本發(fā)明涉及一種嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法，具體涉及一種全人源化EGFRvIIICART細(xì)胞及其制備方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)《2011年中國腫瘤登記年報》報道，腦瘤或中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤是死亡率排名第十位的惡性腫瘤。腦瘤內(nèi)惡性程度較高的為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，約占膠質(zhì)瘤一半的比例。當(dāng)前，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方式主要是手術(shù)、放療和化療，存在著治愈率低、藥物副作用大和復(fù)發(fā)率高等問題，至今仍沒有有效的治療手段，使得患者生存時間通常少于2年。近年來，隨著腫瘤免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，免疫治療作為一種新的治療手段，主要通過人為干預(yù)來調(diào)動機(jī)體自身免疫系統(tǒng)，對癌細(xì)胞進(jìn)行殺滅的作用日益受到重視。目前，最熱門、最有效的免疫治療手段包括免疫檢查點抑制劑和嵌合抗原受體T細(xì)胞(ChimericAntigenReceptorTcells，CART)。其中，免疫檢查點抑制劑包括針對CTLA4、PD1、PDL1等免疫抑制分子的抗體，已被美國FDA批準(zhǔn)用于黑色素瘤、肺癌等的治療(中國國內(nèi)正在進(jìn)行臨床試驗)；CART在治療白血病和淋巴瘤時，顯示了巨大的優(yōu)勢，對于兒童復(fù)發(fā)、難治白血病，臨床數(shù)據(jù)達(dá)到了93％的完全緩解率(CR)。天然狀況下，由免疫反應(yīng)(病毒、腫瘤抗原)活化的T細(xì)胞在識別、殺死靶細(xì)胞時，主要受到兩種信號的刺激，一個為第一信號，來自T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)和CD3分子復(fù)合體，另一個為協(xié)同刺激信號，來自協(xié)同刺激分子CD28、4-1BB。T細(xì)胞只有受到這兩種信號刺激時，才能充分活化，發(fā)揮殺傷功能。但是，許多腫瘤細(xì)胞會通過下調(diào)TCR分子識別的MHC-抗原肽復(fù)合物，或者下調(diào)共刺激分子，使T細(xì)胞不能發(fā)揮殺傷功能，從而逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，影響其治療效果。CART是基因工程改造的T細(xì)胞，是近年來發(fā)展的靶向免疫治療新策略，CAR分子一端為抗體的抗原識別區(qū)(單鏈抗體scFv)，另一端為胞內(nèi)區(qū)，活化T細(xì)胞。不同代數(shù)CART的胞內(nèi)區(qū)不同，最早的第一代CART只有CD3分子的胞內(nèi)區(qū)，不能充分增殖，臨床效果不好；第二代CART胞內(nèi)區(qū)為協(xié)同刺激分子CD28+CD3ζ或4-1BB+CD3ζ，能夠傳遞T細(xì)胞活化的兩種信號，在2011年臨床試驗治療白血病時顯示了神奇的效果，能夠清除所有白血病細(xì)胞，達(dá)到完全治愈腫瘤的目的；第三代CART中加入了兩種協(xié)同刺激分子CD28和4-1BB分子，連同CD3ζ分子，能提供T細(xì)胞更多的活化信號，賦予T細(xì)胞更強(qiáng)的增殖性、持久的生命力，特異性地識別靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞，尚未在臨床應(yīng)用。理想的腫瘤抗原應(yīng)該是在正常組織中不表達(dá)或極少表達(dá)，在腫瘤組織的細(xì)胞中表達(dá)率高，它為腫瘤細(xì)胞生長過程中所必須的，避免腫瘤細(xì)胞通過不表達(dá)該抗原而逃避免疫監(jiān)視。表皮生長因子受體III突變體(EGFRvIII)為表皮生長因子受體(EGFR)基因的突變體，EGFRvIII主要表達(dá)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)，EGFRvIII常與EGFR基因擴(kuò)增同時存在，EGFR和EGFRvIII的表達(dá)見表1。表1-EGFR和EGFRvIII在不同腫瘤組織的表達(dá)腫瘤類型EGFR高表達(dá)比例EGFRvIII高表達(dá)比例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤40-63％24-64％頭頸癌43-100％42-48％非小細(xì)胞肺癌32-84％0-5％乳腺癌14-91％27-36％結(jié)直腸癌25-77％0％胰腺癌30-95％無數(shù)據(jù)相比EGFR，EGFRvIII主要為EGFR胞外區(qū)的外顯子2-7缺失，但是剩余基因的閱讀框沒有改變，能夠繼續(xù)轉(zhuǎn)錄、翻譯出EGFR外顯子8后面的氨基酸，由此形成腫瘤特異性表位，其胞內(nèi)區(qū)能夠傳遞信號，導(dǎo)致細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，EGFRvIII特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，正常組織沒有表達(dá)，因此EGFRvIII是較好的腫瘤免疫治療的靶點。細(xì)胞學(xué)方面的實驗表明EGFRvIII促進(jìn)細(xì)胞增殖、浸潤，抵抗凋亡，使腫瘤細(xì)胞對放療及一些化療藥物具有抵抗性，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。EGFRvIII在人類肺鱗癌標(biāo)本內(nèi)，有5％的檢出率；EGFRvIII基因在小鼠肺組織內(nèi)表達(dá)能夠?qū)е履[瘤，表明EGFRvIII過表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生，過表達(dá)EGFRvIII的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對通常的EGFR抑制劑治療無效，惡性程度較高。臨床試驗以EGFRvIII特異肽段增強(qiáng)的DC細(xì)胞回輸患者，可將患者中位生存時間從63.3周提高到110.8周。2013年，SampsonJ.H.構(gòu)建了針對EGFRvIII的3代CART細(xì)胞，與放療配合，在動物實驗中能夠有效的清除膠質(zhì)瘤細(xì)胞。然而，SampsonJ.H盡管使用了3代CART結(jié)構(gòu)，但是其使用的識別EGFRvIII的抗體序列為鼠源的，活化T細(xì)胞的分子也是鼠源的，使得構(gòu)建的3代CART結(jié)構(gòu)只能活化小鼠T細(xì)胞，不能夠活化人T細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)CN201480009507.1公開了使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受體治療癌癥中主要用到是小鼠抗體序列3C10，而選用139抗體序列只做了2代CAR，沒有做動物實驗。因此，全人源化EGFRvIIICART細(xì)胞關(guān)鍵之處在于設(shè)計全人源識別EGFRvIII的scFV序列使用在3代CART結(jié)構(gòu)，證明此種設(shè)計能夠使CART細(xì)胞具有殺傷EGFRvIII表達(dá)細(xì)胞的功能，通過細(xì)胞實驗和動物實驗均證明有效才可行。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，一種全人源化EGFRvIIICART細(xì)胞，所述T細(xì)胞表面表達(dá)全人源化EGFRvIIICAR基因，其堿基序列如SEQIDNO:3所示。進(jìn)一步，所述全人源化EGFRvIIICAR基因是由合成的ScFV基因和合成的3代CAR結(jié)構(gòu)基因通過重疊PCR進(jìn)行拼接。進(jìn)一步，所述合成的ScFV基因包括編碼CD8信號肽的核苷酸+全人源化139抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸密碼子優(yōu)化的核苷酸+編碼linker(G4S)3+全人源化139抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，其堿基序列如SEQIDNO:1所示。進(jìn)一步，所述合成的3代CAR結(jié)構(gòu)基因包括編碼CD8鉸鏈區(qū)+CD28跨膜區(qū)、胞漿區(qū)+4-1BB胞漿區(qū)+CD3ζ胞漿區(qū)的核苷酸片段，其堿基序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，一種全人源化EGFRvIIICART細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建3代慢病毒CAR載體：首先將合成的ScFV基因或合成的3代CAR結(jié)構(gòu)基因分別擴(kuò)增PCR，得到合成的ScFV基因片段的PCR產(chǎn)物和合成的3代CAR結(jié)構(gòu)基因片段的PCR產(chǎn)物；然后進(jìn)行重疊PCR將這兩個基因片段的PCR產(chǎn)物連接在一起，得到3代CAR結(jié)構(gòu)的EGFRvIIICAR基因；最后將Pre-Lenti-EF1-MCS載體和EGFRvIIICAR基因雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，提質(zhì)粒，測序，得到序列正確的表達(dá)EGFRvIIICAR的慢病毒載體Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR；(2)包裝EGFRvIIICAR慢病毒，感染T細(xì)胞，制備得到CART進(jìn)行細(xì)胞殺傷實驗驗證，證明有效；(3)再次制備EGFRvIIICART，進(jìn)行動物實驗功能驗證，證明有效。進(jìn)一步，步驟(1)中，用于所述擴(kuò)增PCR的引物為EGFRvIII-EcoRI-up序列如SEQIDNO:4所示和EGFRvIII-BamHI-down序列如SEQIDNO:5所示。進(jìn)一步，步驟(1)中，用于所述重疊PCR的引物為Middle-R如SEQIDNO:6所示和Middle-F如SEQIDNO:7所示。進(jìn)一步，步驟(1)中，所述測序引物為Pre-up-Seq，如SEQIDNO:8所示和Pre-down-Seq，如SEQIDNO:9所示。進(jìn)一步，步驟(1)中，所述雙酶為EcoRI限制性內(nèi)切酶和BamHI限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明的優(yōu)點在于利用全人源化139抗體序列設(shè)計構(gòu)建了3代全人源化EGFRvIIICART的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了細(xì)胞實驗和動物實驗，皆證明有效,能夠活化人T細(xì)胞，是目前最新的針對EGFRvIII靶點的CART設(shè)計，能夠用于人體腫瘤的治療，為EGFRvIIICART細(xì)胞進(jìn)行臨床試驗、臨床研究提供了基礎(chǔ)。附圖說明通過閱讀下文優(yōu)選實施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點和益處對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實施方式的目的，而并不認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。而且在整個附圖中，用相同的參考符號表示相同的部件。在附圖中：圖1為本發(fā)明EGFRvIIICAR慢病毒載體構(gòu)建流程圖。圖2(a)-(b)為CART細(xì)胞殺死表達(dá)EGFRvIII的MC38靶細(xì)胞的鏡下圖。圖3為Real-timePCR鑒定MC38EGFRvIII的表達(dá)。圖4為LDH釋放實驗檢測CART的殺傷率。其中1為MC38-EGFRvIII+controlCART的殺傷率；2為MC38-EGFRvIII+EGFRvIIICART的殺傷率。圖5為EGFRvIIICART抑制小鼠皮下腫瘤實驗設(shè)計流程。圖6為EGFRvIIICART抑制小鼠皮下腫瘤體積變化。圖7為EGFRvIIICART抑制小鼠皮下腫瘤體重變化。具體實施方式下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本公開的示例性實施方式。雖然附圖中顯示了本公開的示例性實施方式，然而應(yīng)當(dāng)理解，可以以各種形式實現(xiàn)本公開而不應(yīng)被這里闡述的實施方式所限制。相反，提供這些實施方式是為了能夠更透徹地理解本公開，并且能夠?qū)⒈竟_的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。實施例1：Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR載體構(gòu)建1、合成的ScFV基因：包括編碼CD8信號肽的核苷酸+全人源化139抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸密碼子優(yōu)化的核苷酸+編碼linker(G4S)3的核苷酸+全人源化139抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，其堿基序列如SEQIDNO:1所示。其中，全人源化識別EGFRvIII的139抗體序列參見世界專利WO2005010151A2。2、合成的3代CAR基因：包括編碼CD8鉸鏈區(qū)+CD28跨膜區(qū)、胞漿區(qū)+4-1BB胞漿區(qū)+CD3ζ胞漿區(qū)的核苷酸片段，其堿基序列如SEQIDNO:2所示。3、將合成的ScFV基因和合成的3代CAR基因通過重疊PCR反應(yīng)進(jìn)行拼接，得到3代結(jié)構(gòu)的EGFRvIIICAR基因，如SEQIDNO:3所示。具體過程如下：(1)引物設(shè)計：使用序列分析軟件pDRAW32分析EGFRvIIICAR基因序列，單酶切位點EcoRI、BamHI適合用于基因克隆，能夠和Pre-Lenti-EF1-MCS載體的多克隆位點匹配，設(shè)計兩端引物：EGFRvIII-EcoRI-up序列：CGGAATTCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC，如SEQIDNO:4所示；EGFRvIII-BamHI-down序列：CGGGATCCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG，如SEQIDNO:5所示。用于重疊PCR的引物：Middle-R，GTCGTGGTGGGCTTCGCTGGGCTAGACACTGTGACCAGTG，如SEQIDNO:6所示。Middle-F，CACTGGTCACAGTGTCTAGCCCAGCGAAGCCCACCACGAC，如SEQIDNO:7所示。(2)PCR擴(kuò)增、分子克?。篍GFRvIII-EcoRI-up和Middle-R引物以EGFRvIIIScFV基因為模板得到前面片段EGFRvIIIScFV，Middle-F和EGFRvIII-BamHI-down引物以3代CAR基因為模板得到后面片段CD8鉸鏈區(qū)-CD28跨膜區(qū)+胞漿區(qū)-4-1BB胞漿區(qū)-CD3ζ胞漿區(qū)，然后重疊PCR，得到全長3代EGFRvIIICAR基因，克隆到Pre-Lenti-EF1-MCS載體，送測序，測序引物為：Pre-up-Seq引物，GGAGCCTACCTAGACTCAGC，如SEQIDNO:8所示，Pre-down-Seq引物，CAACCAGGATTTATACAAGG，如SEQIDNO:9所示。測序結(jié)果經(jīng)比對，完全正確，得到了表達(dá)EGFRvIII3代CAR基因的慢病毒載體Pre-Lenti-EF1-EGFRvIIICAR(見圖1)。由此，采用容易在T細(xì)胞表達(dá)的EF1啟動子，采用全人源識別EGFRvIII的抗體序列，使用慢病毒表達(dá)體系構(gòu)建了完全適合臨床試驗、臨床研究的CART用EGFRvIII載體。實施例2：細(xì)胞殺傷實驗1、慢病毒包裝：(1)包裝細(xì)胞293T細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5％CO2孵箱內(nèi)，培養(yǎng)基為DMEM(Hyclone)/10％FBS(蘭州百靈)。(2)包裝前一天，0.25％胰酶消化293T細(xì)胞，1×107細(xì)胞/培養(yǎng)皿種植10cm培養(yǎng)皿。(3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，除了Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR穿梭質(zhì)粒外，還要加入包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.0G共轉(zhuǎn)染，其中Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR質(zhì)粒5μg，psPAX2質(zhì)粒3.75μg，pMD2.0G質(zhì)粒1.25μg。轉(zhuǎn)染時，將三種質(zhì)粒的混合物加入500μlMEM培養(yǎng)基(Hyclone)內(nèi)，在另一個微型離心管內(nèi)將25μlLipofectamine2000試劑(LifeTechnologies)加入到500μlMEM培養(yǎng)基(Hyclone)內(nèi)，然后將稀釋的轉(zhuǎn)染試劑緩慢逐滴加入稀釋的質(zhì)粒上方，輕輕渦旋，離心，室溫靜置20min，期間將10cm培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)基換為MEM培養(yǎng)基，最后將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的混合物均勻加入10cm培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖晃混勻，放入CO2孵箱；孵育5h后，將培養(yǎng)基換為新鮮含血清培養(yǎng)基。(4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，可以收獲病毒，將10ml含病毒培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入15ml離心管內(nèi)，4℃，1250rpm，離心5min，去除混入的293T細(xì)胞；然后將含病毒培養(yǎng)基通過0.45um濾器過濾，濃縮，分裝，-80℃凍存，并留存部分病毒(約40ul)測定滴度。2、外周血單核細(xì)胞分離(1)抽血：在無菌條件下，抽取肝素抗凝的人體靜脈血10ml。(2)分離外周血單核細(xì)胞：采用淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為生物工程有限公司)，依照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，獲得外周血單核細(xì)胞，用含IL2(1000u/ml)、10％滅活血清的1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。3、T細(xì)胞純化(1)外周血單核細(xì)胞計數(shù)：取1×107個外周血單核細(xì)胞于1.5ml微型離心管中。(2)250g，22℃，離心10分鐘，收集細(xì)胞沉淀。(3)吸棄上層液體，80μL無菌磁珠分離液重懸細(xì)胞，加入20μl無菌的人CD3MicroBeads(美天旎)。(4)4℃冰箱中放置1小時，期間，輕彈一次，懸起細(xì)胞。(5)1小時后，加入1mL的磁珠分離液，輕輕上下顛倒混勻，250g，4℃離心10min。期間準(zhǔn)備純化過濾柱，將純化過濾柱安放在磁鐵上(美天旎)，用500μl的磁珠分離液潤洗。(6)離心后的細(xì)胞棄上清，500μl磁珠分離液重懸，加入過濾柱，細(xì)胞懸液隨重力流出后，純化過濾柱用500μl的磁珠分離液洗四次。(7)將純化過濾柱從磁鐵上卸掉，使用1mL磁珠分離液將磁性吸附的T細(xì)胞快速沖出，至1.5ml微型離心管。(8)250g，4℃，離心10min。(9)含IL2(1000u/ml)、含10％滅活血清的1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)。4、T細(xì)胞慢病毒感染(1)純化得到的T細(xì)胞計數(shù)，2×106T細(xì)胞/培養(yǎng)孔(6孔板)種植，培養(yǎng)過夜后，加入MOI(感染復(fù)數(shù))為2的對照病毒液(空載體包裝，Control)和Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR病毒液，換為酶標(biāo)板離心轉(zhuǎn)子，1000g，22℃，離心30min，放入CO2孵箱，感染過夜。(2)感染第一天，補加1ml新鮮培養(yǎng)基(IL2(1000u/ml)、10％滅活血清)。(3)感染第三天，T細(xì)胞增殖非常旺盛，將T細(xì)胞收獲、洗滌離心后轉(zhuǎn)入25cm2塑料培養(yǎng)瓶。(4)CART細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量后，利用流式細(xì)胞儀(使用Jacksonimmnuoresearch的FITC標(biāo)記山羊抗人Fab段抗體)鑒定EGFRvIIICART表面,識別EGFRvIII的單鏈抗體的表達(dá)陽性率。5、殺傷實驗(1)通過Real-timePCR的方法，檢測了9種腫瘤細(xì)胞系，都沒有檢測到EGFRvIII的表達(dá)。因此，我們構(gòu)建了表達(dá)EGFRvIII的慢病毒載體，感染MC38或BxPC細(xì)胞，得到的穩(wěn)定細(xì)胞系能夠高水平的表達(dá)EGFRvIII(圖3)。計數(shù)高表達(dá)EGFRvIII的MC38細(xì)胞，1×104個細(xì)胞/孔(96孔板)；計數(shù)感染的T細(xì)胞(Control病毒液感染的ControlT細(xì)胞和Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICAR病毒液感染的EGFRvIIICART細(xì)胞)，按照效靶比10:1,5:1,2.5:1的比例加入MC38-EGFRvIII細(xì)胞上層，實驗設(shè)計見表2。表2-殺傷實驗設(shè)計表(靶細(xì)胞：MC38-EGFRvIII)6、殺傷測量通過測量被CART殺死的死亡細(xì)胞釋放的LDH，來確定CART細(xì)胞殺死靶細(xì)胞的效果(圖2、圖4)。(1)操作按照Promega公司LDH釋放試劑盒說明書(CytoTox96非放射性細(xì)胞毒性檢測，貨號：G1780)進(jìn)行。(2)步驟5中的殺傷實驗過夜，約18h后，最大釋放孔加入10×細(xì)胞裂解液(10xlysisbuffer)20ul，混勻。(3)2h后，96孔板內(nèi)每孔取50μl上清，加入50μlLDH酶底物，室溫避光靜置反應(yīng)20min，酶標(biāo)儀測量波長492nm處的吸光度OD492。(4)殺傷率計算公式為式中，實驗孔為不同設(shè)計效靶比得到的OD492，效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)為ControlT細(xì)胞或EGFRvIIICART細(xì)胞的OD492，靶細(xì)胞自發(fā)為靶細(xì)胞最小釋放，靶細(xì)胞最大為加入裂解液后，細(xì)胞全部死亡的最大釋放。CART細(xì)胞殺死表達(dá)EGFRvIII的MC38靶細(xì)胞，見圖2(a)-(b)。由圖2(b)可知，梭型的腫瘤細(xì)胞幾乎消失，CART細(xì)胞活化后聚集成團(tuán)。根據(jù)殺傷率計算公式計算得到的殺傷率見圖4。由圖4可知，LDH釋放實驗檢測CART的殺傷率與對照相比，CART細(xì)胞殺傷效果較好，表明Pre-Lenti-EF1-MCS-EGFRvIIICART殺傷功能較好。實施例3：動物實驗1、小鼠品系：為NSG免疫缺陷小鼠品系，免疫系統(tǒng)缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞功能。2、腫瘤接種：使用外源高表達(dá)EGFRvIII的BxPC-1腫瘤細(xì)胞系，3×106細(xì)胞/100ulPBS皮下注射8只小鼠，見圖5。3、CART注射：腫瘤細(xì)胞接種6天后，其中，4只小鼠為一組尾靜脈注射Control，另4只小鼠為一組尾靜脈注射EGFRvIIICART細(xì)胞(1×107細(xì)胞/200ulPBS)，見圖5。4、每隔2天觀察小鼠，測量體重，直至CART細(xì)胞注射22天后，EGFRvIIICART處理的4只小鼠皮下腫瘤消失。對腫瘤體積變化和體重變化作圖，見圖6、圖7。由圖6可知，CART細(xì)胞處理后，每隔2天測量腫瘤體積1次，對照組腫瘤生長至較大體積，而EGFRvIIICART處理組腫瘤生長被抑制。由圖7可知，每隔2天，測量小鼠體重，EGFRvIIICART注入小鼠體內(nèi)，沒有影響體重。綜上可見，EGFRvIIICART處理可以顯著抑制腫瘤生長。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。SEQUENCELISTING<110>北京普瑞金科技有限公司；普瑞金（深圳）生物技術(shù)有限公司<120>一種全人源化EGFRvIII嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法<130>2017<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>783<212>DNA<213>合成的ScFV基因<400>1atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccggacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagagtg120accatcacctgtcgggccagccagggcatcagaaacaacctggcctggtatcagcagaag180cccggcaaggcccccaagagactgatctacgctgccagcaatctgcagagcggcgtgccc240agcagattcaccggaagcggctccggcaccgagttcaccctgatcgtgtccagcctgcag300cccgaggacttcgccacctactactgcctgcagcaccacagctaccctctgaccagcggc360ggaggcaccaaggtggagatcaagcggaccggcagcaccagcggcagcggcaagcctggc420agcggcgagggaagcgaggtccaggtgctggaatctggcggcggactggtgcagcctggc480ggcagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgtct540tgggtccggcaggctcctggaaagggcctggaatgggtgtccgccatcagcggctctggc600ggctccaccaactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagc660aagaacaccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactac720tgtgccggcagcagcgggtggagcgagtactggggccagggcacactggtcacagtgtct780agc783<210>2<211>939<212>DNA<213>合成的3代CAR基因<400>2ccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcg60tcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcac120acgagggggctggacttcgccccacgcaaaattgaagttatgtatcctcctccttaccta180gacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagt240cccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctg300gcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagagg360agcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgc420aagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacggggc480agaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaa540gaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgaga600gtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctat660aacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgg720gaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat780gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc840cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc900tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa939<210>3<211>1722<212>DNA<213>EGFRvIIICAR基因<400>3atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60ccggacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagagtg120accatcacctgtcgggccagccagggcatcagaaacaacctggcctggtatcagcagaag180cccggcaaggcccccaagagactgatctacgctgccagcaatctgcagagcggcgtgccc240agcagattcaccggaagcggctccggcaccgagttcaccctgatcgtgtccagcctgcag300cccgaggacttcgccacctactactgcctgcagcaccacagctaccctctgaccagcggc360ggaggcaccaaggtggagatcaagcggaccggcagcaccagcggcagcggcaagcctggc420agcggcgagggaagcgaggtccaggtgctggaatctggcggcggactggtgcagcctggc480ggcagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgtct540tgggtccggcaggctcctggaaagggcctggaatgggtgtccgccatcagcggctctggc600ggctccaccaactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagc660aagaacaccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactac720tgtgccggcagcagcgggtggagcgagtactggggccagggcacactggtcacagtgtct780agcccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatc840gcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtg900cacacgagggggctggacttcgccccacgcaaaattgaagttatgtatcctcctccttac960ctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtcca1020agtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtc1080ctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaag1140aggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacc1200cgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccaaacgg1260ggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactact1320caagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg1380agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc1440tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc1500cgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtac1560aatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgag1620cgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggac1680acctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa1722<210>4<211>34<212>DNA<213>人工合成<400>4cggaattcgccaccatggccttaccagtgaccgc34<210>5<211>29<212>DNA<213>人工合成<400>5cgggatccttagcgagggggcagggcctg29<210>6<211>40<212>DNA<213>人工合成<400>6gtcgtggtgggcttcgctgggctagacactgtgaccagtg40<210>7<211>40<212>DNA<213>人工合成<400>7cactggtcacagtgtctagcccagcgaagcccaccacgac40<210>8<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>8ggagcctacctagactcagc20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>9caaccaggatttatacaagg20當(dāng)前第1頁1 2 3