本發(fā)明涉及包含至少三種結(jié)合特異性的結(jié)合分子，其中(a)第一特異性是針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的乙型肝炎病毒(hbv)表面抗原；(b)(i)第二和第三特異性分別針對cd3和cd28；或(ii)第二和第三特異性選自針對cd16、cd56、nkp30、nkp46、4-1bb和nkg2d的特異性；(c)每種結(jié)合特異性由一個或更多個結(jié)合位點提供，每個結(jié)合位點由以下獨立地提供：(i)六個互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的組，其中所述六個cdr的組由三個cdr的第一組和三個cdr的第二組構(gòu)成，其中所述第一組和所述第二組各自被包含在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中；或(ii)三個cdr的組，其中所述三個cdr的組被包含在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中。

在本說明書中，引用了包括專利申請和制造商手冊在內(nèi)的許多文件。雖然不認(rèn)為這些文件的公開內(nèi)容與本發(fā)明的可專利性相關(guān)，但是在此通過引用將其整體地并入。更具體地，所有引用的文獻(xiàn)均通過引用并入，就像每個單獨的文獻(xiàn)被具體和單獨地指出要通過引用并入一樣。

約有3.5億人慢性地感染有乙型肝炎病毒(hbv)。hbv感染可能引起肝硬化和肝細(xì)胞癌(hcc)，其每年造成約一百萬人傷亡(ganem等人，hepatitisbvirusinfection—naturalhistoryandclinicalconsequences.nengljmed；350：1118-29(2004))。hbv感染在約5％的成人患者和約90％的新生兒中目前無法控制。在這種情況下，hbv感染變?yōu)槁缘??？赡艿脑蚴羌?xì)胞免疫反應(yīng)不足。目前可用的用于治療hbv感染的抗病毒藥物抑制病毒復(fù)制。然而，共價閉合的環(huán)狀dna(cccdna)保留在受感染的肝細(xì)胞的核中，并且一旦患者停止服用藥物，可能導(dǎo)致hbv感染的再激活。因此，如果要完全治愈感染，消除攜帶所述cccdna的hbv感染細(xì)胞是必不可少的(protzer等人，natimmunolrev12：2013-213(2012))。

然而，hbv感染細(xì)胞的這種細(xì)胞毒性消除(通過細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞或自然殺傷(nk)細(xì)胞)不發(fā)生或發(fā)生的程度不足。

攜帶hbvcccdna的感染細(xì)胞在它們的表面上展示病毒表面蛋白。盡管病毒被釋放到細(xì)胞內(nèi)囊泡中，但由于許多hbv表面蛋白仍然整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)膜中，所以推測發(fā)生這種情況。在囊泡運輸過程中，所述細(xì)胞內(nèi)膜可能與細(xì)胞膜融合，其結(jié)果是hbv表面蛋白在被感染細(xì)胞的表面上展示。

bohne等人(tcellsredirectedagainsthepatitisbvirussurfaceproteinseliminateinfectedhepatocytes.gastroenterology；134：239-247(2008))和krebs等人(tcellsexpressingachimericantigenreceptorthatbindshepatitisbvirusenvelopeproteinscontrolvirusreplicationinmice.gastroenterology(2013))描述了嵌合抗原受體，當(dāng)其被逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送并在t細(xì)胞表面上表達(dá)時，使原代人類和小鼠t細(xì)胞能夠識別展示hbv小表面抗原的肝細(xì)胞并裂解hbv復(fù)制的細(xì)胞。

ep2524699a1描述了三功能抗體。這些抗體“具有功能性fc部分”并且“必須由不同亞類的免疫球蛋白重鏈組成”。另一方面，hornigund-schwarz在“antibodyengineering”的第40章(patrickchannes編輯，humane出版社，2012)中描述了沒有fc部分的scfv構(gòu)建體。

liao等人(oncologyreports3，637-644(1996))描述了用于裂解裸鼠中的人類肝癌異種移植物的再靶向效應(yīng)細(xì)胞的雙特異性單克隆抗體。所描述的雙特異性抗體通過兩個雜交瘤的融合產(chǎn)生，得到表達(dá)兩種不同抗體的重/輕鏈組合的雜交瘤細(xì)胞系。這可能導(dǎo)致兩種不同重鏈的配對，也可能導(dǎo)致相同重鏈的配對，引起單特異性親本抗體和雙特異性抗體的隨機(jī)混合物。雙特異性抗體含有重鏈和輕鏈并二聚以形成ig分子。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)，在提供治療hbv感染以及由hbv感染引起的病癥如肝硬化或肝細(xì)胞癌的替代或改進(jìn)的手段和方法中可以看到技術(shù)問題。在提供治愈hbv感染的方法中也可以看到待解決的技術(shù)問題。從細(xì)胞生物學(xué)的角度來說，在提供根除攜帶有hbvcccdna的細(xì)胞的手段和方法中可以看到技術(shù)問題。該技術(shù)問題由所附的權(quán)利要求解決。

因此，本發(fā)明在第一方面涉及包含至少三種結(jié)合特異性的結(jié)合分子，其中(a)第一特異性是針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的乙型肝炎病毒(hbv)表面抗原；(b)(i)第二和第三特異性分別針對cd3和cd28；或(ii)第二和第三特異性是選自針對cd16、cd56、nkp30、nkp46、4-1bb和nkg2d的特異性；(c)每種結(jié)合特異性由一個或更多個結(jié)合位點提供，每個結(jié)合位點由以下獨立地提供：(i)六個互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的組，其中所述六個cdr的組由三個cdr的第一組和三個cdr的第二組構(gòu)成，其中所述第一組和所述第二組各自被包含在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中；或(ii)三個cdr的組，其中所述三個cdr的組被包含在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中。

“hbv表面抗原”也縮寫為“hbs”或“hbsag”。

根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的結(jié)合能力通過使用術(shù)語“結(jié)合特異性”在功能上限定。提供所述結(jié)合特異性的結(jié)構(gòu)要素被稱為“結(jié)合位點”。關(guān)于每個所提及的特異性設(shè)想的是在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子中存在提供給定特異性的一個或多個結(jié)合位點。如果根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子中通過多于一個結(jié)合位點實現(xiàn)給定結(jié)合特異性，則應(yīng)理解，優(yōu)選的是實現(xiàn)給定結(jié)合特異性的結(jié)合位點在結(jié)構(gòu)和功能方面上是相同的，功能是識別待結(jié)合的抗原的給定表位。然而這并不排除其中給定結(jié)合特異性由多個結(jié)合位點實現(xiàn)的實施方案，所述結(jié)合位點雖然與相同的抗原結(jié)合，但經(jīng)由抗原的不同表位來結(jié)合。這通常還需要結(jié)合位點之間的結(jié)構(gòu)差異，盡管如此，總體而言，它們都具有結(jié)合相同抗原的能力。

根據(jù)提供給定特異性的結(jié)合位點的精確數(shù)目，示例性數(shù)目是1、2、3和4個，優(yōu)選2個，可以很好地調(diào)整或優(yōu)化整體結(jié)合性質(zhì)。通常，通過增加提供給定特異性的結(jié)合位點的數(shù)目，可以改善結(jié)合動力學(xué)以及結(jié)合熱力學(xué)。

結(jié)合位點的總數(shù)在本領(lǐng)域中也稱為“價”。因此，雖然對于三特異性的結(jié)合分子需要至少是三價的，但應(yīng)理解根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子也可以是四價、五價、六價、七價或八價的。還設(shè)想更高的價。預(yù)期還通過使用九價、十價的結(jié)合分子或具有更高價數(shù)的結(jié)合分子實現(xiàn)攜帶hbvcccdna的細(xì)胞的根除。

對于將是至少三特異性的結(jié)合分子，每種結(jié)合特異性恰好由一個結(jié)合位點表示就足夠了。因此，根據(jù)本發(fā)明的三特異性結(jié)合分子可以是三價分子。一般而言，優(yōu)選的是其中一個、兩個或三個結(jié)合特異性各自用兩個結(jié)合位點實現(xiàn)的那些三特異性分子。還優(yōu)選的是其中一個、兩個或三個結(jié)合特異性各自用三個結(jié)合位點實現(xiàn)的那些三特異性分子。

三種結(jié)合特異性也可以各自由不同數(shù)目的結(jié)合位點實現(xiàn)。可以優(yōu)選的是一種結(jié)合特異性由比另外兩種結(jié)合特異性更多的結(jié)合位點表示，或者兩種結(jié)合特異性可以由比第三種結(jié)合特異性更多的結(jié)合位點表示。

根據(jù)第一方面的(c)(i)項明顯的是，六個cdr的組是給定結(jié)合位點的優(yōu)選實施方案。如本領(lǐng)域眾所周知的，六個cdr的組包含第一組和第二組，每組由三個cdr構(gòu)成。三個cdr的這兩組可以位于同一多肽鏈上或不同的多肽鏈上，從而產(chǎn)生不同的分子結(jié)構(gòu)。另外，設(shè)想在根據(jù)本發(fā)明的給定結(jié)合分子內(nèi)，部分結(jié)合位點是這樣的：構(gòu)成給定結(jié)合位點的全部六個cdr位于單個多肽鏈上，而其他結(jié)合位點是這樣的：構(gòu)成給定結(jié)合位點的第一組的和第二組的三個cdr位于不同的多肽上。不同的多肽可以僅僅是形式上不同的，在其他方面是相同的，尤其是對于氨基酸序列?；蛘?，不同的多肽在其氨基酸序列方面可以是彼此不同的。

一般而言，根據(jù)以下優(yōu)選實施方案的討論也會明顯的是，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子可以僅表現(xiàn)出由一條多肽形成的結(jié)合位點。然而，應(yīng)理解這并不等于要求結(jié)合分子作為整體由單個多肽鏈構(gòu)成。另一方面，本發(fā)明擴(kuò)展至其中全部結(jié)合位點由兩條多肽鏈形成的結(jié)合分子。類似地，后者的敘述并不等于要求結(jié)合分子作為整體僅由兩條多肽鏈構(gòu)成。相反，結(jié)合分子也可以由多于兩條多肽鏈，例如三條或四條或多于四條多肽鏈構(gòu)成。最后，如上所述，并且如由以下結(jié)構(gòu)(iii)舉例說明的，本發(fā)明的結(jié)合分子包含的結(jié)合位點的一部分可以是這樣的：它們中的每一個由兩條多肽鏈形成，而結(jié)合位點的其余部分是這樣的：它由單個多肽鏈形成。

關(guān)于項(b)(ii)，應(yīng)理解第二和第三特異性彼此不同，從而提供至少三特異性的結(jié)合分子。

如果考慮到(c)(i)項，根據(jù)六個cdr的要求可知，需要兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以形成單個結(jié)合位點。這不同于(c)(ii)項，其中單個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域足以提供結(jié)合位點，在這種情況下結(jié)合位點由三個cdr構(gòu)成。這也被稱為單域結(jié)合位點。

術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”，縮寫為“cdr”，具有如本領(lǐng)域所確定的含義。這些是短的子序列，通常約3至約25個氨基酸，其賦予抗體特異性識別抗原表位的能力。通常，抗體輕鏈可變區(qū)提供三個cdr，抗體重鏈可變區(qū)提供三個cdr。如果沒有不同規(guī)定，限定結(jié)合位點的六個cdr通常按以下順序存在：重鏈cdr1、重鏈cdr2、重鏈cdr3、輕鏈cdr1、輕鏈cdr2、輕鏈cdr3。雖然cdr通常是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分，但根據(jù)本發(fā)明在這方面無要求。包含所述cdr的氨基酸序列就足夠了，條件是所述氨基酸序列在生理條件下折疊時以空間接近的方式呈現(xiàn)所述cdr并保持其識別同源抗原的能力。提及的空間接近和抗原結(jié)合的能力也可以被稱為“配置為結(jié)合抗原”。術(shù)語“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”是本領(lǐng)域已知的，并且是指具有7至9個反平行β-鏈的2層夾心三維結(jié)構(gòu)的通常為70至100個氨基酸的序列。在限定一些實施方案的結(jié)構(gòu)以及圖中，單個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域用橢圓形描繪。

六個cdr的組通常限定結(jié)合位點。在替代方案中，如從駱駝科和軟骨魚類抗體中已知的，三個cdr的組(cdr1、cdr2、cdr3)可以限定結(jié)合位點。如本領(lǐng)域已知的，盡管沒有要求，但是優(yōu)選三個cdr的這種組，其中cdr3由比在天然存在的免疫球蛋白可變區(qū)中更突出的肽環(huán)組成。

術(shù)語“抗原”具有其本領(lǐng)域確定的含義。它是指被通常由免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)的六個cdr的組特異性地識別和結(jié)合的分子。被所述cdr識別和結(jié)合的抗原的特定部分也稱為表位。

hbv小/中/大表面蛋白是hbv外包膜中的小表面蛋白、中表面蛋白、大表面蛋白(stibbe,w.,和w.h.gerlich，structuralrelationshipsbetweenminorandmajorproteinsofhepatitisbsurfaceantigen.j.virol.198346：626-628)。

三種hbv表面抗原從一個開放閱讀框轉(zhuǎn)錄和翻譯，并且彼此在n末端部分的長度上不同。因此，大表面抗原包含在中表面抗原和小表面抗原中都不存在的部分，而中表面抗原包含大抗原中包含但小抗原中不包含的部分。小抗原由包含在中抗原和大抗原的c末端部分的序列組成。

大hbv表面抗原可以以兩種方式插入細(xì)胞質(zhì)膜中。n末端或c末端可以位于細(xì)胞外側(cè)。兩種構(gòu)型都在hbv感染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。換言之，大hbv表面抗原的n末端可以位于er膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)或腔側(cè)，最終也可以以這些構(gòu)型存在于hbv顆粒的外包膜和受感染肝細(xì)胞的質(zhì)膜中。

出人意料地，將根據(jù)(b)的第二和第三特異性組合到三特異性分子中提供比兩種雙特異性分子的組合顯著更強(qiáng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化。參考實施例。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，提供對hbv表面抗原的結(jié)合特異性的結(jié)合位點結(jié)合位于(a)所述hbv小表面抗原中的表位；或(b)所述hbv小表面抗原中不包含的所述hbv大表面抗原的那部分中的表位；或(c)部分所述hbv大表面抗原中的表位，該部分與所述hbv小表面抗原在結(jié)構(gòu)上不同。

(a)項是指存在于hbv小表面抗原中的表位。由于上述hbv小表面抗原、hbv中表面抗原、hbv大表面抗原之間的關(guān)系，小抗原的整個序列被包含在中抗原和大抗原中。通常，但并非必然地，由小表面抗原呈現(xiàn)的三維表位也會由中表面抗原和/或大表面抗原呈現(xiàn)。

根據(jù)(b)項，優(yōu)選所述hbv大表面抗原的所述部分也不被所述hbv中表面抗原所包含。關(guān)于(c)項，應(yīng)理解，“結(jié)構(gòu)上不同”包括所述hbv大表面抗原的表位，其包含或由所述hbv小表面抗原序列的一部分組成，其中所述表位不存在于所述hbv小表面抗原上。根據(jù)(c)項，更優(yōu)選的是所述表位是在所述hbv大表面抗原的一部分中，該部分與所述hbv中表面抗原在結(jié)構(gòu)上也不同。

所述(a)項，結(jié)合本發(fā)明的所有方面和實施方案，特別優(yōu)選的是所述第一抗原為所述hbv小表面抗原。

根據(jù)(b)和(c)項，多肽或結(jié)合分子會分別特異性識別hbv的大表面抗原。

第二和第三特異性針對由免疫效應(yīng)細(xì)胞呈遞、優(yōu)選由nk細(xì)胞和/或ctl特異性地呈遞的表面抗原。免疫效應(yīng)細(xì)胞是對hbv感染細(xì)胞重定向的細(xì)胞，所述hbv感染細(xì)胞在其表面上呈現(xiàn)所述hbv表面抗原。

特別優(yōu)選的是第二和第三特異性都針對ctl，或都針對nk細(xì)胞。

cd3(分化群3)t細(xì)胞共受體是蛋白質(zhì)復(fù)合物，其由四條不同的鏈組成。在哺乳動物中，復(fù)合物含有cd3γ鏈、cd3δ鏈和兩個cd3ε鏈。結(jié)合特異性可以針對這些鏈中的任何一個。這些鏈與被稱為t細(xì)胞受體(tcr)和δ鏈的分子締合以在t淋巴細(xì)胞中產(chǎn)生活化信號。tcr、δ鏈和cd3分子一起構(gòu)成了tcr復(fù)合物。

在優(yōu)選的實施方案中，cd3代表cd3ε鏈，其為cd3-t細(xì)胞受體復(fù)合物的一部分。(borst,j.等人，thedelta-andepsilon-chainsofthehumant3/t-cellreceptorcomplexaredistinctpolypeptides.nature.1984.312：455-458)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的cd3的結(jié)合特異性是針對所述cd3ε鏈的。

cd28是主要的t細(xì)胞共刺激受體。(lesslauer,w.等人，t90/44(9.3抗原)。acellsurfacemoleculewithafunctioninhumantcellactivation.eur.j.immunol.1986.16：1289-1296)。

4-1bb(cd137)是活化的t細(xì)胞和nk細(xì)胞的共刺激受體。(kwon,b.s.等人，cdnasequencesoftwoinduciblet-cellgenes.proc.natl.acad.sci.u.s.a.1989.86：1963-1967)。

cd16(fcγriiia)是低親和力fc受體，其由nk細(xì)胞、活化的細(xì)胞毒性t細(xì)胞的亞群以及來自髓單核細(xì)胞系的細(xì)胞類型表達(dá)，與igg分子的fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合。(lanier,l.l.等人，functionalpropertiesofauniquesubsetofcytotoxiccd3+tlymphocytesthatexpressfcreceptorsforigg(cd16/leu-11antigen).j.exp.med.1985,162：2089-2106)。

cd56(ncam)是由nk細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞黏附分子。(lanier，l.l.等人，identityofleu-19(cd56)leukocytedifferentiationantigenandneuralcelladhesionmolecule.j.exp.med.1989.169：2233-2238)。

nkg2d是由nk細(xì)胞表達(dá)的活化性受體(houchins，j.等人，dnasequenceanalysisofnkg2,afamilyofrelatedcdnaclonesencodingtypeiiintegralmembraneproteinsonhumannaturalkillercells.1991.j.exp.med.173：1017-1020)。

nkp30(ncr3)是由nk細(xì)胞表達(dá)的活化性受體(pende,d.等人，identificationandmolecularcharacterizationofnkp30,anoveltriggeringreceptorinvolvedinnaturalcytotoxicitymediatedbyhumannaturalkillercells.2000.j.exp.med.192：337-346)。

nkp46(ncr1)是由nk細(xì)胞表達(dá)的活化性受體(pessino等人，molecularcloningofnkp46:anovelmemberoftheimmunoglobulinsuperfamilyinvolvedintriggeringofnaturalcytotoxicity.1998.j.exp.med.188：953-960)。

cd3、cd28和4-1bb存在于ctl的表面上。本發(fā)明的多肽與這些表面抗原中任何一種的結(jié)合引起ctl的刺激或共刺激。

cd16、cd56、nkg2d、nkp30、nkp46和4-1bb存在于nk細(xì)胞的表面上。本發(fā)明的多肽與這些表面抗原中任何一種的結(jié)合引起nk細(xì)胞的刺激或共刺激。

對于人類ctls，優(yōu)選cd3和cd28。對于人類nk細(xì)胞，優(yōu)選cd16和cd56。

所提及的表面抗原以本領(lǐng)域確定的名稱命名(還參見kennethmurphy，janeway'simmunobiology，第7版，garlandscience；williame.paul，fundamentalimmunology，第7版，lippincottwilliams&wilkins)。

特別優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合、特別是cdr和抗原之間的結(jié)合是特異性的。如根據(jù)本發(fā)明所使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”(具有與“特異性相互作用”相同的含義)指這些結(jié)合部分不與或基本上不與跟目標(biāo)抗原結(jié)構(gòu)相似的表位或結(jié)構(gòu)交叉反應(yīng)。正在研究的一組分子的交叉反應(yīng)性可以例如通過評估所述分子組在常規(guī)條件下與感興趣的表位以及一些或多或少(結(jié)構(gòu)和/或功能上)密切相關(guān)的表位的結(jié)合來測試。只有與感興趣的表位在其相關(guān)情況下(例如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的特定模序)結(jié)合，但與任何其他表位不結(jié)合或基本上不結(jié)合的那些分子才被認(rèn)為對感興趣的表位是特異性的。

慢性hbv感染的特征在于免疫耐受狀態(tài)。更具體地，患者的ctl和nk細(xì)胞是這樣運行的：不發(fā)生受感染細(xì)胞的完全根除或hbv復(fù)制的完全控制或hbv的完全消除。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子一方面特異性地識別hbv表面抗原，另一方面特異性地識別免疫效應(yīng)細(xì)胞表面抗原。本發(fā)明的結(jié)合分子可被認(rèn)為賦予免疫效應(yīng)細(xì)胞人工特異性。事實上，本發(fā)明的結(jié)合分子使ctl和nk細(xì)胞重新靶向，如此使得它們被募集至hbv感染細(xì)胞并殺傷它們。

一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子與hbv感染細(xì)胞的結(jié)合以及另一方面免疫效應(yīng)細(xì)胞的募集可以以任何順序發(fā)生或同時發(fā)生。

特別地，旨在通過注射或作為口服施用形式全身地施用本發(fā)明的結(jié)合分子，并允許它們結(jié)合受hbv感染或表達(dá)hbv抗原的靶細(xì)胞并將所述免疫效應(yīng)細(xì)胞募集至所述靶細(xì)胞。

雖然這樣說，但還設(shè)想使本發(fā)明的結(jié)合分子與免疫效應(yīng)細(xì)胞(或包含所述效應(yīng)細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞群)接觸，如此使得所述效應(yīng)細(xì)胞負(fù)載有所述結(jié)合分子。已經(jīng)在體外或離體進(jìn)行了負(fù)載的這種效應(yīng)細(xì)胞(或包含這種經(jīng)負(fù)載的效應(yīng)細(xì)胞的pbmc群)然后可以施用于患有hbv感染或與之相關(guān)的和以下定義的病癥的患者。這種施用可以是血管內(nèi)施用，例如施用至肝動脈。具有根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的免疫效應(yīng)細(xì)胞與所述免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面抗原結(jié)合也是本發(fā)明的一個方面。下文進(jìn)一步公開該方面。

這種殺傷，特別是與免疫細(xì)胞分泌的抗病毒免疫介質(zhì)(例如細(xì)胞因子)結(jié)合的殺傷提供hbv感染的根除或hbv感染的持續(xù)控制或表達(dá)hbv表面抗原的腫瘤細(xì)胞的消除。

本發(fā)明的結(jié)合分子性能的優(yōu)選測量包括細(xì)胞培養(yǎng)物中t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、t細(xì)胞至肝臟的募集、肝臟的炎癥反應(yīng)、血清中病毒滴度的降低、血清中病毒抗原h(huán)bsag和/或hbeag的減少、肝臟中病毒復(fù)制的減少、受感染細(xì)胞的數(shù)量的減少。

這些性質(zhì)中的每一個可以通過本領(lǐng)域確定的流程來測量。

為了進(jìn)一步解釋，t細(xì)胞至肝臟的募集可以通過經(jīng)由rt-pcr確定在肝臟中一種或更多種t細(xì)胞標(biāo)記基因mrna，特別是cd3、cd4、cd8、ifnγ和ip-10(cxcl10)的水平來定量。根據(jù)本發(fā)明，這些標(biāo)記基因的誘導(dǎo)與陰性對照相比被顯著地誘導(dǎo)，并且可以達(dá)到2倍至1000倍或以上的誘導(dǎo)，優(yōu)選大于2倍、優(yōu)選大于5倍、優(yōu)選大于10倍、優(yōu)選大于25倍、優(yōu)選大于50倍、優(yōu)選大于100倍、優(yōu)選大于500倍、優(yōu)選大于750倍、優(yōu)選大于1000倍。

根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞培養(yǎng)物中t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性為5％至100％、優(yōu)選大于5％、優(yōu)選大于10％、優(yōu)選大于20％、優(yōu)選大于30％、優(yōu)選大于40％、優(yōu)選大于50％、優(yōu)選大于75％、優(yōu)選100％。

體內(nèi)t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性可以例如通過測量被消除的肝細(xì)胞釋放的肝轉(zhuǎn)氨酶(優(yōu)選丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)和/或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast))來評估。個體中正常的alt水平低于40國際單位每升(u/l)，并且通過免疫效應(yīng)細(xì)胞的重新靶向在有效的細(xì)胞毒性時可以達(dá)到50u/l至5000u/l的水平。優(yōu)選地，水平會是大于50u/l、優(yōu)選大于100u/l、優(yōu)選大于200u/l、優(yōu)選大于300u/l、優(yōu)選大于400u/l、優(yōu)選大于500u/l、優(yōu)選大于750u/l、優(yōu)選大于1000u/l。

根據(jù)本發(fā)明，可以通過he染色的方式確定肝臟的炎癥反應(yīng)。he代表蘇木精和曙紅，并且是病理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)染色技術(shù)，其使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)以藍(lán)色、紫色、粉紅色和橙色的陰影顯示。利用該方法，與陰性對照比較可以看到浸潤的免疫效應(yīng)細(xì)胞并進(jìn)行定量，并且根據(jù)本發(fā)明，與未經(jīng)處理的對照相比數(shù)量會增加5倍至5000倍、優(yōu)選大于5倍、優(yōu)選大于10倍、優(yōu)選大于20倍、優(yōu)選大于50倍、優(yōu)選大于100倍、優(yōu)選大于250倍、優(yōu)選大于500倍、優(yōu)選大于1000倍。

從肝臟采集的活組織檢查的cd3染色和/或本發(fā)明的三特異性結(jié)合分子的染色分別顯示t細(xì)胞和重定向t細(xì)胞的特異性浸潤。利用該方法，與陰性對照相比，可以看到重定向的cd3+t細(xì)胞并進(jìn)行定量，并且根據(jù)本發(fā)明，與未經(jīng)處理的對照相比數(shù)量會增加5倍至5000倍、優(yōu)選大于5倍、優(yōu)選大于10倍、優(yōu)選大于20倍、優(yōu)選大于50倍、優(yōu)選大于100倍、優(yōu)選大于250倍、優(yōu)選大于500倍、優(yōu)選大于1000倍。

在血清或肝組織樣品上通過使用pcr和/或southern印跡法可以定量病毒復(fù)制。本發(fā)明的結(jié)合分子應(yīng)用于hbv感染的對象引起血清中病毒滴度的降低。根據(jù)本發(fā)明，設(shè)想在施用有效量的結(jié)合分子后，實現(xiàn)血清中病毒滴度減少大于10％、優(yōu)選大于20％、優(yōu)選大于30％、優(yōu)選大于40％、優(yōu)選大于50％、優(yōu)選大于60％、優(yōu)選大于70％、優(yōu)選大于80％、優(yōu)選大于90％，優(yōu)選低于檢測水平(每毫升50個hbvdna拷貝)。例如，血清hbvdna在hbv轉(zhuǎn)基因小鼠中達(dá)到最高每毫升10⁹個拷貝的水平，并且在用重定向的t細(xì)胞處理后可以降低至每毫升10⁷個拷貝(krebs等人，tcellsexpressingachimericantigenreceptorthatbindshepatitisbvirusenvelopeproteinscontrolvirusreplicationinmice.gastroenterology(2013))。

通過針對hbeag、hbcag或hbsag的染色肝切片，可以確定仍受感染的細(xì)胞數(shù)量。與未經(jīng)處理的對照相比，根據(jù)本發(fā)明的hbv復(fù)制細(xì)胞的減少為最小5％至最大100％、優(yōu)選大于5％、優(yōu)選大于10％、優(yōu)選大于20％、優(yōu)選大于30％、優(yōu)選大于50％、優(yōu)選大于70％、優(yōu)選大于90％、優(yōu)選100％。

“病毒滴度”(也稱為病毒載量、病毒負(fù)載量)是本領(lǐng)域眾所周知的術(shù)語，其指示給定生物樣品中病毒的量。病毒的量由各種量度指示，包括但不限于病毒核酸的量、病毒顆粒(如通過沉降梯度離心確定的完整病毒體)和亞病毒顆粒(例如通過免疫測定如elisa確定的hbsag或乙型肝炎表面抗原顆粒)的存在。通常，對于液體樣品例如血液和尿液，確定每單位液體，例如每毫升的病毒量。對于固體樣品例如組織樣品，確定每重量單位、例如每克的病毒量。用于確定病毒的量的方法是本領(lǐng)域已知的。目前，例如可用于乙型肝炎病毒的常規(guī)測試是例如病毒載量、定性和定量hbsag和hbeag測量。

“有效量”是指足以實現(xiàn)上述目的的試劑的量。具體地，根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的量在待治療的受乙型肝炎病毒感染的對象中減少病毒滴度水平是有效的。有效量可以以一次或更多次施用來施用。有效量可以根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用(體外或體內(nèi))或被治療的對象和疾病病癥，例如對象的體重和年齡、疾病病癥的嚴(yán)重程度、施用方式等變化，這可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。

例如有許多不同的使用核酸測試(nat)來定量病毒載量的基于分子的測試方法。用于擴(kuò)增的起始材料可以用于將這些分子方法分成組。體外dna合成的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)方法使用dna模板、聚合酶、緩沖液、引物和核苷酸來使血液樣品中的hiv擴(kuò)增。然后化學(xué)反應(yīng)標(biāo)記病毒。測量標(biāo)記物并用于計算病毒的量。pcr用于定量整合的dna。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)是可用于定量病毒轉(zhuǎn)錄物的pcr的變化方案。使用rna作為該方法的起始物質(zhì)，并使用酶逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)將其轉(zhuǎn)化為雙鏈dna。

慢性乙型肝炎的治療目標(biāo)是hbv感染的“功能性”治療，這是利用目前可用的抗病毒劑沒有實現(xiàn)的。如上進(jìn)一步指出的，功能性治療的主要障礙是hbvcccdna的復(fù)雜的穩(wěn)定性和功能障礙的抗hbv免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的情況下，hbv的功能性治療意味著每毫升的hbv基因組的數(shù)量低于100000、優(yōu)選低于10000、更優(yōu)選低于1000、100或10。特別優(yōu)選的是完全根除或減少到低于檢測極限。

鑒于根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子為免疫效應(yīng)細(xì)胞提供定制的特異性，免疫效應(yīng)細(xì)胞的天然固有特異性或抗原呈遞對于它們變得不相關(guān)。因此，大量候選效應(yīng)細(xì)胞可以被重新靶向。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子具有至少與單克隆抗體的生物利用度和半衰期相當(dāng)?shù)纳锢枚群桶胨テ凇?/p>

在第一方面的優(yōu)選實施方案中，所述至少三種結(jié)合特異性為(a)三種特異性；或(b)四種特異性，其中第四特異性針對肝細(xì)胞。

優(yōu)選地，結(jié)合分子是三特異性結(jié)合分子。換言之，存在恰好三種結(jié)合特異性。存在第四特異性的替代方案對于靶向某些細(xì)胞，特別是靶向肝細(xì)胞可以是有利的。在這方面，肝細(xì)胞上的優(yōu)選標(biāo)記物是ntcp。ntcp在本領(lǐng)域中稱為hbv進(jìn)入介導(dǎo)受體。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述分子是(a)多肽的多聚體；或(b)多肽。應(yīng)理解，該優(yōu)選實施方案的(b)項限定了由單個多肽構(gòu)成的結(jié)合分子。

術(shù)語“多肽”定義了為氨基酸縮聚物的分子，所述氨基酸形成一條具有一個n末端和一個c末端的單鏈。組成氨基酸包括20種天然存在的蛋白氨基酸。優(yōu)選地，所述多肽僅由所述天然存在的蛋白氨基酸組成。話雖如此，該術(shù)語擴(kuò)展至除了所述天然存在的蛋白氨基酸之外還含有最高20％、10％、5％、2％或1％的氨基酸所述氨基酸選自非天然存在的α-氨基酸、β-氨基酸、d-氨基酸、硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、羥脯氨酸、吡咯賴氨酸和鳥氨酸。還應(yīng)理解，可以磷酸化一個或更多個例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸。磷酸化特別適用于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。還可以存在本領(lǐng)域已知的其它翻譯后修飾，包括糖基化。糖基化包括n-連接的糖基化，典型的為在天冬酰胺上的n-連接的糖基化，和o-連接的糖基化，典型的為在絲氨酸或蘇氨酸殘基上的o-連接的糖基化。n-末端和/或c-末端可以被保護(hù)，保護(hù)基團(tuán)包括用于n-末端的乙?；陀糜赾-末端的胺。所述多肽中包含的氨基酸之間的連接類型限于酰胺(conh)鍵。術(shù)語“酰胺鍵”包括將給定氨基酸的α-羧酸酯與后續(xù)氨基酸的α-氨基連接的肽鍵?！磅０锋I”也擴(kuò)展至異肽鍵，其是不存在于多肽主鏈上的酰胺鍵。例如，代替α-氨基，可以涉及賴氨酸的側(cè)鏈氨基。類似地，代替α-羧基，可以涉及谷氨酸或天冬氨酸的側(cè)鏈羧酸酯。設(shè)想出現(xiàn)一個或更多個例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個異肽鍵。然而，優(yōu)選其中組成氨基酸僅通過肽鍵彼此連接的多肽。

通常，多肽中的氨基酸數(shù)量沒有上限。從序列表中包含的示例性多肽序列可以看出，本發(fā)明的多肽通常含有數(shù)百個氨基酸，優(yōu)選250至1000個、400至900個，或700至800個氨基酸。區(qū)分一方面的肽和另一方面的多肽是常見的，其中肽具有30個或更少的氨基酸，多肽具有多于30個氨基酸。

根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“多聚體”包括二聚體、三聚體、四聚體、五聚物、六聚體、七聚體和八聚體。

在最廣泛的形式中，關(guān)于至少三種所需特異性在多聚體的各個組成多肽上的位置沒有限制。而可以想到的是使用組成多肽，其中每個多肽提供恰好一種結(jié)合特異性-由一個、兩個、三個、四個或更多個結(jié)合位點實現(xiàn)-優(yōu)選多聚體，其中每個組成多肽具有兩種或三種特異性，尤其優(yōu)選具有兩種特異性的組成多肽。

就優(yōu)選為三特異性的結(jié)合分子的本發(fā)明的結(jié)合分子而言，其為多肽的多聚體，優(yōu)選二聚體或四聚體，優(yōu)選的是(a)每個多肽是雙特異性多肽；或(b)每個多肽獨自地選自單特異性多肽、雙特異性多肽和三特異性多肽。

毫無疑問，該優(yōu)選實施方案僅涵蓋也符合本發(fā)明的第一方面的最寬限定的構(gòu)造。例如，兩個單特異性多肽的二聚體不符合“三特異性”的要求，因此不被該優(yōu)選實施方案所包含。

根據(jù)以上解釋的在一方面的結(jié)合特異性和另一方面的結(jié)合位點之間的區(qū)別，應(yīng)理解，單特異性多肽可以是一價的、二價的、三價的、四價的或可以含有甚至大于四價。類似地，雙特異性多肽可以是二價的、三價的、四價的或含有大于四價。最后，三特異性多肽可以是三價的、四價的或含有大于四價。如上所指出的，結(jié)合位點可以由位于同一多肽上的兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域提供，也可以由位于不同多肽上的兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域提供。因此，在根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子是多肽的多聚體的那些情況下，結(jié)合分子的價數(shù)可以超過所有組成多肽合起來的價數(shù)。結(jié)合分子的總價數(shù)與由所有組成多肽提供的累積價數(shù)之間的差異是由位于不同多肽鏈上的兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域所形成的那些結(jié)合位點的數(shù)目。

使用以下進(jìn)一步公開的結(jié)構(gòu)(iii)作為實例，該分子中的結(jié)合位點總數(shù)為5，其中4個是由成對的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形成，其中每一對位于單個多肽鏈上，一個結(jié)合位點是由位于不同多肽鏈上的一對免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形成。結(jié)構(gòu)(iii)中多肽的總數(shù)為2。

就多聚化或寡聚化的機(jī)理而言，應(yīng)注意多肽可以共價地和/或非共價地連接在一起。例如，如果結(jié)合分子是兩個多肽的二聚體，則所述多肽可以僅通過一個或更多個共價鍵連接在一起，所述共價鍵優(yōu)選為二硫鍵?；蛘撸瑑蓚€多肽可以僅通過非共價相互作用而連接。同樣可想到的是，兩個多肽通過共價和非共價相互作用彼此結(jié)合。類似地，并且考慮到更高階的多聚體，應(yīng)理解僅共價相互作用，僅非共價相互作用，或共價和非共價相互作用的組合都可以使多聚體結(jié)合在一起。共價和非共價相互作用的組合可以是這樣的：對于多聚體內(nèi)給定的二元相互作用，僅存在共價相互作用或僅存在非共價相互作用，或共價和非共價相互作用的組合。

術(shù)語“多聚化”和“寡聚化”(等同使用)包括二聚化。

如以下進(jìn)一步詳述的，在某些情況下，對于本發(fā)明某些優(yōu)選的結(jié)合分子，相對于非共價相互作用可以優(yōu)選共價相互作用，反之亦然。

就本發(fā)明涉及多聚體而言，組成多肽還包含二聚化或多聚化區(qū)域。所述二聚化或多聚化區(qū)域可以提供共價和/或非共價的二聚化或多聚化。

在特別優(yōu)選的實施方案中，連接本發(fā)明的兩個多肽的所述二聚化區(qū)域由igg重鏈的鉸鏈區(qū)組成或包含負(fù)責(zé)抗體重鏈二聚化的半胱氨酸殘基?？梢杂糜诙刍投嗑刍钠渌烊淮嬖诘亩蜴I是重鏈的第一恒定區(qū)與輕鏈的恒定區(qū)的各個c末端之間的二硫鍵。

優(yōu)選地，所述二聚化區(qū)域由長度為32個氨基酸的子序列，即所謂的重鏈的鉸鏈區(qū)(epkssdkthtcppcpapefegapsvflfppkp，參見seqidno：43至46)組成，并且包含負(fù)責(zé)重鏈二聚化的兩個半胱氨酸殘基(以上序列中加下劃線的)。優(yōu)選地，將介導(dǎo)天然抗體中igg重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)之間的分子間二硫鍵的igg重鏈鉸鏈區(qū)內(nèi)的單個半胱氨酸殘基突變成絲氨酸以防止異常的二硫鍵。

適合于非共價二聚化的二聚化結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域已知的，并且包括亮氨酸拉鏈(參見例如，dekruif和logtenberg，leucinezipperdimerizedbivalentandbispecificscfvantibodiesfromasemi-syntheticantibodyphagedisplaylibrary.j.biol.chem.1996,271：7630-7634)。觸發(fā)二聚化的另一個選擇是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之間天然存在的相互作用。這些相互作用例如在igg分子中在重鏈和輕鏈的可變區(qū)之間、在重鏈的第一恒定區(qū)和輕鏈的恒定區(qū)之間、在重鏈的各個第二恒定區(qū)和重鏈各個第三恒定區(qū)之間發(fā)生。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，組成多肽還包含間隔區(qū)，所述間隔區(qū)優(yōu)選包含ch2區(qū)和ch3區(qū)。在包含scfv片段的組成多肽的情況下，所述間隔區(qū)可以位于第一scfv片段和第二scfv片段之間。

包含或由ch2區(qū)和ch3區(qū)組成的間隔區(qū)，特別是來自igg的間隔區(qū)是有利的。優(yōu)點包括從產(chǎn)生的細(xì)胞有效分泌。此外，這種間隔區(qū)結(jié)合蛋白a的能力提供用于之后從試劑中純化的手段。

一方面所述ch2和ch3區(qū)和另一方面所述二聚化區(qū)都可以由igg，優(yōu)選igg1或igg2分子，甚至更優(yōu)選人類igg1或igg2(higg1，higg2)分子的相應(yīng)區(qū)提供。提供ch2區(qū)和ch3區(qū)的higg1分子的優(yōu)選子序列可見于seqidno：43至46中。seqidno：50和51的序列實現(xiàn)非共價二聚化的優(yōu)選實施方案，更具體地通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域來實施。優(yōu)選地—并且這適用于所提及的序列—higg1的部分，特別是所述ch2區(qū)在多個位置被誘變處理以減少與fc受體的結(jié)合(以下進(jìn)一步給出的序列中以加粗斜體指示)。更一般地，fc區(qū)，特別是ch2區(qū)和/或ch3區(qū)可以在一個或更多個位置突變以減少與fc受體的結(jié)合。這種方法是本領(lǐng)域已知的，并且例如在armour等人，recombinanthumaniggmoleculeslackingfcgammareceptoribindingandmonocytetriggeringactivities.eur.j.immunol.1999.29：2613-2624和shields等人，highresolutionmappingofthebindingsiteonhumanigg1forfcgammari,fcgammarii,fcgammariii,andfcrnanddesignofigg1variantswithimprovedbindingtothefcgammar.j.biol.chem.2001.276：6591-6604.)。這是有利的，因為根據(jù)本發(fā)明，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)的觸發(fā)是不優(yōu)選的。

換言之，抗體fc片段，優(yōu)選如上定義的經(jīng)修飾的抗體fc片段可以用于實現(xiàn)間隔區(qū)和二聚化區(qū)。術(shù)語“fc片段”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且定義為通過用木瓜蛋白酶切割獲得的igg片段并包含ch2和ch3區(qū)。

在所述第一scfv片段和所述間隔區(qū)之間和/或所述間隔區(qū)和所述第二scfv片段(a)之間可以存在連接序列。優(yōu)選的連接序列在上文中公開。從序列表中包含的優(yōu)選序列，特別是seqidno：43至46的序列可以看出，這樣的連接序列可以由甘氨酸或者甘氨酸和絲氨酸組成。

術(shù)語“ch2區(qū)”和“ch3區(qū)”具有其本領(lǐng)域確定的含義。它們指抗體重鏈的第二恒定區(qū)和第三恒定區(qū)。

轉(zhuǎn)向如所附的圖1和2中所示的優(yōu)選分子結(jié)構(gòu)，分別是二聚化和多聚化，優(yōu)選如下進(jìn)行。相同多肽鏈的同源二聚化，例如形式b、d、g、h、l、m和o，優(yōu)選通過形成人類igg1的鉸鏈域的分子間二硫鍵來實現(xiàn)。同樣適用于如形式c中不同氨基酸序列的多肽鏈的異源二聚化。在形式b和c中，ch2和ch3區(qū)通過非共價相互作用有助于二聚體的穩(wěn)定性。在形式g、h、n和o中cκ和ch1區(qū)之間天然存在的分子間二硫鍵作為共價機(jī)制與ch2和ch3區(qū)之間的非共價相互作用一樣有助于二聚化。這兩種機(jī)制的前者也有助于形式d、l和m中的二聚化。

為了具有不同氨基酸序列的多肽的異源二聚化，例如在形式a、e、f和k中，優(yōu)選上述亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，其也被稱為兩親性卷曲螺旋二聚化結(jié)構(gòu)域。這種二聚化結(jié)構(gòu)域的實例在dekruif和logtenberg，j.biol.chem.271，7630-7634(1996)和arndt等人，j.mol.biol.312,221-228(2001)中描述。在形式a和e中，ch2和ch3區(qū)有助于二聚化。在形式f中，人類igg1的ch2和ch3區(qū)之間的非共價相互作用以及cκ和ch1區(qū)之間的分子間二硫鍵有助于二聚化。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述多肽中的一個、更多個或所有由一種或更多種scfv分子組成或包含一種或更多種scfv分子。該實施方案擴(kuò)展至串聯(lián)scfv分子，也指向(scfv)2以及(scfv)3分子，例如結(jié)構(gòu)(vii)。

該優(yōu)選的實施方案限定本發(fā)明結(jié)合分子中所包含的多肽的優(yōu)選組成要素。多肽可以由那些優(yōu)選的組成分子組成或包含那些優(yōu)選的組成分子。例如，當(dāng)多肽會被用于提供單一結(jié)合特異性時，這可以通過使用由scfv分子組成的多肽來完成。在另一方面，當(dāng)要使用提供兩種結(jié)合特異性的多肽時，可以通過包含兩個scfv分子的多肽或由雙抗體來完成。

術(shù)語“scfv”在本領(lǐng)域是已確定的。該縮寫代表抗體的“單鏈可變片段”，并且定義能夠特異性識別和結(jié)合抗原表位的多肽。如上所指出的，三個cdr由抗體輕鏈可變區(qū)(vl)呈現(xiàn)，三個cdr由抗體重鏈可變區(qū)(vh)呈現(xiàn)。就vl和vh不共價連接來說，它們構(gòu)成fv片段。在另一方面，在scfv中，兩個可變區(qū)通過肽接頭彼此連接。獲得的融合構(gòu)建體是單個多肽鏈。這提供了scfv分子的容易表達(dá)。

術(shù)語“vh區(qū)”和“vl區(qū)”是本領(lǐng)域確定的。因此，它們分別指免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(vh)和免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)(vl)。通常，vh和vl區(qū)各自包含三個互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。

術(shù)語“雙抗體”、“三抗體”和“四抗體”在本領(lǐng)域中是已知的，并涉及含有兩個、三個或四個fv片段的單鏈構(gòu)建體。一般而言，雙抗體、三抗體和四抗體包含2條、3條或4條多肽鏈。這些可以彼此連接，如此獲得單個多肽鏈。重組抗體構(gòu)建體的綜述是little等人，immunologytoday，21，364-370(2000)。

肽接頭優(yōu)選用于連接scfv的可變區(qū)或?qū)cfv連接至二聚化區(qū)/多聚化區(qū)和/或間隔區(qū)或以下定義的fc。類似地，短的肽接頭可以用于雙抗體、三抗體和四體抗體的構(gòu)建，如上述綜述中所闡述的。

通常，肽接頭具有3至30個氨基酸，優(yōu)選5至25個或10至20個氨基酸的長度。優(yōu)選的是不干擾或基本不干擾它們所連接的結(jié)構(gòu)域或多肽(連接產(chǎn)生單個連續(xù)的多肽鏈)的結(jié)構(gòu)和/或功能的那些接頭。接頭包括富gly的接頭，例如在本發(fā)明的優(yōu)選多肽中用于連接ctl或nk特異性scfv的vh/vl區(qū)的(gly4ser)3(seqidno：47)接頭和yol接頭(seqidno：48；akttpkleegefsearv，如sellrie等人，journalofbiochemistryandmolecularbiology，第40卷，第6期，2007年11月，875-880頁所述的)，其在本發(fā)明的優(yōu)選多肽中用于連接對hbv表面抗原有特異性的scfv的vh/vl區(qū)。此外，(gly4ser)4接頭(seqidno：49)可以用于連接對hbv表面抗原有特異性的scfv的vh/vl區(qū)或本發(fā)明的結(jié)合分子的其他結(jié)構(gòu)單元。

在涉及為多肽的多聚體的那些結(jié)合分子的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，所述多聚體優(yōu)選為二聚體或四聚體，所述結(jié)合分子優(yōu)選為三特異性結(jié)合分子，一個、更多個或所有結(jié)合位點由兩個所述多肽一起提供。

以上已經(jīng)解釋了該優(yōu)選實施方案的結(jié)構(gòu)背景。特別地，該優(yōu)選實施方案提供了兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其提供構(gòu)成位于不同多肽鏈上的結(jié)合位點的兩組三個cdr。

在特別優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合分子包含fv片段；fab片段；二抗體；三抗體；四抗體；或免疫球蛋白g分子，其任選地具有經(jīng)修飾的fc部分。

使用的與該特別優(yōu)選的實施方案相關(guān)的術(shù)語具有其在本領(lǐng)域確定的意義。特別地，術(shù)語“fv片段”表示兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的非共價復(fù)合物，所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)。

從結(jié)構(gòu)的角度來看，fv片段包含在fab片段中，其中fab片段還包含抗體的輕鏈恒定區(qū)cl和重鏈第一恒定ch1區(qū)?？偠灾琭ab片段包含四個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，其中所述四個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中的兩個，即vl區(qū)和vh區(qū)一起形成結(jié)合位點。可以通過用木瓜蛋白酶切割從抗體獲得fab片段。

當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子在某一位置包含fv片段時，應(yīng)理解在該特定位置處，它沒有相鄰的輕鏈恒定區(qū)并且沒有相鄰的重鏈恒定區(qū)1，否則要注意的是在考慮的位置處會是fab片段。類似地，fab片段的要求排除了在所考慮的位置處存在ch2和ch3區(qū)。在本文中“相鄰的”是指在天然存在的抗體中發(fā)現(xiàn)的鄰近。

所述免疫球蛋白g分子的fc部分的修飾包括減少或消除與fc受體結(jié)合的修飾；見下文。

對于根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子，優(yōu)選的是完全沒有fc部分的結(jié)合分子。還優(yōu)選存在fc部分，其中所述fc部分是如上所述經(jīng)修飾的，或者另外地被修飾以使得fc部分不被n-糖基化。最后，也可以使用天然fc部分。

提供降低fc結(jié)合和/或減少補(bǔ)體活化的修飾是利用來自hlgg2或hlgg4的fc替代higg1衍生的fc。

本文所用的術(shù)語“抗體”具有其在本領(lǐng)域確定的含義。優(yōu)選地，抗體指單克隆抗體。單克隆抗體可以例如通過和milstein，nature256(1975)，495和galfré,meth.enzymol.73(1981),3中最初描述的技術(shù)來制備，其包括利用本領(lǐng)域研發(fā)的修飾將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與來自經(jīng)免疫的哺乳動物的脾細(xì)胞融合。此外，針對上述hbv表面蛋白的抗體或其片段可以通過使用例如harlow和lane在“antibodies,alaboratorymanual”，csh出版社，coldspringharbor，1988中所描述的方法來獲得。嵌合抗體的制備在例如wo89/09622中描述。根據(jù)本發(fā)明所使用抗體的另一來源是所謂的異種抗體。異種抗體如小鼠中的人類抗體的制備的一般原理在例如wo91/10741、wo94/02602、wo96/34096和wo96/33735中描述。根據(jù)本發(fā)明所采用的抗體或其相應(yīng)的免疫球蛋白鏈可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)，例如通過或單獨或組合地使用氨基酸刪除、插入、取代、添加和/或重組和/或本領(lǐng)域已知的任何其他修飾來進(jìn)一步修飾。用于在作為免疫球蛋白鏈的氨基酸序列的基礎(chǔ)的dna或多肽序列中引入這類修飾的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的；參見例如sambrook，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny，1989。多肽的修飾還包括翻譯后修飾如糖基化。

在涉及為多肽的多聚體并且其中每個多肽是雙特異性多肽的本發(fā)明的那些結(jié)合分子的優(yōu)選實施方案中，每個雙特異性多肽的第一特異性是根據(jù)第一方面所限定的第一特異性，每個多肽的第二特異性是針對cd3或cd28的。

因此，應(yīng)理解優(yōu)選的是，具有結(jié)合hbv表面抗原能力并且它們對ctl表面標(biāo)記物的特異性彼此不同的組成雙特異性多肽。

在這方面尤其優(yōu)選的結(jié)合分子是多肽的二聚體和四聚體。在由雙特異性二價多肽的二聚體組成的二聚體的組內(nèi)，優(yōu)選非共價二聚體。

尤其優(yōu)選的二聚體是結(jié)構(gòu)(i)、(ii)和(iii)的那些二聚體，尤其優(yōu)選的四聚體是結(jié)構(gòu)(iv)的四聚體：

“鏈a”和“鏈b”表示具有不同氨基酸序列的多肽?！版渁”和“鏈a'”表示具有相同氨基酸序列的不同多肽。在靠近每個結(jié)合位點處指示特異性。如本領(lǐng)域常見的，術(shù)語“抗”縮寫為“α”。

結(jié)構(gòu)(i)是由兩個雙特異性二價多肽組成的非共價二聚體。結(jié)構(gòu)(i)在圖1的“形式a”中示出。

結(jié)構(gòu)(ii)是兩個多肽的共價二聚體，其中表示為“鏈a”的多肽是雙特異性二價多肽，表示為“鏈b”的多肽是雙特異性三價多肽。結(jié)構(gòu)(ii)在圖1的“形式c”中示出。

我們注意到，結(jié)構(gòu)(iii)具有每個結(jié)合位點由兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域提供的四個結(jié)合位點，所述兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域位于相同的多肽鏈上，而第五個結(jié)合位點由位于不同多肽鏈上的兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形成。實施例包括本發(fā)明的結(jié)構(gòu)(iii)的結(jié)合分子的數(shù)據(jù)。

結(jié)構(gòu)(iv)在圖1的“形式d”中示出。實施例包括本發(fā)明的結(jié)構(gòu)(iv)的結(jié)合分子的數(shù)據(jù)。

在本發(fā)明的結(jié)合分子的進(jìn)一步優(yōu)選實施方案中，所述結(jié)合分子優(yōu)選為三特異性結(jié)合分子，每個多肽是三特異性結(jié)合分子。

換言之，每個組成多肽已經(jīng)包括根據(jù)本發(fā)明的第一方面的三種特異性。使用三特異性多肽的多聚體、優(yōu)選二聚體，可以微調(diào)或優(yōu)化結(jié)合特性。

在這方面尤其優(yōu)選的是相同多肽的二聚體，其最優(yōu)選具有結(jié)構(gòu)(v)：

結(jié)構(gòu)(v)在圖1的“形式b”中示出。

本發(fā)明還提供了其中結(jié)合位點僅由位于不同多肽鏈上的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形成的結(jié)合分子。實例是具有結(jié)構(gòu)(vi)的結(jié)合分子：

結(jié)構(gòu)(vi)是三抗體。結(jié)構(gòu)(vi)在圖2的“形式j(luò)”中示出。

為了提供具有結(jié)構(gòu)(vi)的結(jié)合分子的功能性，也可以采用不同的拓?fù)鋵W(xué)。因此，本發(fā)明在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中擴(kuò)展至具有結(jié)構(gòu)(vii)的結(jié)合分子：

結(jié)構(gòu)(vii)由一個多肽構(gòu)成。它實現(xiàn)了以上公開的(scfv)3結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)(vii)在圖2的“形式i”中示出。

圖1中描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。為了舉例說明，指示了抗原。應(yīng)理解，抗原不是根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合分子的一部分。根據(jù)本發(fā)明的其他分子結(jié)構(gòu)在圖2中示出。

上述第一特異性優(yōu)選由六個cdr的組提供，其中六個cdr的組優(yōu)選為seqidno：1至6、7至12或13至18。

針對cd3的本發(fā)明的結(jié)合分子的上文限定的第二特異性優(yōu)選由具有seqidno：19至24的序列的六個cdr的組提供。

針對cd28的本發(fā)明的結(jié)合分子的上文限定的第三特異性優(yōu)選由具有seqidno：25至30的序列的六個cdr的組提供。

就第二和第三特異性選自針對cd16、cd56、nkp30、nkp46、4-1bb和nkg2d的特異性而言，優(yōu)選的是第二特異性是針對cd16而第三特異性是針對cd56。優(yōu)選的相應(yīng)的6個cdr的組分別是seqidno：31至36和37至42的那些。

序列表中使用的c8、5f9、5a19、okt3、9.3、a9和ncam29.2表示各個cdr所來自的抗體，并且分別指優(yōu)選的抗hbs抗體、第二種不同的抗hbs抗體、針對hbv大表面抗原的抗體、針對人cd3的抗體、針對人cd28的抗體、針對人cd16的抗體和針對人cd56的抗體?！癶bs”表示hbv小表面抗原。

就使用雙特異性二價多肽而言，特別優(yōu)選的是所述多肽包含seqidno：43至46中任一項的氨基酸序列或由其組成或者包含顯示與seqidno：43至46中任一項至少80％一致性的氨基酸序列，條件是顯示80％一致性的所述氨基酸序列的cdr分別與包含在seqidno：43至46中任一項的那些一致。在seqidno：43中，最后三個殘基“gns”是非必要的。

序列一致性的優(yōu)選水平包括至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％。用于確定序列一致性的手段和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用于確定成對序列一致性的優(yōu)選算法是例如在mcginnis和madden(nucleicacidresearch32，w20-w25(2004))中所描述的基本局部比對搜索工具(blast)。

在給定序列中，在當(dāng)前情況下在seqidno：43至46的序列中，所述cdr的位置可以用本領(lǐng)域確定的方法確定，已知的本領(lǐng)域確定的方法分別包括chothia，kabat和lefranc/imgt的系統(tǒng)。在沒有任何相反指示的情況下，應(yīng)理解根據(jù)上文限定的特別優(yōu)選的實施方案的cdr是上文限定的那些，即具有seqidno：1至6、7至12或13至18的序列的第一組和具有seqidno：19至24、25至30、31至36或37至42的序列的第二組。從包含在所附序列表中的序列可以看出，這些特異性cdr序列(在下文還出現(xiàn)的序列中加下劃線)實際被包含在seqidno：43至46的序列中。

seqidno：1至6的序列限定cdr，seqidno：37至40限定能夠結(jié)合hbv的小表面抗原中的特異性表位的雙特異性二價多肽。該表位位于a-決定簇中，其分別暴露于受感染的細(xì)胞和病毒體的表面。術(shù)語“a-決定簇”用于表示hbv的小表面抗原中用于誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫應(yīng)答的主要表位所位于的區(qū)域。這些cdr以及seqidno：43至46的多肽具有可以用于所有hbv血清型的優(yōu)點。

在第二方面，本發(fā)明提供編碼構(gòu)成結(jié)合分子的多肽的一組核酸，該結(jié)合分子是多肽的多聚體。在替代方案中，所述第二方面涉及編碼為單個多肽的結(jié)合分子的核酸。多肽的優(yōu)選實施方案導(dǎo)致相應(yīng)的所述核酸的優(yōu)選實施方案。

術(shù)語“核酸”具有其在本領(lǐng)域確定的含義，并且沒有特別限制。優(yōu)選的是dna，例如基因組dna或cdna，以及rna，例如mrna。雖然不是優(yōu)選的，但還設(shè)想使用核苷酸衍生物，核苷酸衍生物包括2'衍生化的核苷酸，例如2'甲基核苷酸；如在肽核酸等中出現(xiàn)的肽核苷酸等。

在另一個方面，本發(fā)明提供了包含或由第一方面的一種或更多種結(jié)合分子和/或第二方面的一種或更多種核酸組成的藥物組合物。

藥物組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。合適的藥物載體、賦形劑和/或稀釋劑的實例是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳液，例如油/水乳液，各種類型的潤濕劑、無菌溶液等。包含這類載體的組合物可以用眾所周知的常規(guī)方法配制。這些藥物組合物可以以合適的劑量向?qū)ο笫┯?。合適的組合物的施用可以通過不同的方式實現(xiàn)，例如通過靜脈內(nèi)、皮下或口服施用，這三種選擇是優(yōu)選的，此外可以通過腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)施用。用于口服施用的制劑包括片劑和糖漿劑。特別優(yōu)選所述施用通過注射進(jìn)行。也可以將組合物直接施用于靶位點，例如通過向外部或內(nèi)部靶位點的基因槍遞送。劑量方案會由主治醫(yī)師和臨床因素確定。如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的，對于任何一個患者的劑量取決于許多因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用的時間和途徑、一般健康狀況和同時施用的其他藥物。蛋白質(zhì)藥學(xué)上的活性物質(zhì)可以以每劑量1ng/kg體重至10mg/kg體重的量存在；然而，預(yù)期低于或高于該示例性范圍的劑量，尤其是考慮到上述因素。如果方案是連續(xù)輸注，它應(yīng)該是每分鐘每公斤體重1μg至10mg單位。

特別優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。

在另一個方面，本發(fā)明提供在治療或預(yù)防hbv感染和/或由所述hbv感染引起的病癥的方法中使用的本發(fā)明的一種或更多種結(jié)合分子、核酸和/或藥物組合物，由所述hbv感染引起的所述病癥選自肝硬化、肝細(xì)胞癌和肝癌，所述肝癌的特征在于一種或更多種hbv表面抗原的表達(dá)。優(yōu)選的是，所述肝細(xì)胞癌的特征在于一種或更多種上文限定的hbv表面抗原的表達(dá)。

在另一個方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防hbv感染和/或由所述hbv感染引起的病癥的方法，由所述hbv感染引起的所述病癥選自肝硬化和肝細(xì)胞癌，所述方法包括向需要其的患者分別施用有效治療量或預(yù)防量的本發(fā)明的一種或更多種結(jié)合分子、核酸和/或藥物組合物。

在一個實施方案中，用于治療方法的所述藥物組合物、所述結(jié)合分子和/或核酸和所述治療方法分別是這樣的：所列舉的結(jié)合分子和/或核酸是所包含或使用的唯一藥物活性劑。

話雖如此，也慎重地設(shè)想在聯(lián)合治療中并入一種或更多種另外的藥物活性劑。這種另外的藥物活性劑可以選自干擾素或其他免疫調(diào)節(jié)劑(例如干擾素α2a或2b、干擾素λ)、直接起作用的抗病毒劑如核苷類似物(例如拉米夫定(epivir-hbv、zeffix或heptodin)、阿德福韋酯(hepsera、preveon)、恩替卡韋(baraclude、entaliv)、替比夫定(tyzeka、sebivo)、替諾福韋(viread))、進(jìn)入抑制劑(例如myrcludex-b)、其他抗病毒劑、或細(xì)胞因子如白介素-2。

因此，設(shè)想在所述藥物組合物中和根據(jù)用于治療方法的所述結(jié)合分子和所述治療方法，所列舉的結(jié)合分子和此外一種或更多種上文限定的特異性藥物活性劑是所包含或使用的唯一藥物活性劑。

或者，可以存在又一種藥物活性劑?？梢蕴砑釉鰪?qiáng)結(jié)合分子的穩(wěn)定性的另外成分或藥物活性劑，例如蛋白質(zhì)如牛奶蛋白、營養(yǎng)物質(zhì)或鹽溶液以增加生物利用度和/或半衰期。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種殺傷被hbv感染的細(xì)胞的體外方法，所述方法包括用(i)免疫效應(yīng)細(xì)胞和(ii)本發(fā)明的一種或更多種結(jié)合分子培養(yǎng)所述被hbv感染的細(xì)胞。

在體外方法的優(yōu)選實施方案中，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞(i)被包含在外周血單核細(xì)胞中；或(ii)是或包含nk細(xì)胞和/或ctl。

在另一個方面，本發(fā)明提供體外或離體免疫效應(yīng)細(xì)胞，其(a)具有與所述免疫效應(yīng)細(xì)胞的表面抗原結(jié)合的第一方面的結(jié)合分子；和/或(b)已經(jīng)用根據(jù)第二方面的一種或更多種核酸轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。優(yōu)選免疫效應(yīng)細(xì)胞和優(yōu)選的由免疫效應(yīng)細(xì)胞呈遞的表面抗原如上所定義。這種免疫效應(yīng)細(xì)胞可用于向患有hbv感染、肝硬化或肝細(xì)胞癌的患者施用。因此，還提供一種藥物組合物，其包含或由其表面抗原已經(jīng)與本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的免疫效應(yīng)細(xì)胞組成。還提供其表面抗原已經(jīng)與本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其用于治療或預(yù)防hbv感染、肝硬化或肝細(xì)胞癌的方法。

本發(fā)明擴(kuò)展至次優(yōu)選的某些實施方案，因此可以通過附帶條件的方式從較寬的實施方案中排除。

根據(jù)本發(fā)明次優(yōu)選的是由第一和第二多肽組成的三特異性四價結(jié)合分子，所述第一和第二多肽各自是雙特異性且二價的，其中任一多肽的第一特異性針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的hbv表面抗原，第二特異性分別針對cd3和cd28。

在這方面更加次優(yōu)選的是由第一和第二多肽組成的三特異性四價結(jié)合分子，所述第一和第二多肽各自是雙特異性且二價的，其中所述第一多肽和所述第二多肽彼此非共價地結(jié)合，并且其中任一多肽的第一特異性針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的hbv表面抗原；第二特異性分別針對cd3和cd28。

特別次優(yōu)選的是由第一和第二多肽組成的三特異性四價結(jié)合分子，所述第一多肽和第二多肽各自是雙特異性且二價的，其中所述第一多肽和所述第二多肽之間有至少一個共價鍵，優(yōu)選在所述第一多肽的cys殘基和所述第二多肽的cys殘基之間的至少一個二硫鍵，并且其中任一多肽的第一特異性針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大抗原的hbv表面抗原；第二特異性分別針對cd3和cd28。

尤其次優(yōu)選的是由第一和第二多肽組成的三特異性四價結(jié)合分子，所述第一和第二多肽各自是雙特異性且二價的，其中所述第一多肽和所述第二多肽之間有兩個二硫鍵，并且其中任一多肽的第一特異性針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的hbv表面抗原；第二特異性分別針對cd3和cd28。

關(guān)于每個以上限定的次優(yōu)選的實施方案，特別次優(yōu)選的是在第一和第二多肽上的結(jié)合位點由scfv片段提供。此外，關(guān)于任何前述次優(yōu)選的實施方案，特別次優(yōu)選的是在所述第一和第二多肽兩者中，在提供結(jié)合位點的兩個scfv片段之間有ch2區(qū)和ch3區(qū)。

因此，尤其次優(yōu)選的是由第一和第二多肽組成的三特異性四價結(jié)合分子，所述第一和第二多肽各自是雙特異性且二價的，其中所述第一多肽和所述第二多肽之間有兩個二硫鍵，其中任一多肽的第一特異性針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的hbv表面抗原；第二特異性分別針對cd3和cd28，其中在第一和第二多肽上的結(jié)合位點由scfv片段提供，并且其中在所述第一和第二多肽兩者中，在提供結(jié)合位點的兩個scfv片段之間有ch2區(qū)和ch3區(qū)。

因此，例如，本發(fā)明還提供了包含至少三種結(jié)合特異性的結(jié)合分子，其中(a)第一特異性針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的乙型肝炎病毒(hbv)表面抗原；(b)(i)第二和第三特異性分別針對cd3和cd28；或(ii)第二和第三特異性選自針對cd16、cd56、nkp30、nkp46、4-1bb和nkg2d的特異性；(c)每種結(jié)合特異性由一個或更多個結(jié)合位點提供，每個結(jié)合位點由以下獨立地提供：(i)六個互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的組，其中所述六個cdr的組由三個cdr的第一組和三個cdr的第二組組成，其中所述第一和第二組各自被包含在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中；或(ii)三個cdr的組，其中所述三個cdr的組被包含在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中；條件是三特異性四價結(jié)合分子由第一和第二多肽組成，所述第一和第二多肽各自是雙特異性且二價的，其中所述第一多肽和所述第二多肽之間有兩個二硫鍵，其中任一多肽的第一特異性針對選自hbv小表面抗原、hbv中表面抗原和hbv大表面抗原的hbv表面抗原，第二特異性分別針對cd3和cd28，其中第一和第二多肽上的結(jié)合位點由scfv片段提供，并且其中在所述第一和第二多肽中的兩者中，排除了提供結(jié)合位點的兩個scfv片段之間有ch2區(qū)和ch3區(qū)。

關(guān)于本說明書、特別是權(quán)利要求中描述的實施方案，其旨在將從屬權(quán)利要求中提及的每個實施方案與所述從屬權(quán)利要求引用的每個(獨立或從屬)權(quán)利要求的各個實施方案組合。例如，在獨立權(quán)利要求1描述3個替代方案a、b和c，從屬權(quán)利要求2描述3個替代方案d、e和f和從屬于權(quán)利要求1和2的權(quán)利要求3描述3個任選方案g、h和i的情況下，應(yīng)理解，該說明書明確地公開了對應(yīng)于以下組合的實施方案：a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i，除非另有明確說明。

類似地，并且在獨立權(quán)利要求和/或從屬權(quán)利要求中不描述替代方案的那些情況下，應(yīng)理解，如果從屬權(quán)利要求引用多個在前的權(quán)利要求，則認(rèn)為明確地公開了主題由此覆蓋的任何組合。例如，在獨立權(quán)利要求1、從屬權(quán)利要求2引用權(quán)利要求1，從屬權(quán)利要求3引用權(quán)利要求2和1兩者的情況下，由此認(rèn)為權(quán)利要求3和1的主題的組合被清楚地和明確地地公開，如權(quán)利要求3、2和1的主題組合一樣。在還存在引用權(quán)利要求1至3中任一項的從屬權(quán)利要求4的情況下，由此認(rèn)為權(quán)利要求4和1、權(quán)利要求4、2和1、權(quán)利要求4、3和1以及權(quán)利要求4、3、2和1的主題組合被清楚地和明確地公開。

在本申請中公開了序列：

seqidno1

c8hccdr1

glyphethrpheserglytyrala

seqidno2

c8hccdr2

ileserglyserglyglyserthr

seqidno3

c8hccdr3

alalysproproglyargglnglutyrtyrglyserseriletyrtyrpheproleuglyasn

seqidno4

c8lccdr1

asnileglyserlysser

seqidno5

c8lccdr2

aspaspser

seqidno6

c8lccdr3

glnvaltrpaspserserseraspleuvalval

seqidno7

5f9hccdr1

glyphethrpheasnasntyrala

seqidno8

5f9hccdr2

ileasnseraspglyargserthr

seqidno9

5f9hccdr3

alaargthrphetyralaasptyr

seqidno10

5f9lccdr1

glnasnvalaspthrthr

seqidno11

5f9lccdr2

trpalaser

seqidno12

5f9lccdr3

glnglntyrserilepheprotyrthr

seqidno13

5a19hccdr1

glyphethrphesersertyrala

seqidno14

5a19hccdr2

valserseraspglysertyrala

seqidno15

5a19hccdr3

alaserpheashtrpaspvalalatyr

seqidno16

5a19lccdr1

glnserleuleuasnthrargthrarglyssertyr

seqidno17

5a19lccdr2

trpalaser

seqidno18

5a19lccdr3

lysglnsertyrserleutyrthr

seqidno19

okt3hccdr1

glytyrthrphethrargtyrthr

seqidno20

okt3hccdr2

ileasnproserargglytyrthr

seqidno21

okt3hccdr3

alaargtyrtyraspasphistyrcysleuasptyr

seqidno22

okt3lccdr1

serservalsertyr

seqidno23

okt3lccdr2

aspthrser

seqidno24

okt3lccdr3

glnglntrpserserasnprophethr

seqidno25

9.3hccdr1

glypheserleuserasptyrgly

seqidno26

9.3hccdr2

iletrpalaglyglyglythr

seqidno27

9.3hccdr3

alaargasplysglytyrsertyrtyrtyrsermetasptyr

seqidno28

9.3lccdr1

gluservalglutyrtyrvalthrserleu

seqidno29

9.3lccdr2

alaalaser

seqidno30

9.3lccdr3

glnglnserarglysvalprotyrthr

seqidno31

a9hccdr1

glytyrthrphethrasntyrtrp

seqidno32

a9hccdr2

iletyrproglyglyglytyrthr

seqidno33

a9hccdr3

alaargseralasertrptyrpheaspval

seqidno34

a9lccdr1

thrglythrvalthrthrserasntyr

seqidno35

a9lccdr2

histhrasn

seqidno36

a9lccdr3

alaleutrptyrasnasnhistrpval

seqidno37

ncam29.2hccdr1

glyphethrpheserserphegly

seqidno38

ncam29.2hccdr2

ileserserglysertyralaile

seqidno39

ncam29.2hccdr3

valargglyargargleuglygluglytyralametasptyr

seqidno40

ncam29.2lccdr1

glnserleuleutyrserserashglnlysashtyr

seqidno41

ncam29.2lccdr2

trpalaser

seqidno42

ncam29.2lccdr3

glnglntyrsersertrpthr

seqidno43

c8-higg1fcmut-okt3

mdfevqifsfllisasvimsrmaevqlvesgggllqpggslrlscaasgftfsgyamswvrqapgkglewvssisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtalyycakppgrqeyygssiyyfplgnwgqgtlvtvssastkgpkleegefsearvqsaltqpasvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdlvvfgggtkltvlgnsggggsggggsggggsasepkssdkthtcppcpappaagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkglassiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkdpgwshpqfeksrggggqvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssgnsggggsggggsggggsasqivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleingns

seqidno44

c8-hlgg1fcmut-9.3

mdfevqifsfllisasvimsrmaevqlvesgggllqpggslrlscaasgftfsgyamswvrqapgkglewvssisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtalyycakppgrqeyygssiyyfplgnwgqgtlvtvssastkgpkleegefsearvqsaltqpasvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdlvvfgggtkltvlgnsggggsggggsggggsasepkssdkthtcppcpappaagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkglassiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkdpgwshpqfekssggggqvqlqesgpglvtpsqslsitctvsgfslsdygvhwvrqspgqglewlgviwagggtnynsalmsrksiskdnsksqvflkmnslqaddtavyycardkgysyyysmdywgqgttvtvssrgggsggggsggggsdieltqspaslavslgqratiscrasesveyyvtslmqwyqqkpgqppkllifaasnvesgvparfsgsgsgtnfslnihpvdeddvamyfcqqsrkvpytfgggtkleikr

seqidno45

c8-hlgg1fcmut-a9

mdfevqifsfllisasvimsrmaevqlvesgggllqpggslrlscaasgftfsgyamswvrqapgkglewvssisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtalyycakppgrqeyygssiyyfplgnwgqgtlvtvssastkgpkleegefsearvqsaltqpasvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdlvvfgggtkltvlgnsggggsggggsggggsasepkssdkthtcppcpappaagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkglassiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkdpgwshpqfeksrggggqvqlqqsgaelvrpgtsvkisckasgytftnywlgwvkqrpghglewigdiypgggytnynekfkgkatvtadtssrtayvqvrsltsedsavyfcarsaswyfdvwgagttvtvssgnsggggsggggsggggsasqavvtqesalttspgetvtltcrsntgtvttsnyanwvqekpdhlftglightnnrapgvparfsgsligdkaaltitgaqtedeaiyfcalwynnhwvfgggtkltvl

seqidno46

c8-hlgg1fcmut-ncam29.2

mdfevqifsfllisasvimsrmaevqlvesgggllqpggslrlscaasgftfsgyamswvrqapgkglewvssisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtalyycakppgrqeyygssiyyfplgnwgqgtlvtvssastkgpkleegefsearvqsaltqpasvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdlvvfgggtkltvlgnsggggsggggsggggsasepkssdkthtcppcpappaagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwryvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkglassiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkdpgwshpqfekssgggdvqlvesggglvqpggsrklscaasgftfssfgmhwvrqapekglewvayissgsyaiyyadtvkgrftisrdnpentlflqmtslrsedsamyycvrgrrlgegyamdywgqgtsvtvssgnsggggsggggsggggsasdivmsqspsslavsvgekvtmsckssqsllyssnqknylawyqqkpgqspklliywastrksgvpdrftgsgsgtdftltissvkaedlavyycqqysswtfgggtkleikr

seqidno47

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

seqidno48

alalysthrthrprolysleuglugluglyglupheserglualaargval

seqidno49

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

seqidno50

具有jun亮氨酸拉鏈二聚化結(jié)構(gòu)域(黑體斜體下劃線)的c8-higg1fcmut-okt3

mdfevqifsfllisasvimsrmaevqlvesgggllqpggslrlscaasgftfsgyamswvrqapgkglewvssisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtalyycakppgrqeyygssiyyfplgnwgqgtlvtvssastkgpkleegefsearvqsaltqpasvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdlvvfgggtkltvlgnsggggsggggsggggsasriarleekvktlkaqnselastanmlreqvaqlkqkvmnyssepkssdkthtcppcpappaagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkglassiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkdpgwshpqfeksrggggqvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssgnsggggsggggsggggsasqivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgsgtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleingns

seqidno51

具有fos亮氨酸拉鏈二聚化結(jié)構(gòu)域(黑體斜體下劃線)的c8-hlgglfcmut-9.3

mdfevqifsfllisasvimsrmaevqlvesgggllqpggslrlscaasgftfsgyamswvrqapgkglewvssisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtalyycakppgrqeyygssiyyfplgnwgqgtlvtvssastkgpkleegefsearvqsaltqpasvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdlvvfgggtkltvlgnsggggsggggsggggsasltdtlqaetdqledkksalqteianllkekeklefilaayssepkssdkthtcppcpappaagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkglassiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkdpgwshpqfekssggggqvqlqesgpglvtpsqslsitctvsgfslsdygvhwvrqspgqglewlgviwagggtnynsalmsrksiskdnsksqvflkmnslqaddtavyycardkgysyyysmdywgqgttvtvssrgggsggggsggggsdieltqspaslavslgqratiscrasesveyyvtslmqwyqqkpgqppkllifaasnvesgvparfsgsgsgtnfslnihpvdeddvamyfcqqsrkvpytfgggtkleikr

附圖示出：

圖1和圖2舉例說明了本發(fā)明的優(yōu)選三特異性結(jié)合分子。

圖3：t細(xì)胞被五價和八價的三特異性抗體活化。確定在雙特異性和三特異性抗體存在下在固定的hbsag上培養(yǎng)48小時的t細(xì)胞的ifnγ分泌。當(dāng)與用cd3活化的雙特異性抗體進(jìn)行單一處理相比，cd3活化的雙特異性抗體(bsabαcd3)和cd28活化的雙特異性抗體(bsabαcd28)的組合應(yīng)用導(dǎo)致在抗原存在下ifnγ的分泌增加。五價(trimab)和八價(okta)的三特異性抗體構(gòu)建體的應(yīng)用誘導(dǎo)顯著更高的干擾素分泌，其中trimab是最有效的構(gòu)建體。用cd28活化抗體以及未經(jīng)處理的對照pbmc的單獨處理未顯示升高的ifnγ水平。

圖4：t細(xì)胞被五價和八價的三特異性抗體活化變成細(xì)胞毒性。(a)確定指示了在雙特異性和三特異性的抗體存在下在固定的hbsag上培養(yǎng)48小時的t細(xì)胞的細(xì)胞毒性活化的lamp-1易位。當(dāng)與用cd3活化的雙特異性抗體進(jìn)行單一處理相比，cd3活化的雙特異性抗體(bsabαcd3)和cd28活化的雙特異性抗體(bsabαcd28)的組合應(yīng)用導(dǎo)致在抗原存在下脫粒標(biāo)記物lamp-1的易位增強(qiáng)。五價(trimab)和八價(okta)的三特異性抗體構(gòu)建體的應(yīng)用誘導(dǎo)顯著更高水平的細(xì)胞毒性活化，其中trimab是在83％的cd8+t細(xì)胞中誘導(dǎo)脫粒的最有效的構(gòu)建體。用cd28活化抗體和未經(jīng)處理的對照pbmc的單獨處理未顯示lamp-1的易位。

(b)指示細(xì)胞毒性活化的顆粒酶b的表達(dá)。trimab和okta三特異性抗體構(gòu)建體誘導(dǎo)顯著更高水平的細(xì)胞毒性活化，其中trimab是在95％的cd8+t細(xì)胞中誘導(dǎo)顆粒酶b表達(dá)的最有效的構(gòu)建體。

圖5：來自健康供體的初始t細(xì)胞被trimab活化。在trimab存在下，當(dāng)與hbsag陽性(huh7s)或hbsag陰性(huh7)的靶細(xì)胞共培養(yǎng)時，在來自健康供體的pbmc中的ifnγ分泌。只有當(dāng)添加trimab并且靶細(xì)胞表達(dá)hbsag時，檢測到通過ifnγ的分泌確定的t細(xì)胞的活化。

圖6：來自健康供體的初始t細(xì)胞被活化以通過trimab殺傷hbsag陽性靶細(xì)胞。來自健康供體的pbmc與hbsag陰性(huh7)和hbsag陽性靶細(xì)胞(huh7s)的共培養(yǎng)。添加trimab后，通過xcelligence分析確定隨時間的細(xì)胞活力，三次重復(fù)。在pbmc對照中，細(xì)胞與huh7s細(xì)胞共培養(yǎng)，但不添加抗體。只有當(dāng)添加trimab并且靶細(xì)胞表達(dá)hbsag時，才在添加抗體后24小時開始觀察到特異性殺傷。

圖7：中和抗hbs抗體與通過trimab活化t細(xì)胞競爭。在含有中和αhbs抗體的人血清存在下，經(jīng)trimab處理的pbmc與hbsag陽性huh7(huh7s)細(xì)胞共培養(yǎng)。0％：沒有含抗體血清的共培養(yǎng)；50％：一半的fcs被含抗體的人血清代替，得到1175iu/l的αhbs濃度；100％：用含抗體的血清代替fcs，得到235iu/l的αhbs濃度。(a)不添加中和抗體，t細(xì)胞被活化并分泌ifnγ和其他細(xì)胞因子，(b)t細(xì)胞被活化以在典型的時間過程中殺傷靶細(xì)胞，導(dǎo)致在72小時內(nèi)細(xì)胞活力50％的損失。中和抗體與trimab活性競爭，導(dǎo)致t細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性的部分或甚至完全損失。

圖8：當(dāng)被trimab活化時，來自患有慢性乙型肝炎患者的pbmc殺傷hbsag陽性靶細(xì)胞。來自患有慢性乙型肝炎(chb)患者的pbmc與hbsag陰性(huh7)和hbsag陽性靶細(xì)胞(huh7s)的共培養(yǎng)。添加trimab后，通過xcelligence分析確定隨時間的細(xì)胞活力，三次重復(fù)。在pbmc對照中，細(xì)胞與huh7s細(xì)胞共培養(yǎng)，但不添加抗體。只有當(dāng)添加trimab并且靶細(xì)胞表達(dá)hbsag時，才在添加抗體后24至30小時開始觀察到特異性殺傷。

圖9：來自患有慢性乙型肝炎患者的pbmc被trimab激活。在trimab存在下與hbsag陽性(huh7s)或hbsag陰性(huh7)靶細(xì)胞共培養(yǎng)，來自患有慢性乙型肝炎(chb)患者的pbmcs的ifnγ分泌。只有當(dāng)添加trimab并且靶細(xì)胞表達(dá)hbsag時，才檢測到通過ifnγ的分泌確定的t細(xì)胞的活化。

實施例舉例說明本發(fā)明。

實施例1

材料和方法

三特異性抗體的克隆和制備

使用覆蓋所有vh和vκ/vλ亞型的一組引物通過來自各個雜交瘤的逆轉(zhuǎn)錄mrna的pcr擴(kuò)增獲得編碼抗cd3(okt3)和抗cd28(9.3)的可變重鏈和可變輕鏈的互補(bǔ)dna。將pcr產(chǎn)物連接到pcr2.1-topo(invitrogen，lifetechnologies)中并測序。使用噬菌體展示技術(shù)從乙型肝炎疫苗接種者的b細(xì)胞的cdna庫選擇抗hbsagscfvc8并進(jìn)行密碼子優(yōu)化。使用含有在5'和3'兩側(cè)中合適的限制性位點的引物，將編碼上述抗體的可變重鏈和可變輕鏈cdna用甘氨酸-絲氨酸接頭組裝到scfv中。為了獲得五價分子，將okt3和9.3scfv融合到抗體5f9的fab片段的c末端，同時將scfvc8的兩個實體添加至其n-末端。為了獲得八價分子，將四個scfvc8結(jié)構(gòu)域和兩個結(jié)構(gòu)域okt3和9.3連接到igg樣分子。

在所提及的5'甘氨酸-絲氨酸接頭的5'末端克隆c8scfv編碼序列。將完整的scfv-接頭-higg1fc-接頭-scfv序列亞克隆到哺乳動物表達(dá)載體pcdna3.1(-)(invitrogen)中。使用peqfect轉(zhuǎn)染試劑(peqlab)用maxi-prep質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞。使用0.8-1.0mg/mlg418選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子并擴(kuò)增。收集來自hek轉(zhuǎn)染子的上清液，并通過elisa分析分泌的三特異性抗體的濃度，并使用山羊抗人igg-fc特異性的過氧化物酶標(biāo)記抗體通過蛋白印跡分析所分泌抗體的完整性。

細(xì)胞培養(yǎng)條件和huh7s細(xì)胞的產(chǎn)生

將huh7肝癌細(xì)胞(nakabayaski等人，1982.growthofhumanhepatomacelllineswithdifferentiatedfunctionsinchemicallydefinedmedium.cancerres.42：3858-3863)和hek293細(xì)胞保存在補(bǔ)充有10％的牛胎兒血清(fbs)、青霉素(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和l-谷氨酰胺(2毫摩爾/l)的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem)中(均來自gibco，lifetechnologies)。

為了產(chǎn)生huh7s細(xì)胞，使用fugene轉(zhuǎn)染試劑(promega)利用編碼hbv基因型d亞型ayw1的小hbv表面抗原的質(zhì)粒和抗生素抗性基因轉(zhuǎn)染huh-7細(xì)胞?？股剡x擇后，分離單細(xì)胞克隆并在24孔板中生長。選擇具有最高h(yuǎn)bsag分泌的克隆，用于建立用作靶細(xì)胞的細(xì)胞系huh7-s。

pbmc的分離

使用lsm1077淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(paa)通過密度梯度離心從肝素化全血分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)。使25ml血液在13ml的lsm1077上分層。在室溫下以2000rpm離心20分鐘(無間歇)后收獲pbmc，并在補(bǔ)充有10％牛胎兒血清(fbs)、青霉素(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和l-谷氨酰胺(2毫摩爾/l)(均來自gibco)的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在37℃下在5％co2中靜置過夜步驟后，將pbmc用于共培養(yǎng)實驗。

pbmc在固定的hbsag上的培養(yǎng)

將在pbs(5μg/ml)中的100μl重組體hbsag轉(zhuǎn)移到96孔板中，并在4℃下包被過夜。第二天將hbsag溶液輕輕倒出，并用磷酸鹽緩沖液洗滌板。將1×10⁵個pbmc/孔轉(zhuǎn)移到hbsag包被的板上并與100μl含有三特異性抗體的上清液混合。沒有固定的hbsag的孔作為陰性對照。將pbmc在結(jié)合了hbsag的板上培養(yǎng)48小時，然后收獲上清液和細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。使用人ifn-γelisamax^tm(biolegend)通過elisa在上清液中檢測由效應(yīng)t細(xì)胞活化導(dǎo)致的細(xì)胞因子分泌。用針對lamp-1和顆粒酶b的抗體染色細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。所有實驗重復(fù)三次地進(jìn)行。

hbv陽性靶細(xì)胞和重定向效應(yīng)細(xì)胞的共培養(yǎng)

將huh7或huh7s靶細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)融合。在每孔100μl體積的培養(yǎng)基中添加1×10⁵個pbmc細(xì)胞。每孔應(yīng)用100μl含有三特異性抗體的hek上清液。為了確定cd3和cd28活化的協(xié)同作用，每孔添加50μl的每種雙特異性抗體上清液。將僅用效應(yīng)細(xì)胞(未添加抗體)孵育的未經(jīng)處理的靶細(xì)胞作為陰性對照。在96或120小時后，收集上清液，并通過elisa分析ifnγ分泌(見上文)。

為了確定細(xì)胞毒性，將表達(dá)hbsag的huh7s細(xì)胞在與xcellingenceratc系統(tǒng)(acea，bioscience，inc.)兼容的96孔e板中培養(yǎng)，直到它們實現(xiàn)融合。將新鮮分離的pbmc和100μl含抗體的上清液添加在每組三個復(fù)孔中。未轉(zhuǎn)基因的huh7細(xì)胞作為特異性對照。沒有抗體的與huh7s細(xì)胞共培養(yǎng)的pbmc作為陰性對照。使用xcellingenceratc系統(tǒng)實時監(jiān)控靶細(xì)胞的細(xì)胞活力120小時。

為了確定三特異性構(gòu)建體活化來自慢性乙型肝炎患者ctl的能力，我們分離來自慢性攜帶者的pbmc，并將其用于實驗。

實施例2

通過針對hbsag的五價和八價的三特異性抗體構(gòu)建體活化ctl

在第一組實驗中，已經(jīng)評估了針對ctl表面抗原cd3和cd28和hbv的小表面抗原的五價和八價的三特異性抗體構(gòu)建體的活性。我們將重組體hbsag包被到細(xì)胞培養(yǎng)皿的塑料表面上。向這些經(jīng)包被的孔添加免疫效應(yīng)細(xì)胞、即從健康供體分離的pbmc，和雙特異性以及三特異性的抗體構(gòu)建體。作為陰性對照，在雙特異性或三特異性抗體構(gòu)建體不存在的情況下在hbsag包被的孔上培養(yǎng)pbmc以評估非特異性的免疫細(xì)胞活化。

這些實驗顯示出在cd3活化的雙特異性構(gòu)建體存在下共培養(yǎng)后細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)的特異性活化，如通過最高5000pg/ml的促炎細(xì)胞因子干擾素γ(ifnγ)的分泌確定的(圖3)。共同施用cd3特異性和cd28特異性的構(gòu)建體后，該效應(yīng)進(jìn)一步得到增強(qiáng)，這證明了協(xié)同效應(yīng)，而cd28活化的構(gòu)建體靠其自身不能激活t細(xì)胞。

出人意料地，將cd3和cd28刺激和共刺激結(jié)構(gòu)域結(jié)合到三特異性分子中顯示出比兩種雙特異性構(gòu)建體的組合顯著更強(qiáng)的ctl活化(圖3)，如通過ifn分泌確定的。當(dāng)在染色后通過流式細(xì)胞術(shù)來分析免疫細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力時，確認(rèn)了這一點，因為lamp-1易位指示在由三特異性抗體構(gòu)建體活化的絕大多數(shù)細(xì)胞中細(xì)胞毒性囊泡脫粒和顆粒酶b的表達(dá)(圖4a和圖b))。

因此，五價的構(gòu)建體被證明是最有效的，并且能夠在80％至95％的免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性功能(圖4)。由于pbmc含有約70％的t細(xì)胞，但它們中大多數(shù)是初始t細(xì)胞，ctl的活化需要tcr復(fù)合物的強(qiáng)烈活化。

實施例3

通過三特異性抗體構(gòu)建體活化ctl后hbsag陽性肝細(xì)胞的特異性殺傷

在第二組實驗中，已經(jīng)評估了針對ctl表面抗原cd3和cd28和hbv小表面抗原的三特異性抗體構(gòu)建體特異性殺傷表達(dá)hbsag的細(xì)胞的能力。將產(chǎn)生hbv表面抗原的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的huh7肝癌細(xì)胞系(huh7s細(xì)胞)用作靶細(xì)胞。在確定hbv蛋白表達(dá)后，將這些靶細(xì)胞與免疫效應(yīng)細(xì)胞、即從健康供體分離的pbmc和五價的三特異性抗體構(gòu)建體共培養(yǎng)。作為陰性對照，分析了與hbv陰性靶細(xì)胞的共培養(yǎng)物，其已經(jīng)用含有hbsag的上清液進(jìn)行了預(yù)培養(yǎng)。該對照用于排除由于hbv顆粒在hbv-陰性靶細(xì)胞表面上的非特異性結(jié)合的效應(yīng)細(xì)胞活化。此外，在不存在三特異性抗體構(gòu)建體的情況下，將hbv陽性靶細(xì)胞與免疫效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)以評估非特異性背景細(xì)胞毒性。

這些實驗顯示出在cd3活化和cd28活化的五價的三特異性構(gòu)建體存在下，與huh7s細(xì)胞而非huh7細(xì)胞共培養(yǎng)后的ctl的特異性活化。通過促炎細(xì)胞因子干擾素γ(ifn-γ)的分泌確定ctl活化最高為2ng/ml。在不存在三特異性分子的情況下，沒有觀察到ctl活化(圖5)。

此外，三特異性構(gòu)建體介導(dǎo)了產(chǎn)生hbsag的huh7肝癌細(xì)胞系的特異性細(xì)胞毒性消除(圖6)，如通過與huh7細(xì)胞或在不添加抗體構(gòu)建體下孵育的對照相比，huh7s靶細(xì)胞活力＞90％的降低所證明的。

為了進(jìn)一步證明ctl活化的hbsag特異性，進(jìn)行了含有中和抗hbs抗體的人血清的競爭試驗(圖7)。實驗顯示當(dāng)添加117.5iu/l抗hbs時，只有ctl活化以及靶細(xì)胞殺傷的部分競爭，而殺傷效果在235iu/l抗hbs的濃度下完全消除。

實施例4

來自慢性乙型肝炎患者的t細(xì)胞的重定向和活化

為了分析三特異性抗體構(gòu)建體在慢性乙型肝炎患者中活化ctl功能的能力，從高病毒血癥乙型肝炎病毒攜帶者的患者分離pbmc。將產(chǎn)生hbv表面抗原的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的huh7肝癌細(xì)胞系(huh7s細(xì)胞)用作靶細(xì)胞。在存在和不存在五價的三特異性抗體構(gòu)建體的情況下，將這些靶細(xì)胞與從乙型肝炎患者分離的pbmc共培養(yǎng)。分析陰性對照與hbv陰性靶細(xì)胞的共培養(yǎng)物。

這些實驗表明，通過cd3活化和cd28活化五價的三特異性構(gòu)建體在慢性乙型肝炎患者的pbmc中活化的ctl特異性殺傷huh7s細(xì)胞，而不是huh7細(xì)胞(圖8)。在沒有三特異性抗體構(gòu)建體的情況下，沒有觀察到殺傷，這證明該方法的特異性和在患者的pbmc中缺少自發(fā)的ctl活性。促炎細(xì)胞因子干擾素γ(ifn-γ)的分泌證實特異性ctl活化(圖9)。

序列表

<110>亥姆霍茲慕尼黑中心-德國環(huán)境健康研究中心等

<120>用于治療hbv感染和相關(guān)病狀病癥的三特異性結(jié)合分子

<130>y1213pct

<150>ep15159274.8

<151>2015-03-16

<160>51

<170>bissap1.2

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>1

glyphethrpheserglytyrala

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvc8重鏈cdr2

<400>2

ileserglyserglyglyserthr

15

<210>3

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvc8重鏈cdr3

<400>3

alalysproproglyargglnglutyrtyrglyserseriletyrtyr

151015

pheproleuglyasn

20

<210>4

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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asnileglyserlysser

15

<210>5

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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aspaspser

1

<210>6

<211>11

<212>prt

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glnvaltrpaspserserseraspleuvalval

1510

<210>7

<211>8

<212>prt

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<220>

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<400>7

glyphethrpheasnasntyrala

15

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>8

ileasnseraspglyargserthr

15

<210>9

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>9

alaargthrphetyralaasptyr

15

<210>10

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>10

glnasnvalaspthrthr

15

<210>11

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>11

trpalaser

1

<210>12

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>12

glnglntyrserilepheprotyrthr

15

<210>13

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>13

glyphethrphesersertyrala

15

<210>14

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv5a19重鏈cdr2

<400>14

valserseraspglysertyrala

15

<210>15

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv5a19重鏈cdr3

<400>15

alaserpheasntrpaspvalalatyr

15

<210>16

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>16

glnserleuleuasnthrargthrarglyssertyr

1510

<210>17

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>17

trpalaser

1

<210>18

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv5a19輕鏈cdr3

<400>18

lysglnsertyrserleutyrthr

15

<210>19

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>19

glytyrthrphethrargtyrthr

15

<210>20

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvokt3重鏈cdr2

<400>20

ileasnproserargglytyrthr

15

<210>21

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvokt3重鏈cdr3

<400>21

alaargtyrtyraspasphistyrcysleuasptyr

1510

<210>22

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvokt3輕鏈cdr1

<400>22

serservalsertyr

15

<210>23

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvokt3輕鏈cdr2

<400>23

aspthrser

1

<210>24

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvokt3輕鏈cdr3

<400>24

glnglntrpserserasnprophethr

15

<210>25

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>25

glypheserleuserasptyrgly

15

<210>26

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>26

iletrpalaglyglyglythr

15

<210>27

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv9.3重鏈cdr3

<400>27

alaargasplysglytyrsertyrtyrtyrsermetasptyr

1510

<210>28

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv9.3輕鏈cdr1

<400>28

gluservalglutyrtyrvalthrserleu

1510

<210>29

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv9.3輕鏈cdr2

<400>29

alaalaser

1

<210>30

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv9.3輕鏈cdr3

<400>30

glnglnserarglysvalprotyrthr

15

<210>31

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfva9重鏈cdr1

<400>31

glytyrthrphethrasntyrtrp

15

<210>32

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfva9重鏈cdr2

<400>32

iletyrproglyglyglytyrthr

15

<210>33

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfva9重鏈cdr3

<400>33

alaargseralasertrptyrpheaspval

1510

<210>34

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfva9輕鏈cdr1

<400>34

thrglythrvalthrthrserasntyr

15

<210>35

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfva9輕鏈cdr2

<400>35

histhrasn

1

<210>36

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfva9輕鏈cdr3

<400>36

alaleutrptyrasnasnhistrpval

15

<210>37

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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<400>37

glyphethrpheserserphegly

15

<210>38

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvncam29.2重鏈cdr2

<400>38

ileserserglysertyralaile

15

<210>39

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvncam29.2重鏈cdr3

<400>39

valargglyargargleuglygluglytyralametasptyr

1510

<210>40

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvncam29.2輕鏈cdr1

<400>40

glnserleuleutyrserserasnglnlysasntyr

1510

<210>41

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvncam29.2輕鏈cdr2

<400>41

trpalaser

1

<210>42

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfvncam29.2輕鏈cdr3

<400>42

glnglntyrsersertrpthr

15

<210>43

<211>794

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗hbsagscfv[c8]^甘氨酸-絲氨酸-連接子^higg1-fc[c245s,l259f,l26

0e,g262a,a355t]^鏈霉素標(biāo)記^甘氨酸-連接子^抗-cd3scfv[okt3]

<400>43

metaspphegluvalglnilepheserpheleuleuileseralaser

151015

valilemetserargmetalagluvalglnleuvalgluserglygly

202530

glyleuleuglnproglyglyserleuargleusercysalaalaser

354045

glyphethrpheserglytyralametsertrpvalargglnalapro

505560

glylysglyleuglutrpvalserserileserglyserglyglyser

65707580

thrtyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargasp

859095

asnserlysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalaglu

100105110

aspthralaleutyrtyrcysalalysproproglyargglnglutyr

115120125

tyrglyserseriletyrtyrpheproleuglyasntrpglyglngly

130135140

thrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyprolysleuglu

145150155160

gluglyglupheserglualaargvalglnseralaleuthrglnpro

165170175

alaservalservalalaproglyglnthralaargilethrcysgly

180185190

glyasnasnileglyserlysservalhistrptyrglnglnlyspro

195200205

glyglnalaprovalleuvalvaltyraspaspseraspargproser

210215220

glyileprogluargpheserglyserasnserglyasnthralathr

225230235240

leuthrileserargvalglualaglyaspglualaasptyrtyrcys

245250255

glnvaltrpaspserserseraspleuvalvalpheglyglyglythr

260265270

lysleuthrvalleuglyasnserglyglyglyglyserglyglygly

275280285

glyserglyglyglyglyseralasergluprolysserserasplys

290295300

thrhisthrcysproprocysproalaprogluphegluglyalapro

305310315320

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

325330335

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

340345350

progluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

355360365

alalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargval

370375380

valservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglu

385390395400

tyrlyscyslysvalserasnlysalaleuprothrproileglulys

405410415

thrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

420425430

leuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthr

435440445

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

450455460

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleu

465470475480

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

485490495

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

500505510

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

515520525

lysaspproglytrpserhisproglnpheglulysserargglygly

530535540

glyglyglnvalglnleuglnglnserglyalagluleualaargpro

545550555560

glyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethr

565570575

argtyrthrmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglu

580585590

trpileglytyrileasnproserargglytyrthrasntyrasngln

595600605

lysphelysasplysalathrleuthrthrasplysserserserthr

610615620

alatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyr

625630635640

tyrcysalaargtyrtyraspasphistyrcysleuasptyrtrpgly

645650655

glnglythrthrleuthrvalserserglyasnserglyglyglygly

660665670

serglyglyglyglyserglyglyglyglyseralaserglnileval

675680685

leuthrglnserproalailemetseralaserproglyglulysval

690695700

thrmetthrcysseralaserserservalsertyrmetasntrptyr

705710715720

glnglnlysserglythrserprolysargtrpiletyraspthrser

725730735

lysleualaserglyvalproalahispheargglyserglysergly

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[a9]

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[ncam29.2]

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glyphethrpheserglytyralametsertrpvalargglnalapro

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859095

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100105110

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115120125

tyrglyserseriletyrtyrpheproleuglyasntrpglyglngly

130135140

thrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyprolysleuglu

145150155160

gluglyglupheserglualaargvalglnseralaleuthrglnpro

165170175

alaservalservalalaproglyglnthralaargilethrcysgly

180185190

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lysleuthrvalleuglyasnserglyglyglyglyserglyglygly

275280285

glyserglyglyglyglyseralasergluprolysserserasplys

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