本發(fā)明屬于分子標記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及耐熱蘿卜EST-SSR分子標記、分子標記的引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

分子標記(Molecular Markers)，是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記--形態(tài)學(xué)標記、生物化學(xué)標記、細胞學(xué)標記相比，DNA分子標記具有標記的數(shù)量不限，能分析不同生物發(fā)育階段的物種，且不影響目標性狀的表達，因此，DNA分子標記較其他方法具有優(yōu)越性。

DNA分子標記常用的標記方法包括RFLP分子標記、RAPD分子標記和SSR(Simple Sequence Repeats)分子標記。SSR分子標記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。由于每個SSR兩側(cè)的序列一般是相對保守的單拷貝序列。由于微衛(wèi)星可在多個等位基因間顯示差異，因而在作物的遺傳圖譜構(gòu)建，遺傳多樣性發(fā)析，親緣關(guān)系鑒定，DNA指紋圖譜構(gòu)建，品種鑒定，QTL分析及分子輔助育種中均具有公認的優(yōu)越性及應(yīng)用前景。從品種間具廣泛位點變異的角度考慮，SSR分子標記比RFLP及RAPD分子標記更具多態(tài)性，尤其對花生、六倍體小麥等用常見分子標記技術(shù)檢測不出很多DNA片段多態(tài)性的作物品種來說，具有更大的研究價值和應(yīng)用前景。

蘿卜是我國重要的蔬菜作物，但分子生物學(xué)等基礎(chǔ)研究相對比較落后，遠不能滿足育種或其他領(lǐng)域研究的需求，同時，蘿卜種質(zhì)資源豐富，但是栽培品種表型相似性高，遺傳背景狹窄，例如，崔娜等人報道了75份蘿卜材料的平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)以及基因多樣性指數(shù)的數(shù)值都不高，具體地來自韓國白蘿卜品種晨曉和雪鳳凰等15對蘿卜品種之間的相似系數(shù)為1.00，表明它們可能具有相同的遺傳背景。鑒于此，蘿卜不同品種之間區(qū)分較為困難，目前尚沒有一種有效的SSR分子標記能夠區(qū)分耐熱蘿卜品種的純度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種耐熱蘿卜EST-SSR分子標記、分 子標記的引物及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的分子標記具有共顯性，能夠有效區(qū)分出耐熱蘿卜品種，并能進一步對耐熱型蘿卜品種的純度進行鑒定。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

耐熱蘿卜EST-SSR分子標記，包括SSR17和SSR75一種或兩種；

所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明還提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標記的引物，包括SSR17的正向擴增引物和反向擴增引物，以及SSR75的正向擴增引物和反向擴增引物中的一組或兩組；

所述SSR17的正向擴增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；SSR17的反向擴增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

所述SSR75的正向擴增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；SSR75的反向擴增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

本發(fā)明提供了所述的耐熱蘿卜EST-SSR分子標記在品種純度鑒定中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述耐熱蘿卜包括夏抗40天。

優(yōu)選的，所述品種純度鑒定包括以下步驟：

1)提取待測樣品DNA；

2)用權(quán)利要求2所述引物對所述步驟1)得到的DNA分別進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；

3)將所述擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到電泳圖；

4)比較所述步驟3)得到的電泳圖和預(yù)定的標準電泳帶型，所述標準電泳帶型為純合體父本、純合體母本和雜合體子一代在電泳圖中的帶型，若待測樣品的帶型與所述雜合體子一代的帶型一致則判斷為子一代雜合體，若待測樣品的帶型與純合體父本或純合體母本的帶型一致或與上述三者帶型均不一致則判斷為非子一代雜合體。

本發(fā)明提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標記，包括SSR17和SSR75一種或兩種；所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。本發(fā)明得到針對耐熱蘿卜品種的2個EST-SSR分子標記，并且所述SSR17和SSR75具有共顯性表達特性，利用具有共顯性關(guān)系的2個EST-SSR分子標記對商品種耐熱蘿卜品種--夏抗40天的群體純度進行檢測，結(jié)果顯示其純度高達92％，同田間表型一致，因此，所述2個EST-SSR分子標記能夠用于耐熱蘿卜品種的純度檢測。

附圖說明

圖1為實施例1中SSR17和SSR75分子標記的PCR電泳圖；

圖2為實施例2中SSR17分子標記對夏抗40天及其父母親本擴增的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖3為實施例3中SSR75分子標記對夏抗40天及其父母親本擴增的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖4為實施例4中SSR17分子標記對子一代群體品種純度鑒定的電泳圖；

圖5為實施例5中SSR75分子標記對子一代群體品種純度鑒定的電泳圖；

圖6為實施例6中夏抗40品種田間種植情況。

具體實施方式

本發(fā)明提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標記，包括SSR17和SSR75一種或兩種；

所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明還提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標記的引物，包括包括SSR17的正向擴增引物和反向擴增引物，以及SSR75的正向擴增引物和反向擴增引物中的一組或兩組；

所述SSR17的正向擴增引物的核苷酸序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID No.3所示；所述SSR17的反向擴增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

所述SSR75的正向擴增引物的核苷酸序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID No.5所示；所述SSR75的反向擴增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

本發(fā)明中，所述耐熱蘿卜優(yōu)選包括夏抗40天。

本發(fā)明中，所述SSR17和SSR75的正反向引物的設(shè)計方法是以NCBI網(wǎng)站中公開的蘿卜品種EST序列為模板，采用Primer3.0引物設(shè)計軟件進行設(shè)計EST-SSR引物。

本發(fā)明中，所述SSR17或SSR75的正反向引物應(yīng)用到PCR擴增中。所述PCR擴增中優(yōu)選將SSR17正反向擴增引物和SSR75的擴增引物分別在不同PCR反應(yīng)體系中擴增。

所述的的PCR擴增中反應(yīng)體系優(yōu)選如表1所示。

表1 PCR擴增中反應(yīng)體系

本發(fā)明中，所述PCR擴增過程中反應(yīng)程序優(yōu)選如下：

第一步:PCR儀上蓋預(yù)熱104℃；

第二步:94℃預(yù)變性3min；

第四步:72℃延伸4min。

所述PCR擴增體系的原料的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的PCR擴增體系的原料即可。本發(fā)明實施例中，所述PCR擴增體系的原料購自東盛生物(http://www.dongshengbio.com/)。

本發(fā)明提供了所述的耐熱蘿卜EST-SSR分子標記在品種純度鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述品種純度鑒定的具體方法優(yōu)選包括以下步驟：

1)提取待測樣品的DNA；

2)用上述技術(shù)方案所述引物對所述步驟1)得到的DNA進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；

3)將所述擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到電泳圖；

4)比較所述步驟3)得到的電泳圖和預(yù)定的標準電泳帶型，所述標準電泳帶型為純合體父本、純合體母本和雜合體子一代在電泳圖中的帶型，若待測樣品的帶型與所述雜合體子一代的帶型一致則判斷為雜合體，若待測樣品 的帶型與純合體父本或純合體母本的帶型一致則判斷為純合體。

本發(fā)明中，所述DNA的提取方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的DNA提取方法即可，例如試劑盒法或CTAB法。

本發(fā)明中，所述PCR擴增的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的PCR擴增的方法即可。本發(fā)明實施例中，所用的PCR儀為MJ PTC-200 DNA Engine Thermal Cycler。

本發(fā)明中，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法即可。

本發(fā)明中，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳過程的電壓優(yōu)選為1200～1500V，更優(yōu)選為1400V。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳過程的電流60mA～80mA，更優(yōu)選為70mA。

得到待測樣品的電泳圖后，本發(fā)明根據(jù)所述待測樣品的電泳圖和預(yù)定的標準電泳帶型，得到待測樣品的品型。具體的，所述標準電泳帶型為純合體父本、純合體母本和雜合體子一代在電泳圖中的帶型，提取純合體父本、純合體母本和雜合體子一代的DNA，按照上述技術(shù)方案所述PCR擴增方案和聚丙烯酰胺凝膠電泳方案，得到純合體父本、純合體母本和雜合體子一代的電泳圖。

本發(fā)明中，所述雜合體子一代為夏抗40天。所述夏抗40天蘿卜品種的來源從商業(yè)途徑購買。本發(fā)明實施例中，所述夏抗40天蘿卜品種的來源購自武漢七葉紅都市園藝有限公司。本發(fā)明中，所述夏抗40天的品種是由武漢市蔬菜科學(xué)研究所選育的耐熱白皮蘿卜品種，該蘿卜已經(jīng)2000年完成成果驗收。所述夏抗40天蘿卜品種的父本和母本的試驗材料葉片從武漢市蔬菜科學(xué)研究所獲得。

本發(fā)明中，所述SSR17或SSR75分子標記的引物擴增得到的電泳圖可單獨用來鑒定品種純度，也可以將SSR17和SSR75分子標記擴增得到的兩個電泳圖結(jié)合起來鑒定品種純度。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的耐熱蘿卜EST-SSR分子標記及其應(yīng)用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

根據(jù)NCBI中公開的蘿卜EST序列，采用Primer3.0引物設(shè)計軟件，設(shè)計SSR引物，通過南京金斯瑞公司合成SEQ ID No.3～SEQ ID No.62對SSR引物。

提取耐熱蘿卜-夏抗40天及其父母親本的DNA，具體包括以下步驟：

1、將蘿卜幼嫩葉片放入2ml平底EP管中，放入液氮中。

2、迅速研磨直至成粉末狀。

3、取出EP管迅速加入0.6ml預(yù)熱到65℃的CTAB溶液(2％CTAB 20gm CTAB、20mM EDTA、100mM Tris-Cl pH 8.0、1.4M NaCl溶于一升水中

調(diào)整pH 7.5-8.0，滅菌后加0.2％巰基乙醇)，快速混勻后放置在65℃干浴器中20min,每5min緩慢顛倒一次。

4、用剪口的槍頭吸出上清液到新的EP管中，加入300ul氯仿、異戊醇(體積比24:1)，混勻5min。

5、1500g離心10min。

6、取出上清，重復(fù)第4-5步。

7、取出上清，加入400ul異丙醇?；靹蚝箅x心12000rpm，10min。

8、用76％乙醇溶液潤洗一次。

9、晾干后加入20ul雙蒸水，溶解DNA。

按照表2配置PCR反應(yīng)體系。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序如下：

第一步:PCR儀上蓋預(yù)熱104℃；

第二步:94℃預(yù)變性3min；

第四步:72℃延伸4min。

擴增產(chǎn)物的PAGE膠檢測

將SSR17和SSR75位點的擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后的凝膠進行EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)下進行拍照。

SSR17、SSR75和SSR80位點的擴增產(chǎn)物的擴增情況如圖1所示。從圖1中可以看出，SSR17、SSR75和SSR80擴增位點能夠得到清晰的條帶，說明上述3對引物具有較好的特異性。

實施例2

按照實施例1的方法對夏抗40天父母親本的DNA進行SSR17位點的PCR擴增。

將擴增得到夏抗40天的SSR17擴增產(chǎn)物和夏抗40天父母親本的DNA進行SSR17位點的擴增產(chǎn)物進行PAGE凝膠電泳。

PAGE膠對擴增產(chǎn)物的檢測是將瓊脂糖凝膠電泳初步篩選出的引物對紅蘿卜基因組DNA進行擴增，并將PCR擴增產(chǎn)物中的(夏抗40天父本,夏抗40天母本，夏抗40天)擴增產(chǎn)物中，均添加5ul上樣緩沖液,用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠。電泳儀的設(shè)置參數(shù)一般是電壓1200～1500V，電流60mA～80mA的功率下電泳1.5小時。電泳槽內(nèi)緩沖液一般為0.5×TBE或者1×TBE。電泳結(jié)束后,取下膠板進行銀染顯色。具體操作流程如下:

(1)玻璃板清洗:用清潔劑將玻璃板兩面反復(fù)清洗擦拭干凈,用清水和純水清洗(up水)清洗后，長板和短板處理如下,

長板:先用無水酒精2ml擦凈晾干，放室溫,反硅化處理，無水酒精2ml+反硅化劑(親和硅烷)10ul+冰乙酸10ul,濾紙涂勻晾干

短板:先用無水酒精2ml擦凈晾干，放室溫，硅化處理，剝離硅烷2ml。濾紙涂勻晾干。

(2)制膠和灌膠:1.0mm板取60mlPAGE(1.5mm板取80ml)儲存液，加420ul 10％AP和42ul TEMD溶液,搖勻后導(dǎo)入板子間隙(注意不要有氣泡進入)，將梳子倒置，使無孔的一方插入膠板中。然后，將膠板水平放置15min左右，待你凝固(在室溫20℃左右時)。

(3)電泳:將凝固好的玻璃板放置在電泳槽后，在上下槽中分別添加適量0.5×TBE緩沖液，預(yù)電泳10min后，暫停電泳。然后在梳齒空內(nèi)加入DNA擴增樣4.5ul。

(4)銀染:電泳結(jié)束后，在裝有染色液的盆中加入3ml甲醛混勻，然后將膠板短板移除，將帶有膠的長坂放入到染色液中，搖床60-70搖5min(新配銀染液染色5min，用過5到6次后，染色10min)。銀染液制備:3g AgNO₃+2L ddH₂O(可用8～10次)

(5)漂洗:將長膠板從銀染液中取出,然后用純水清洗2～3次，轉(zhuǎn)入到顯色液中。

(6)顯色:加入2LNaOH溶液中，顯色約5min左右，加3ml甲醛(搖床60～80min左右)。色液制備:30g NaOH，2L ddH₂O，用之前加熱(約50℃)效果較好。(可1L ddH₂O加熱至100度左右，另加1L ddH₂O，配NaOH，二者混合)。停止顯色后用純水清洗干凈。

(7)照相:顯色結(jié)束后，將膠放在白色背景下，照相保存，并讀取記錄顯色條帶。

SSR17擴增產(chǎn)物的PAGE凝膠電泳圖見圖2。從圖2中可以看出，夏抗40天父本和夏抗40天母本的條帶大小不相同，說明存在等位基因，夏抗40天擴增的條帶有兩條，并且得到的兩條條帶分別與父本和母本的條帶相同，說明夏抗40天蘿卜品種的SSR17位點具有共顯性。

實施例3

按照實施例1的方法對夏抗40天父母親本的DNA進行SSR75位點的PCR擴增。

將實施例1中擴增得到夏抗40天的SSR75擴增產(chǎn)物和夏抗40天父母親本的DNA SSR75擴增產(chǎn)物進行PAGE凝膠電泳。所述PAGE凝膠電泳步驟同實施例2，在此不做贅述。

SSR75擴增產(chǎn)物的PAGE凝膠電泳圖見圖3。從圖3中可以看出，夏抗40天父本和夏抗40天母本的條帶大小不相同，說明存在等位基因，夏抗40天擴增的條帶有兩條，并且得到的兩條條帶分別與父本和母本的條帶相同，說明夏抗40天蘿卜品種的SSR75位點具有共顯性。

實施例4

對商品夏抗40天蘿卜品種進行純度鑒定，鑒定方法如下：

按照實施例1的方法對夏抗40天子一代進行DNA提取。將商品夏抗40天蘿卜品種和父本、母本和夏抗40天采用實施例1的PCR方法進行擴增SSR17位點，采用實施例2的方法進行PAGE凝膠電泳，得到的PAGE凝膠電泳圖如圖5所示。

由圖4可以看出，通過以父本、母本和夏抗40天的帶型作為參照，將待檢測的子一代群體中每一個體的電泳帶型是否與夏抗40天的帶型是否一致，與夏抗40天的帶型一致的則表明為子一代真雜合體，否則為非子一體真雜合體，根據(jù)計算，子一代中真雜合體純度達到92％。

實施例5

對商品夏抗40天蘿卜品種進行純度鑒定，鑒定方法如下：

按照實施例1的方法對夏抗40天子一代進行DNA提取。將商品夏抗40天蘿卜品種和父本、母本和夏抗40天采用實施例1的PCR方法進行擴增SSR75位點，采用實施例2的方法進行PAGE凝膠電泳，得到的PAGE凝膠電泳圖如圖5所示。

由圖5可以看出，通過以父本、母本和夏抗40天的帶型作為參照，將待檢測的子一代的電泳帶型是否與夏抗40天的帶型是否一致，與夏抗40天的帶型一致的則表明子一代為雜合種，否則為純種；根據(jù)計算，子一代中純度達到95％。

實施例6

夏抗40品種在田間種植后采用人工觀察形態(tài)指標及稱量畝產(chǎn)等指標，田間表現(xiàn)如圖6，并對蘿卜的根、葉等重要植物學(xué)性狀進行觀察和統(tǒng)計分析，結(jié)果如表3。從根形上看，夏抗40天蘿卜為長圓柱形，葉形為板葉。結(jié)合葉形和根形表現(xiàn)，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)夏抗40天蘿卜田間純度可達92.21±2.35％(M±SD)。

表3夏抗40天植物學(xué)性狀

由以上實施例可知，本發(fā)明提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標記，為SSR17或SSR75。本發(fā)明通過對耐熱蘿卜品種--夏抗40天篩選得到2個EST-SSR分子標記，并且所述SSR17和SSR75具有共顯性表達特性，利用具有共顯性關(guān)系的2個EST-SSR分子標記對商品種耐熱蘿卜品種--夏抗40天的群體純度進行檢測，結(jié)果顯示其純度高達92％以上，同田間表型一致，因此，所述2個 EST-SSR分子標記能夠用于耐熱蘿卜品種的純度檢測。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 黃岡師范學(xué)院

<120> 耐熱蘿卜EST-SSR分子標記及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagcagatg attgcaaaac cttaagccat tctaacaaaa gaaaacttgc agaagacatt 60

gatgatacag catcaccacc accaccatca tcatcatcat catcatcatc aagttctgat 120

gattcttctg tcgaggactt tccatcttca aaacggatg 159

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggggagtta gtgggaagaa gaggaatgta gcagcagcag cacatggtgg tggtgggaag 60

aaaaaggatt gtgatgatga aaagttggtg ttttttgatg atcaagtggt gaaggagaag 120

gtggtggtag aggagagtgt tactgagaag aaagttgaac agtttttcaa gggtttgaag 180

tcaaataatg agagagctgt ggctagtggt ggtggtggtg gtggtgatgg agagcctttc 240

cttgtgacga 250

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaagcagatg attgcaaaac c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catccgtttt gaagatggaa a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggggagtta gtgggaagaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgtcacaag gaaaggctct 20