP1和pT-HN1。

對(duì)上述所獲得的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切（SalI和NotI雙酶切），同時(shí)對(duì)pFastBac1質(zhì)粒進(jìn)行酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并回收酶切產(chǎn)物。

酶切過程中，10μL酶切體系設(shè)計(jì)如下：

Buffer，4μL；

SalI，0.5μL；

NotI，0.5μL；

重組質(zhì)粒（或pFastBac1質(zhì)粒），1μL；

ddH₂O，4μL；

37℃酶切3h。

利用 T4 DNA連接酶將上述重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物與pFastBac1質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，20μL連接體系設(shè)計(jì)如下：

重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，4μL；

pFastBac1載體酶切產(chǎn)物，1μL；

Buffer，4μL；

T4 DNA連接酶，1μL；

ddH₂O，10μL；

16℃連接過夜。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含有特定抗生素的（氨芐青霉素終濃度100μg/mL，慶大霉素終濃度100μg/mL）選擇培養(yǎng)基篩選陽性菌落。

對(duì)所篩選的陽性菌落經(jīng)擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，采用酶切驗(yàn)證及PCR鑒定，以檢測(cè)M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因是否正確重組至pFastBac1載體中，經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒，即可認(rèn)為穿梭質(zhì)粒pFastBac1-M1、pFastBac1-F1、pFastBac1-NP1、pFastBac1-HN1構(gòu)建成功。

（3）構(gòu)建重組桿粒

將步驟（2）中鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH10 Bac 感受態(tài)細(xì)胞中，使其進(jìn)行同源重組，經(jīng)含有三抗（卡那霉素終濃度100μg/mL、慶大霉素終濃度50μg/mL、四環(huán)素終濃度70μg/mL）的IPTG條件篩選培養(yǎng)基（IPTG終濃度24mg/mL，X-gal終濃度20mg/mL，該篩選培養(yǎng)基可通過菌落形成顏色判定是否發(fā)生同源重組，白色菌落即代表重組成功，藍(lán)色菌落則未成功）培養(yǎng)篩選48h，挑取白斑，獲得重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-HN1、rBacmid-NP1；

對(duì)所提取的重組桿粒進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒定，以確定重組桿粒構(gòu)建正確（具體鑒定過程，按Invitrogen公司Bac-to-Bac? Baculovirus Expression System（試劑盒）操作說明書進(jìn)行），PCR鑒定時(shí)，鑒定用步驟（1）中的特異性引物。

PCR鑒定時(shí)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸1分鐘30秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10分鐘。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。對(duì)圖1分析可以看出，M1片段大小約為1100bp，F(xiàn)1片段大小約為 1700bp，NP1片段大小約為1500bp， HN1片段大小約為1700bp，結(jié)果與預(yù)期相符，即M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因片段正確重組進(jìn)入桿粒中，也即重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-HN1、rBacmid-NP1構(gòu)建正確。

（4）構(gòu)建重組桿狀病毒

利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法（利用按Roche公司的X-tremeGENE HP DNA transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染），將步驟（3）中構(gòu)建正確的重組桿粒rBacmid-M1、rBacmid-F1、rBacmid-NP1、rBacmid-HN1，分別轉(zhuǎn)染宿主Sf9昆蟲細(xì)胞，具體過程如下：

將轉(zhuǎn)染試劑恢復(fù)室溫，吸取4μL轉(zhuǎn)染試劑與2μL重組桿粒（用無血清Grace將重組桿粒稀釋至2μg/100μL）輕輕混合，室溫孵育30min；

然后將混合物加入已準(zhǔn)備好的sf9細(xì)胞六孔板中；

28℃培養(yǎng)96小時(shí)，待細(xì)胞病變（如圖3所示）后，收集細(xì)胞上清液即為第一代重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1；

接著繼續(xù)將第一代重組桿狀病毒接種昆蟲Sf9細(xì)胞，同樣培養(yǎng)條件下，收集第二代重組桿狀病毒；

以此類推，收集至第四代重組桿狀病毒。

為便于檢測(cè)分析，可將每一代重組桿狀病毒于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)過程中，根據(jù)情況對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行PCR鑒定，以檢測(cè)含有M1基因、F1基因、NP1基因、HN1基因片段的重組桿狀病毒是否完整和正確，鑒定時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)通用性引物序列具體如下：

M13上游引物：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，

M13下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’；

PCR鑒定時(shí)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性45秒、55℃退火40秒、72℃延伸4分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。對(duì)圖2分析可以看出，含有M1基因片段的基因組大小約為3400bp；含有F1基因片段的基因組大小約為4000bp；含有NP1基因片段的基因組片段大小約為3800bp；含有HN1基因片段的基因組片段大小約為4000bp，結(jié)果與預(yù)期符合，及重組桿狀病毒結(jié)構(gòu)完整、有效，可以進(jìn)一步應(yīng)用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例就新城疫病毒樣顆粒中結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)、組裝及純化過程簡要介紹如下。

（1）新城疫病毒樣顆粒中結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)

將實(shí)施例2中所收集的含有第四代重組桿狀病毒rBV-M1、rBV-F1、rBV-NP1、rBV-HN1的上清以體積比3:2:1:2的比例，加入懸浮培養(yǎng)的昆蟲Sf9細(xì)胞（總體積為300mL細(xì)胞培養(yǎng)液中加入3mL的rBV-M1、2mL的rBV-F1、1mL的rBV-NP1、2mL的rBV-HN1），感染時(shí)間為96小時(shí)；

感染后，將感染的細(xì)胞置于28℃、120r/min搖床培養(yǎng)；

在此培養(yǎng)過程中，結(jié)構(gòu)蛋白在宿主細(xì)胞中分別表達(dá)后會(huì)自行組裝，組裝后的病毒樣顆粒會(huì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中。

（2）新城疫病毒樣顆粒的純化

收集步驟（1）中的細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)8000r/min離心30分鐘后，可初步去除大的細(xì)胞碎片；

采用50kDa分子量截留的切向流濃縮管在3500r/min水平離心15分鐘，濃縮樣品再經(jīng)過分子篩過濾和陰離子交換層析后得到純化的病毒樣顆粒樣品。

上述提純操作也可采用替代方案：采用不連續(xù)的20%-40%-60%蔗糖密度梯度離心，此時(shí)濃縮樣品在20%和40%蔗糖層的中間會(huì)形成白色條帶，而桿狀病毒則沉淀于底部，其他小的雜蛋白會(huì)停留在頂層，收集白色條帶層即為純化的病毒樣顆粒樣品。

對(duì)純化后的病毒樣顆粒進(jìn)行電子透射電鏡觀察，病毒樣顆粒形態(tài)如圖4所示。

同時(shí)，參照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術(shù)》，對(duì)所制備的新城疫病毒樣顆粒進(jìn)行血凝效價(jià)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示未純化的新城疫病毒樣顆粒血凝效價(jià)為2⁷，純化后的新城疫病毒樣顆粒血凝效價(jià)為2¹⁰，純化步驟可明顯提高樣品純度以及血凝效價(jià)濃度。

實(shí)施例4

本實(shí)施例就實(shí)施例3所制備的病毒樣顆粒作為疫苗使用時(shí)的免疫效果進(jìn)行簡要評(píng)價(jià)。

（1）免疫方案

取30只SPF雞，隨機(jī)分3組，每組10羽；

實(shí)驗(yàn)組：新城疫病毒樣顆粒，每羽注射100μL體積，其中包含有10μg的新城疫病毒樣顆粒（實(shí)施例3檢測(cè)結(jié)果表明，10μg新城疫病毒樣顆粒的血凝效價(jià)為2⁹）；

陽性對(duì)照組：新城疫病毒NA-1株經(jīng)紫外射線滅活，每羽注射100μL體積，其中血凝效價(jià)為2⁹；

陰性對(duì)照組：生理鹽水，100μL/只；

7日齡首免（胸部肌肉注射），間隔7周加強(qiáng)免疫一次。

（2）血凝抑制試驗(yàn)

從免疫后第一周開始，每隔一周翅下靜脈采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術(shù)》，以新城疫血凝抑制試驗(yàn)陽性抗原作為檢測(cè)抗原，倍比稀釋血清樣品后，加入25μL四單位抗原等體積混合，于37℃作用30分鐘，再加入25μL的1%雞紅細(xì)胞，冰上作用40分鐘，HI效價(jià)為發(fā)生紅細(xì)胞完全凝集抑制的最高血清稀釋倍數(shù)。

結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組的血凝抑制效價(jià)呈明顯上升趨勢(shì)，于免疫后第3周達(dá)到峰值，第7周低于臨界保護(hù)值（血凝抑制效價(jià)4log2為評(píng)價(jià)新城疫疫苗免疫效果的臨界保護(hù)值）時(shí)進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，血凝抑制效價(jià)又開始上升，經(jīng)歷6周后，其效價(jià)維持在臨界保護(hù)值附近。

（3）免疫保護(hù)試驗(yàn)

在免疫后第16周，采用新城疫病毒NA-1株對(duì)實(shí)驗(yàn)雞群進(jìn)行攻毒，具體是將新城疫病毒NA-1株通過滴鼻途徑感染雞群，之后在10天期間觀察雞群的存活情況。

結(jié)果如圖6所示，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組未出現(xiàn)雞死亡，即存活率為100%，而陰性對(duì)照組（X形）在第5天死亡6只和第6天死亡4只，即存活率為0%。

綜上所述，本發(fā)明專利設(shè)計(jì)和制備的新城疫病毒樣顆粒可以刺激雞體產(chǎn)生有效的抗體效價(jià)，并且可以保護(hù)雞群免受活病毒的攻擊，存活率達(dá)100%。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大學(xué)

<120> 一種新城疫病毒樣顆粒、制備方法及其應(yīng)用

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1094

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggactcat ctaggactat tggactctac ttcgactccg ccctcccctc gtcttcgctg 60

ttggcattcc cgattgtttt gcaggatacc ggtgacggca agaaacagat cactcctcaa 120

taccgcattc agcgtctgga tagctggacc gactctaagg aagattcagt cttcatcacc 180

acttacggct tcatcttcca aattggaaac gaggaagcca ctgttggcgt gattaacgat 240

aaccctcgcc acgagctgct ctccagcgct atgctctgct tgggtagcgt gcccaacgac 300

ggcgatctgg tcgaactcgc tcgcgcctgt ctgaccatgg tggtcactcg taagaaatct 360

gctacaaaca cggagaggat cgtcttctca gttgtgcaag cacccagagt gctccagagt 420

tgcatggtcg ttgccaaccg ctactcttca gtgaacgctg tcaagcatgt taaagcccca 480

gagaagatcc cgggatcggg caccctcgaa tacaaagtga acttcgtcag tttgactgtg 540

gtcccacgcc gtgacgtgta ccgcatcccg actgctgttc tgaaagtgag cggaagttcg 600

ctctacaacc tggctctcaa cgtcacaatt gacgtcgatg ttgaccctaa gtctcccttg 660

gtgaagtcac tgagtaaatc ggattccggt tactacgcaa acttgttcct gcacatcggc 720

ctgatggcta cagttgacaa gaaaggaaag aaagtgacgt tcgataagat cgaggaaaaa 780

attaggagac tcaacttgag tgtcggactc tcggacgttt tgggtccatc agtgctggtc 840

aaggcaaggg gtgcgagaac aaaattgctg gctccgttct tctccagctc tggcacggcc 900

tgttacccta tcgcaaacgc gtccccccaa gtcgcaaaga ttttgtggtc ccagaccgcg 960

cacctgcgta gcgttaaggt gatcattcaa gctggtacac agagggctgt cgctgttacg 1020

gctgaccatg aggtgacctc cacaaagatt gagaaaagac acgccatcgc taaatacaac 1080

cccttccgta aata 1094

<210> 2

<211> 1662

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgggttcga agccatccac ccgcatccca gctccgctca tgttgatcac tcgtattatg 60

ctgatcctcg gatgcatccg cttgacctcc agcctggacg gtcgtcctct ggctgccgca 120

ggcatcgtgg tcactggaga taaggctgtc aacgtttaca cctcttcaca gactggctca 180

atcattgtca aactgctccc taacatgccc aaggacaaag aggcctgtgc aagggcgcca 240

ttggaagcct acaacagaac actgaccact ttgctgacgc cgctcggtga ctcaattagg 300

aagatccagg gatccgtgag cacctctggt ggccgccgtc aaaaaagatt cattggagct 360

gttatcggta gtgtggcact gggagtcgcg acagcggctc aaatcacggc cgcagcggct 420

ctgattcagg ctaaccaaaa cgccgcaaac attctccgca tcaaggaatc catcgcggct 480

acaaacgagg ccgttcacga agtgacggac ggattgagcc agctgtctgt ggcagtcggc 540

aagatgcagc aattcgtcaa cgaccaattc aacaacacag ctcgtgagct cgattgcatc 600

aaaattacgc agcaagttgg agtggagttg aacctgtacc tcacagaact gacaacggtg 660

ttcggtcctc agatcacctc ccccgctctc acacagttga cgatccaagc actgtacaac 720

ctcgcgggtg gtaacatgga ctacctcttg accaagctgg gcatcggaaa caaccagttg 780

agttcgctga ttggttcggg cttgatcact ggctacccta ttctgtacga ttcccagaca 840

caactgctcg gcatccaagt taacttgccc agcgtgggaa acctgaacaa catgagggcc 900

acatacctcg agacgttgtc agttagtacc actaagggtt acgcttccgc cttggtgccc 960

aaagttgtga ctcaggtcgg ctctgttatc gaggaactgg acacaagcta ctgcattgaa 1020

tctgacttgg atctgtactg tacccgtatc gtcactttcc caatgtcacc gggtatttac 1080

tcatgcctga gtggcaacac ctcagcttgt atgtacagta agactgaggg cgctctcaca 1140

acgccataca tggccttgaa gggatccgtg atcgcaaact gcaaaattac cacttgccgc 1200

tgtgcggacc ctcccggaat catttcacag aactacggag aggctgtgag tctcatcgac 1260

aggcattcgt gtaacgtcct ctccttggat ggcatcaccc tgagactcag cggagaattc 1320

gatgccactt accagaagaa catctcgatt ctggactccc aagtcatcgt taccggtaac 1380

ctcgatattt ctactgagtt gggcaacgtc aacaactcga tctccaacgc tctggaccgc 1440

ctcgccgaaa gcaactctaa gctggataaa gtgaacgtcc gtctgacctc aactagtgcc 1500

ctcattacct acatcgtgct cactgtcatc agcttggtct tcggcgcatt gtctctggtt 1560

ctcgcgtgct acctgatgta caagcagaaa gctcagcaaa agacattgct gtggctggga 1620

aacaacacgc tcgaccaaat gagggctaca acgagagcct aa 1662

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgtccagcg tcttcgacga gtacgaacag ttcctggctg cccaaacccg tcctaacggt 60

actcacggtg gcggagagaa gggctcgacc ctgaaagtgg aagtccccgt tttcgctctc 120

aactccgacg atccagagga tcgctggaac ttcgccgtgt tctgcttgcg tatcgctgtc 180

agcgaagacg ccaacaagcc cttgcgccag ggtgctctga tttctctgct ctgttctcac 240

tcacaagtta tgcgtaacca tgtggcactc gcgggcaaac agaacgaggc tactctcgcc 300

gtcttggaaa ttgacggctt cgcaaacagc gttccccaat tcaacaacag gtccggagtg 360

agcgaggaaa gggcccagag attcatggtc atcgcaggat ccctgccaag agcatgcagc 420

aacggcacac ctttcgtgac ggctggagtc gaggacgatg ccccagaaga tatcacagac 480

acgctcgagc gcatcttgtc aattcaggtg caagtctggg ttactgtggc caagaccatg 540

actgcatacg aaacagcgga cgagagtgaa acgcgccgta tcaacaggta catgcagcaa 600

ggaagagtcc aaaagaaata cattctgcac cctgtttgta ggagtgcaat ccagctcaca 660

attcgccatt cgttggcggt ccgtatcttc ctggtttccg agctcaagcg cggtcgtaac 720

accgctggtg gctcttcaac ttactacaac ctcgtcggcg acgttgattc atacatccgc 780

aacaccggat tgactgcctt cttcctcacc ttgaagtacg gcattaacac aaaaacgtcc 840

gctctggccc tcagttcgct gactggagac atccagaaga tgaaacaact gatgcgcctc 900

taccgtatga agggagagaa cgctccgtac atgaccttgc tgggcgactc tgatcagatg 960

tcattcgcac ccgcggaata cgcccaattg tactctttcg ctatgggtat ggcctcagtt 1020

ctggataagg gcacaggaaa ataccagttc gctagggact tcatgagtac gtcgttctgg 1080

agactgggag tggagtacgc tcaggcccaa ggttccagca tcaacgagga tatggcagcg 1140

gaattgaagc tgactccagc tgcaaggaga ggtctcgcag cggctgccca gcgcgtgagt 1200

gaggaaatcg gctcgatgga tattcctaca cagcaagctg gagtcttgac gggtctgtca 1260

gacgagggac cccgtacacc acaaggaggt agtaacaagc cgcagggtca acctgatgcc 1320

ggtgacggcg aaacgcagtt cctggacttc atgagggcag tggcgaacag catgagagag 1380

gcaccgaacc ctgcgcaatc taccactcat cccgaacctc ccccaacccc aggagcttct 1440

caggacaacg atactgactg gggttactaa 1470

<210> 4

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atggaccgcg ccgtgaaccg tgtggtcctc gaaaacgagg aacgtgaggc aaagaacact 60

tggaggttgg ttttcagaat cgcggtgctg ctcttgatgg tcatgacatt ggctatttca 120

gctgccgcac tggcctactc cagcgaagca agtactcctc acgacctggc tggtatctca 180

accgtcatta gtaaaactga ggataaggtt acaagcctgc tctcttcaag tcaggacgtg 240

atcgatagga tttacaagca agtcgcgctc gaaagcccct tggctttgct gaacacggag 300

tctatcatta tgaacgccat caccagcctg tcttaccaga ttaacggagc ggctaacaac 360

tctggttgcg gcgtccctgt tcatgacccc gattacatcg gtggcattgg caaggaattc 420

atcgttgacg atatttcgga cgtgacctcc ttctacccaa gcgcctacca agagcacctg 480

aacttcatcc cagcaccgac cactggatca ggttgtaccc gcatcccttc tttcgacatg 540

tcaacaacgc attactgcta cactcacaac gtgatcctga gtggttgtcg tgatcactca 600

catagtcacc agtacttggc cctgggagtt ctcaggacat ctgcaacggg tagagtgttc 660

ttcagtactc tgcgctcgat caacctcgac gatacacaaa accgtaagtc gtgctccgtc 720

agcgctactc ccttgggctg cgacatgctg tgttctaaag ttacagaaat cgaggaagag 780

gattacaagt ccattacccc aactagcatg gtccatggca ggttgggatt cgacggacag 840

taccacgaga aagacctcga taccactgtc ttgttcaagg attgggttgc caactaccca 900

ggcgtgggag gtggcagctt catcgacgat agagtctggt tcccggttta cggaggtctc 960

aaaccaaact ctccgtcaga cacagctcaa gaaggaaaat acgtgatcta caagcgctac 1020

aacgatacct gtcctgacga gcaggattac caaatccgta tggctaaatc gtcctacaag 1080

ccaagacgtt tcggaggaaa gagagtccag caagccatcc tgtccattaa agttagtacg 1140

tcgctgggaa aggaccccgt gctcaccatc cctcccaaca caattacgct gatgggcgct 1200

gaaggacgca tcctcaccgt cggcacttcg catttcttgt accagcgtgg aagctcttac 1260

ttctcacctg ctctcttgta ccccatgacc gtgaacaaca agaccgcgac tctgcacagc 1320

ccatacacgt tcaacgcttt caccaggcca ggtagtgtcc cgtgccaggc gtcggctaga 1380

tgcccaaact cctgtatcac aggcgtgtac acggaccctt accccctgat tttccatcgc 1440

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ccagtgtcag ctgtcttcga ctccatcagc aggtctagag ttacgagagt gtcaagttcg 1560

tccaccaaag ccgcatacac aacgtccact tgcttcaagg ttgtgaaaac aaacaaggcc 1620

tactgtttgt ctatcgcaga aatttcaaac actctgttcg gcgagttcag gatcgtgcct 1680

ctgctcgtcg agattctgaa ggacgataga gtgtaa 1716