本發(fā)明涉及新化合物及其抗菌應(yīng)用，具體涉及一類苯并吡喃類化合物及其抗細(xì)菌生物膜的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

吡喃類化合物是一種重要的含氧雜環(huán)化合物，很多天然化合物如香豆素、黃烷、黃酮、生物堿、紫檀素等中常出現(xiàn)這類結(jié)構(gòu)，具有廣泛的特性和應(yīng)用價值。吡喃類化合物中的兩個剛性環(huán)結(jié)構(gòu)使其在可見光區(qū)范圍內(nèi)具有很強(qiáng)的熒光性能，在熒光探針、熒光增白劑、熒光燃料，等功能材料方面應(yīng)用較好。此外，此類化合物具有良好的藥理活性和生物學(xué)活性，如抗氧化活性、抗凝血、抗腫瘤活性等，被廣泛應(yīng)用于抗凝劑、抗癌藥、抗過敏藥等多種藥劑，具有巨大的臨床應(yīng)用前景。

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌粘附于惰性表面，通過分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的膜樣聚合物。在臨床，生物膜可以在生物及非生物表面附著，如肺組織、植人物、心臟瓣膜、骨骼、牙齒及各種醫(yī)療設(shè)備。在細(xì)菌生物被膜的保護(hù)下，細(xì)菌可以增強(qiáng)自身對抗生素、環(huán)境壓力及宿主免疫系統(tǒng)攻擊的耐受能力，使其耐藥性提高10-1000倍。因此，細(xì)菌生物膜感染是臨床感染遷延不愈，病原菌難以徹底清除的重要原因。然而截止目前，尚未有抗細(xì)菌生物膜藥物應(yīng)用于臨床。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一類苯并吡喃類化合物。

所提供化合物結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示：

式ⅰ中：r＝3-f、4-f、3,5-2f、3,4,5-3f、4-cl、3,4-2cl、3-br或4-br。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述化合物作用于制備抗金黃色葡萄球菌生物膜制劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的化合物對金黃色葡萄球菌生物膜形成具有較強(qiáng)的抑制作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的化合物9的核磁共振圖譜；

圖2為本發(fā)明的化合物10的核磁共振圖譜；

圖3為本發(fā)明的化合物11的核磁共振圖譜；

圖4為本發(fā)明的化合物12的核磁共振圖譜；

圖5為本發(fā)明的化合物13的核磁共振圖譜；

圖6為本發(fā)明的化合物14的核磁共振圖譜；

圖7為本發(fā)明的化合物15的核磁共振圖譜；

圖8為本發(fā)明的化合物16的核磁共振圖譜；

圖9為化合物對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用；

圖10為化合物對金黃色葡萄球菌生物膜形成抑制作用的熒光染色觀察結(jié)果，其中c:空白對照、9-16分別為9-16號化合物，比例尺為20nm。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明合成了的系列新型吡喃類化合物，并針對臨床容易形成生物膜的金黃色葡萄球菌，評價化合物抑制細(xì)菌生物膜形成的活性。

本發(fā)明化合物的合成路線及方法為：

a：將適量的1,3-環(huán)己二酮，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩爾混合后加熱至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加熱回流3-4小時；

c：冷卻后固體析出，抽濾，固體再用無水乙醇重結(jié)晶，最終得純品。

實(shí)施例：

該實(shí)施例合成通式如式ⅱ所示的化合物：

其中：

(1)僅有苯環(huán)，即無取代基r；

(2)r＝2-no2,4-no2,2-cn,4-cn,5-cn,4-oh,4-ch3,3-f,4-f,3,5-2f,3,4,5-3f,4-cl,3,4-2cl,3-br,4-br。

合成方法為：

a：在250ml三口燒瓶中將適量的1,3-環(huán)己二酮，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩爾混合后加熱至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加熱回流3-4小時；

c：冷卻后固體析出，抽濾，固體再用無水乙醇重結(jié)晶，最終得純品。

結(jié)構(gòu)鑒定：

利用質(zhì)譜(ms)、核磁共振波譜(nmr)、紅外吸收光譜(ir)和紫外吸收光譜(uv)等有機(jī)波譜，對上述合成的系列新型吡喃類化合物進(jìn)行分子量、結(jié)構(gòu)和純度等鑒定。

鑒定結(jié)果為：

化合物1：

2-amino-5-oxo-4-phenyl-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:

1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.269-7.306(t,2h),7.146-7.205(m,3h),7.019(s,2h),4.183(s,1h),2.599-2.640(q,2h),2.226-2.318(m,2h),1.876-1.988(m,2h).

化合物2：

2-amino-4-(2-nitrophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.800-7.823(q,1h),7.634-7.656(q,1h),7.374-7.451(m,2h),7.202(s,2h),4.933(s,1h),2.578-2.608(t,2h),2.133-2.255(m,2h),1.824-1.953(m,2h).

化合物3：

2-amino-4-(4-nitrophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):8.156-8.178(d,2h),7.454-7.475(d,2h),7.199(s,2h),4.366(s,1h),2.624-2.654(t,2h),2.255-2.330(m,2h),1.913-1.978(m,2h).

化合物4：

2-amino-4-(2-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.750-7.769(d,1h),7.612-7.635(q,1h),7.377-7.419(q,2h),7.191(s,2h),4.525(s,1h),2.606-2.619(d,2h),2.224-2.315(m,2h),1.906-1.983(m,2h).

化合物5：

2-amino-4-(4-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.759-7.780(d,2h),7.366-7.386(d,2h),7.159(s,2h),4.293(s,1h),2.607-2.632(t,2h),2.253-2.322(m,2h),1.907-1.970(m,2h).

化合物6：

2-amino-4-(3-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.662–7.678(d,1h),7.626(s,1h),7.509–7.525(d,2h),7.104(s,2h),4.289(s,1h),2.591–2.683(m,2h),2.228–2.311(m,2h),1.922–1.962(q,2h).

化合物7：

2-amino-4-(4-hydroxyphenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):9.263(s,1h),6.926-6.947(q,4h),6.644-6.665(q,2h),4.074(s,1h),2.573-2.606(q,2h),2.214-2.302(m,2h),1.854-1.973(m,2h).

化合物8：

2-amino-4-(4-methylphenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):6.989-7.073(m,6h),4.138(s,1h),2.585-2.623(m,2h),2.250-2.305(m,5h),1.869-1.978(m,2h).

化合物9：

2-amino-4-(3-fluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.310-7.365(m,1h),7.088(s,2h),7.008-7.049(m,2h),6.941-6.976(m,1h),4.231(s,1h),2.610-2.651(q,2h),2.270-2.322(m,2h),1.922-1.967(q,2h).

化合物10：

2-amino-4-(4-fluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.178-7.214(q,2h),7.084-7.128(t,2h),7.051(s,2h),4.210(s,1h),2.592-2.627(q,2h),2.252-2.314(m,2h),1.885-1.961(m,2h).

化合物11：

2-amino-4-(3,5-difluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.144(s,2h),7.042-7.088(m,1h),6.878-6.904(q,2h),4.267(s,1h),2.601-2.660(q,2h),2.281-2.324(m,2h),1.924-1.966(q,2h).

化合物12：

2-amino-4-(3,4,5-trifluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.130-7.168(t,4h),4.264(s,1h),2.580-2.678(m,2h),2.272-2.317(q,2h),1.933-1.979(q,2h).

化合物13：

2-amino-4-(4-chlorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.335-7.356(d,2h),7.177-7.199(d,2h),7.081(s,2h),4.202(s,1h),2.593-2.626(t,2h),2.248-2.313(m,2h),1.875-1.980(m,2h).

化合物14：

2-amino-4-(3,4-dichlorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.549-7.570(d,1h),7.409-7.414(d,1h),7.153-7.163(d,3h),4.249(s,1h),2.589-2.642(q,2h),2.260-2.315(m,2h),1.902-1.957(m,2h).

化合物15：

2-amino-4-(3-bromophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.388-7.409(q,1h),7.320-7.329(t,1h),7.249-7.287(t,1h),7.166-7.186(d,1h),7.116(s,2h),4.209(s,1h),2.594-2.651(m,2h),2.266-2.319(m,2h),1.907-1.963(q,2h).

化合物16：

2-amino-4-(4-bromophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.469-7.490(q,2h),7.120-7.141(q,2h),7.084(s,2h),4.187(s,1h),2.612-2.625(d,2h),2.247-2.313(m,2h),1.874-1.980(m,2h).

上述實(shí)施例制備的化合物對細(xì)菌生物膜作用的形態(tài)學(xué)研究：

(1)結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)過程如下：

a：分別從劃線培養(yǎng)的m-h瓊脂培養(yǎng)基上挑取不同實(shí)驗(yàn)菌株的單克隆菌落，接種于4ml的tsb培養(yǎng)基中，以220r/min，37℃的條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

b：在96孔板每孔中加入100μl的m-h肉湯培養(yǎng)基，吸取100μl的菌液加入第1孔中吹打混勻后吸取100μl加入第2孔中，依次類推，最后1孔混勻后吸取100μl棄去。

c：在酶標(biāo)儀上選定630nm檢測，記錄od630值為0.1時菌液所稀釋的倍數(shù)(此時菌液濃度約為10⁸cfu/ml)，將菌液用含2％葡萄糖的tsb培養(yǎng)基稀釋至相對應(yīng)的倍數(shù)后再按1：100的比例向菌液稀釋至10⁶cfu/ml。

d：向96孔板每孔分別加入tsb溶解的濃度為8μg/ml上述各化合物100μl后，加入已制備的濃度為10⁶cfu/ml的菌液100μl，取一排孔加入200μl含2％葡萄糖的tsb培養(yǎng)基作為空白對照，將96孔板放入37℃孵箱恒溫孵育24h。

e：吸去上清，用0.01m的pbs洗三遍，每孔加入150μl甲醇固定30min，輕柔棄去甲醇，加入150μl1％的結(jié)晶紫溶液染色15min。

f：輕柔吸去結(jié)晶紫溶液，用0.01m的pbs輕洗3遍，放入烘箱烘干，每孔加入33％冰醋酸溶液150μl，使用酶標(biāo)儀在630nm處測吸光度。

將沒有經(jīng)過化合物處理的細(xì)菌作為空白對照組(c)，和對照組相比，化合物1,2,3,4,5,6,7,8在濃度為8μg/ml時，對生物膜的形成沒有抑制作用(p>0.05)?；衔?,10,11,12,13,14,15,16在濃度為8μg/ml時，對生物膜的形成具有顯著的抑制作用(p<0.05)，如圖9所示。

(2)熒光染色實(shí)驗(yàn)過程如下：

a：取指數(shù)生長期耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)usa300，用含有0.5％葡萄糖的tsb培養(yǎng)基稀釋后接種到24孔板，每孔1ml。

b：向24孔板每孔中加入8μg/ml的化合物9,10,11,12,13,14,15和16，對照孔不加化合物，培養(yǎng)24h。

c：向每孔中加入10mg/ml異硫氰酸熒光素(fitc)染料孵育細(xì)菌2h,離心后棄上清液，用pbs緩沖液漂洗細(xì)菌3次。

d：熒光顯微鏡488mm波長處觀察細(xì)菌生物膜的形態(tài)。

和空白對照組(c)相比，8μg/ml的化合物9,10,11,12,13,14,15,16能明顯抑制生物膜的形成，如圖10所示。