本發(fā)明屬于醫(yī)藥及保健品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛膝糖聚合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,op)是一種以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)受到破壞，同時(shí)骨強(qiáng)度降低，從而引起骨的脆性增加和容易于發(fā)生骨折為特征的一種疾病。目前防治骨質(zhì)疏松癥的藥物主要是骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和礦化藥物，這些藥物均屬替代治療，在長(zhǎng)期使用過(guò)程中，存在毒副作用大，靶向性低，依從性差，費(fèi)用高等缺點(diǎn)。因此，有必要找尋到一種高效、低毒的藥物來(lái)治療骨質(zhì)疏松癥。

牛膝(achyranthesbidentatablume)為莧科植物牛膝的干燥根，被稱為“四大懷藥”之一，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效；其主要用于筋骨無(wú)力、腰膝酸痛、肝陽(yáng)眩暈等癥。另外，牛膝還作為活血化瘀的傳統(tǒng)中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，其藥理作用較為廣泛，具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和促進(jìn)胃腸的興奮性等功效。中醫(yī)上有“腎藏精，主骨”的理論，所以一般運(yùn)用補(bǔ)腎法作為治療骨質(zhì)疏松癥，已經(jīng)證實(shí)療效顯著。作為滋補(bǔ)腎精類中藥，懷牛膝在治療骨質(zhì)疏松癥方面的運(yùn)用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。

高昌琨在現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐發(fā)表的論文《懷牛膝對(duì)維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松防治作用的實(shí)驗(yàn)研究》中提到“懷牛膝水煎液能夠在一定程度提高大鼠的活動(dòng)能力，使得骨中有機(jī)質(zhì)的含量增加，繼而提高骨密度”。同時(shí)，牛膝糖聚合物作為牛膝的主要活性成分之一，其結(jié)構(gòu)和活性的報(bào)道較少，因此，有必要提供一種提取純化、結(jié)構(gòu)鑒定的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種牛膝糖聚合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，可大規(guī)模生產(chǎn)；且本發(fā)明對(duì)得到的高純度牛膝糖聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，明確了其成分，為探究其藥理活性機(jī)制提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。同時(shí)，本發(fā)明得到的牛膝糖聚合物純品為牛膝糖聚合物藥物、質(zhì)量控制及深入研究其構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供了一種牛膝糖聚合物，包括牛膝糖聚合物abp3-2，牛膝糖聚合物abw1-1，牛膝糖聚合物abp1-2，牛膝糖聚合物abp4-3。本發(fā)明人通過(guò)對(duì)牛膝糖聚合物粗品提純分離得到牛膝糖聚合物abp3-2，abw1-1，abp1-2，abp4-3，且經(jīng)結(jié)構(gòu)分析得到其分子量范圍為1000-100000da。

進(jìn)一步地，所述牛膝糖聚合物abp3-2的結(jié)構(gòu)為：

其中n為1～6或8～30。

進(jìn)一步地，所述牛膝糖聚合物abw1-1的結(jié)構(gòu)為：

其中x為2～30，y為2～30。

進(jìn)一步地，所述牛膝糖聚合物abp1-2的結(jié)構(gòu)為：

其中n為1～6或8～30，m為1～11或13～30。

進(jìn)一步地，所述牛膝糖聚合物abp4-3的結(jié)構(gòu)為：

其中n為1～30，m為1～30，x為1～30，y為1～30。

同時(shí)，本發(fā)明也提供了一種牛膝糖聚合物的制備方法，包括以下步驟：

s1剪切：將牛膝干燥根切成小段，用水清洗干凈、晾干，得牛膝段；

s2水提：將步驟s1所得牛膝段加入水中，加熱提取，過(guò)濾，得提取液和藥渣；

s3分級(jí)醇沉：

將步驟s2所得提取液減壓濃縮，得濃縮液1；向濃縮液1中加入乙醇，至乙醇體積濃度為a％，靜置，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab1和上清液1；

將上清液1減壓濃縮，得濃縮液2；向濃縮液2中加入乙醇，至乙醇體積濃度為b％，靜置，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab2和上清液2；

將上清液2減壓濃縮，得濃縮液3；向濃縮液3中加入乙醇，至乙醇體積濃度為c％，靜置，收集沉淀，得粗糖聚合物ab3；

其中10≤a＜b＜c＜100；

s4堿提：

將步驟s2所得藥渣浸泡于0.1～1m的naoh溶液中，靜置1～10h，收集上清液，得上清液3；

向上清液3中加入0.1～1m的hcl至溶液ph為5～9，離心，收集上清液，減壓濃縮，得濃縮液4；向濃縮液4中加入乙醇，至乙醇體積濃度為50～90％，靜置，收集沉淀，得堿提粗糖聚合物ab4；

s5純化：

一次純化：將步驟s3、s4所得粗糖聚合物ab1、ab2、ab3、ab4進(jìn)行除蛋白，透析，凍干，得牛膝糖聚合物；

二次純化：

將一次純化后的糖聚合物ab1、ab3、ab4進(jìn)行離子交換柱層析，用0～2m的nacl進(jìn)行梯度洗脫，使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線分別收集糖部分，濃縮、冷凍干燥；再分別用水進(jìn)行溶解，離心，取上清液；

將上清液再進(jìn)行分子篩凝膠柱層析，用水進(jìn)行洗脫，利用苯酚-硫酸法檢測(cè)洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集糖部分，濃縮、冷凍干燥，得abw1-1、abp1-2、abp3-2、abp4-3。

本發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)牛膝段的優(yōu)選長(zhǎng)度為1～3cm；同時(shí)，本發(fā)明采用水提分級(jí)醇沉法和堿提醇沉法的結(jié)合，乙醇濃度由低到高進(jìn)行分級(jí)醇沉，對(duì)牛膝糖聚合物進(jìn)行初步分離，且高濃度乙醇能將極性大、水溶性好的糖聚合物與極性小、水溶性差的糖聚合物分離，解決了傳統(tǒng)水煮法提取糖聚合物導(dǎo)致其后期分離繁雜、困難的問(wèn)題。

進(jìn)一步地，所述步驟s2中水的添加量為所述牛膝段重量的5～15倍，加熱溫度為60～100℃，提取時(shí)間1～10h。

進(jìn)一步地，所述步驟s3、s4中減壓濃縮溫度為40～70℃，靜置的時(shí)間為10～28h，naoh溶液用量為藥渣重量的5～20倍。

另外，本發(fā)明還提供了一種牛膝糖聚合物的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)取牛膝糖聚合物樣品，完全酸水解，水解產(chǎn)物離子色譜/液相色譜檢測(cè)；

(2)取牛膝糖聚合物樣品，干燥，壓片，紅外光譜檢測(cè)；

(3)取牛膝糖聚合物樣品，甲基化，水解、還原，乙酰化，進(jìn)行g(shù)c-ms檢測(cè)；

(4)取牛膝糖聚合物樣品溶于d2o，進(jìn)行核磁共振分析。

本發(fā)明人為了進(jìn)一步開發(fā)牛膝這一寶貴資源，發(fā)掘新藥源，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究得到本發(fā)明：以牛膝干燥根為原料，采用水提醇沉法和堿提醇沉法得到粗糖聚合物，對(duì)提取的粗糖聚合物進(jìn)行脫蛋白，然后利用離子交換層析和凝膠分子篩柱層析方法純化牛膝粗糖聚合物，首次制備出四種牛膝糖聚合物純品，對(duì)四種組分糖聚合物純品的理化性質(zhì)、分子量、單糖組成等進(jìn)行了系統(tǒng)的分析鑒定，成功得出了四個(gè)組分的結(jié)構(gòu)信息，其中牛膝糖聚合物abp3-2由葡萄糖和果糖組成的果聚糖，主鏈由→2)-α-d-fruf-(6→組成，支鏈由→2)-β-d-fruf-(1→組成，末端糖殘基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf組成；牛膝糖聚合物abw1-1由葡萄糖和果糖組成的果聚糖，主鏈由→2)-α-d-fruf-(1→組成，支鏈由→2)-β-d-fruf-(6→組成，末端糖殘基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf組成；牛膝糖聚合物abp1-2由葡萄糖和果糖組成的果聚糖，主鏈由→2)-α-d-fruf-(1→組成，支鏈由→2)-β-d-fruf-(6→組成，末端糖殘基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf組成；牛膝糖聚合物abp4-3由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和半乳糖醛酸組成的雜多糖，主鏈由→4)-α-d-galpa-(1→和→2,4)-α-d-galpa-(1→組成，支鏈包括→5)-α-l-araf-(1→、→3)-α-l-araf-(1→、→2,3,5)-α-l-araf-(1→、→6)-β-d-galp-(1→、→3,6)-β-d-galp-(1→、α-l-araf-(1→、α-l-rhap-(1→和β-d-galp-(1→。

本發(fā)明還涉及了牛膝糖聚合物在制備治療骨質(zhì)疏松藥物或保健品中的應(yīng)用。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)其抗骨質(zhì)疏松活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：

1.本發(fā)明采用水提醇沉法和堿提醇沉法的結(jié)合，對(duì)牛膝糖聚合物進(jìn)行初步分離，效果顯著，且本制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，可大規(guī)模生產(chǎn)；

2.本發(fā)明通過(guò)柱層析法對(duì)牛膝粗糖聚合物進(jìn)行二次分離純化，效果顯著，首次制備出四種牛膝糖聚合物純品；

3.本發(fā)明對(duì)純化得到的四種糖聚合物純品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，明確了各糖聚合物組分的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，為探究其藥理活性機(jī)制提供結(jié)構(gòu)依據(jù)；

4.本發(fā)明得到的牛膝糖聚合物純品，組分保存完好，結(jié)構(gòu)明確，質(zhì)量可控，在斑馬魚骨質(zhì)疏松模型中顯示具有抗骨質(zhì)疏松活性，為牛膝糖聚合物在醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)；

5.同時(shí)，本發(fā)明為牛膝糖聚合物藥物、質(zhì)量控制及深入研究其構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為abp3-2的離子色譜圖譜圖；

圖2為abp3-2的紅外圖譜；

圖3為abp3-2的¹hnmr圖譜；

圖4為abp3-2的¹³cnmr圖譜；

圖5為abp3-2的hsqc圖譜；

圖6為abp3-2的hmbc圖譜；

圖7為abw1-1的hplc圖譜；

圖8為abw1-1的紅外圖譜；

圖9為abw1-1的¹hnmr圖譜；

圖10為abw1-1的¹³cnmr圖譜；

圖11為abw1-1的hsqc圖譜；

圖12為abw1-1的hmbc圖譜；

圖13為abp1-2的離子色譜圖譜圖譜；

圖14為abp1-2的紅外圖譜；

圖15為abp1-2的¹hnmr圖譜；

圖16為abp1-2的¹³cnmr圖譜；

圖17為abp1-2的hsqc圖譜；

圖18為abp1-2的hmbc圖譜；

圖19為abp4-3的hplc圖譜；

圖20為abp4-3的紅外圖譜；

圖21為abp4-3的¹hnmr圖譜；

圖22為abp4-3的¹³cnmr圖譜；

圖23為abp4-3的hsqc圖譜；

圖24為abp4-3的hmbc圖譜；

圖25為斑馬魚經(jīng)abw1-1處理后頭部骨骼鈣黃綠素染色的圖像；

圖26為斑馬魚經(jīng)abw1-1處理后頭部骨骼相對(duì)熒光強(qiáng)度的定量分析；

圖27為斑馬魚經(jīng)abp4-3處理后頭部骨骼鈣黃綠素染色的圖像；

圖28為斑馬魚經(jīng)abp4-3處理后頭部骨骼相對(duì)熒光強(qiáng)度的定量分析。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，需要指出的是，以下說(shuō)明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說(shuō)明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。

實(shí)施例1牛膝糖聚合物的制備方法

所述牛膝糖聚合物的制備方法包括以下步驟：

s1剪切：將10kg的牛膝干燥根用剪刀剪至1～3cm，用冷水快速清洗，晾干，得牛膝段；

s2水提：向步驟s1所得牛膝段中加入其重量10倍的水，加熱至80℃提取，提取2h，收集提取液，藥渣晾干，得提取液和藥渣；

s3分級(jí)醇沉：

將步驟s2所得提取液于60℃減壓濃縮后，加入乙醇至乙醇體積濃度為50％，室溫靜置24h后，離心，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab1和上清液1；

上清液1于60℃減壓濃縮后，加入乙醇至乙醇體積濃度為70％，室溫靜置24h后，離心，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab2和上清液2；

上清液2于60℃減壓濃縮后，加入乙醇至乙醇體積濃度為90％，室溫靜置24h后，離心，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab3；

s4堿提：

向步驟s2所得藥渣中加入其重量15倍的0.3m的naoh溶液，室溫放置2h，收集上清液，得上清液3；

向上清液3中加入0.1～1m的hcl至溶液ph為6～8，離心(5000r/min，10min)，收集上清液，60℃減壓濃縮，然后加入乙醇至乙醇體積濃度為75％，靜置24h后離心，收集沉淀，得堿提粗糖聚合物ab4；

s5純化：利用sevag法分別將步驟s3、s4所得ab1、ab2、ab3、ab4粗糖聚合物進(jìn)行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量為1000da)進(jìn)行透析、凍干，得牛膝糖聚合物(牛膝糖聚合物ab1、ab2、ab3、ab4)。

實(shí)施例2牛膝糖聚合物abp3-2

所述牛膝糖聚合物abp3-2是由實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab3二次純化所得，具體方法如下：

1)離子交換柱層析：取100mg實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab3，溶于5ml的去離子水中，上樣于deae-cellulose52柱，在不同鹽濃度的洗脫液條件下出現(xiàn)2個(gè)峰，其中峰一為水(0m的nacl)洗脫部分，峰二為0.1m的nacl洗脫部分(洗脫過(guò)程中使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線分別收集糖部分)，分別將所得洗脫液濃縮、冷凍干燥后，得到兩種糖聚合物(峰一糖聚合物、峰二糖聚合物)；

2)分子篩凝膠層析：將上述凍干后的峰二糖聚合物樣品，用水進(jìn)行溶解，離心，取上清液，上sephacryls-100hr柱，用水進(jìn)行洗脫，使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，出現(xiàn)一個(gè)單一對(duì)稱峰，收集主峰，濃縮，冷凍干燥，得牛膝糖聚合物abp3-2。

實(shí)施例3牛膝糖聚合物abw1-1

所述牛膝糖聚合物abw1-1是由實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab1二次純化所得，具體方法如下：

離子交換柱層析：取100mg實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab1，溶于5ml的去離子水中，上樣于deae-cellulose52柱，在不同鹽濃度的洗脫液條件下出現(xiàn)2個(gè)峰，其中峰一為水(0m的nacl)洗脫部分，峰二為0.1m的nacl洗脫部分(洗脫過(guò)程中使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線分別收集糖部分)，收集峰一洗脫液，濃縮、冷凍干燥，得牛膝糖聚合物abw1-1。

實(shí)施例4牛膝糖聚合物abp1-2

所述牛膝糖聚合物abp1-2是由實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab1二次純化所得，具體方法如下：

離子交換柱層析：取100mg實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab1，溶于5ml的去離子水中，上樣于deae-cellulose52柱，在不同鹽濃度的洗脫液條件下出現(xiàn)2個(gè)峰，其中峰一為水(0m的nacl)洗脫部分，峰二為0.1m的nacl洗脫部分(洗脫過(guò)程中使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線分別收集糖部分)，收集峰二洗脫液，濃縮、冷凍干燥，得牛膝糖聚合物abp1-2。

實(shí)施例5牛膝糖糖聚合物abp4-3

所述牛膝糖聚合物abp4-3是由實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab4二次純化所得，具體方法如下：

1)離子交換柱層析：取100mg實(shí)施例1所得牛膝糖聚合物ab4，溶于5ml的去離子水中，上樣于deae-cellulose52柱，在不同鹽濃度的洗脫液條件下出現(xiàn)4個(gè)峰，其中峰一為0.05m的nacl洗脫部分，峰二為0.1m的nacl洗脫部分，峰三為0.15m的nacl洗脫部分，峰四為0.2m的nacl洗脫部分(洗脫過(guò)程中使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線分別收集糖部分)，分別將所得洗脫液濃縮、冷凍干燥后，得到四種糖聚合物；

6)分子篩凝膠層析：將上述凍干后的峰三糖聚合物樣品，用水進(jìn)行溶解，離心，取上清液，上sephacryls-100hr柱，用水進(jìn)行洗脫，使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，出現(xiàn)一個(gè)單一對(duì)稱峰，收集主峰，濃縮，冷凍干燥，得牛膝糖聚合物abp4-3。

試驗(yàn)例一、牛膝糖聚合物abw1-1、abp1-2、abp3-2和abp4-3的結(jié)構(gòu)分析

(一)試驗(yàn)材料：牛膝糖聚合物abw1-1、abp1-2、abp3-2和abp4-3。

(二)試驗(yàn)方法：

1.單糖組成分析

(1)pmp柱前衍生化hplc分析

樣品處理：

精確稱取4.0mg試驗(yàn)材料于具塞試管中，加入2m三氟乙酸(tfa)2.0ml，充n2封管，置于油浴鍋中在120℃油浴水解6h。冷卻至室溫，重復(fù)加甲醇旋干，去除tfa，用去離子水溶解至1ml，離心，各吸取100μl樣品溶液，加入100μl0.3m的naoh溶液，再加入100μl0.5mpmp甲醇溶液，混勻，70℃水浴鍋上反應(yīng)30min，冷卻，加入105μl0.3m的hcl溶液中和，加去離子水至1ml，再加入等體積的氯仿溶液，劇烈震搖，離心，去氯仿相，如此反復(fù)2次萃取，取水相用0.45μm濾膜過(guò)濾后供hplc進(jìn)樣分析。

色譜條件：

色譜柱：agilentzorbaxeclipsexdb-c18，4.6×250mm，5μm；流動(dòng)相：0.1m磷酸鹽(ph＝6.9)緩沖液-乙腈(v/v為83：17)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；流速：1ml/min；進(jìn)樣體積：20μl。

(2)高效離子色譜分析

樣品處理：

精密稱取4.0mg試驗(yàn)材料于具塞試管中加入2mtfa2ml，在120℃中恒溫油浴6h，冷卻至室溫，重復(fù)加甲醇旋干以去除tfa，用蒸餾水溶解至1ml，0.45μm濾膜過(guò)濾，供離子色譜分析。

色譜條件：

色譜柱：dionexcarbopacpa10，規(guī)格250×4mm；流動(dòng)相：水-200mmnaoh溶液(v/v為92:8)，流速為1.0ml/min；進(jìn)樣體積為20μl，柱溫為30℃。

2.紅外光譜檢測(cè)

將干燥的試驗(yàn)材料2.0mg與kbr研磨后，壓片，用perkineimerft/ir-100在4000-450cm^-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

3.甲基化/gc-ms分析

稱取干燥的試驗(yàn)材料8.0mg于反應(yīng)瓶中，加入無(wú)水dmso8ml，再加入干燥的氫氧化鈉800mg，磁力攪拌10min，冰浴條件下，通入n2避光加入碘甲烷4.5ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h，然后加入2ml的蒸餾水分解殘留的碘甲烷，用蒸餾水透析24h，減壓濃縮，樣品烘干后用1ml氯仿溶解。

甲基化完全后置于具塞試管中用2mol/l的tfa在120℃恒溫油浴水解6h，減壓蒸發(fā)至干，再重復(fù)多次加入甲醇旋干至ph為中性，然后用20mg的nabh4在40℃下反應(yīng)30min還原水解產(chǎn)物。再使用100μl的冰醋酸終止反應(yīng)，樣品在低壓下旋干，然后加入2ml的乙酰酐和吡啶用來(lái)乙酰化。保持95℃磁力攪拌反應(yīng)2h。然后反復(fù)加甲苯3次，旋干，用1ml氯仿溶解，再用等體積的蒸餾水洗滌4次，除去水層，最后用無(wú)水硫酸鈉干燥氯仿層，再過(guò)濾除去硫酸鈉固體，減壓濃縮蒸干，供gc-ms分析。

4.核磁共振分析

取各牛膝糖聚合物樣品30mg溶于0.6mld2o中，反復(fù)多次凍干后，置于核磁管中，用500mhz核磁共振儀brukerav-500記錄其¹hnmr，¹³cnmr，hsqc，hmbc等圖譜。

(三)試驗(yàn)結(jié)果：

1.牛膝糖聚合物abp3-2結(jié)構(gòu)分析

(1)單糖組成分析

如圖1所示，由完全酸水解產(chǎn)物hpaec-pad圖譜可知，abp3-2是由葡萄糖和果糖組成。圖a為各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的hpaec-pad圖譜，1：鼠李糖，2：阿拉伯糖，3：半乳糖，4：葡萄糖，5：甘露糖/木糖，6：果糖。圖b為abp3-2的hpaec-pad圖譜，1：葡萄糖，2：果糖。

(2)紅外光譜分析

如圖2所示，由abp3-2紅外光譜圖可知，abp3-2含有糖聚物的特征吸收峰：3368cm^-1為o-h伸縮振動(dòng)，2936cm^-1為c-h伸縮振動(dòng)，1642cm^-1為羰基吸收峰。1740cm^-1區(qū)間未見吸收峰說(shuō)明abp3-2不含有糖醛酸，929cm^-1和815cm^-1為呋喃環(huán)的特征吸收峰；871cm^-1處有吸收峰，說(shuō)明abp3-2為主要由β型糖殘基組成。

(3)甲基化/gc-ms分析

abp3-2甲基化分析，經(jīng)過(guò)水解，還原乙?；?，gc-ms檢測(cè)，由gc-ms圖譜可知，abp3-2含有→1)-β-d-fruf-(2→和→2)-β-d-fruf-(6→糖殘基。

(4)核磁共振分析

本試驗(yàn)通過(guò)¹hnmr、¹³cnmr、hsqc對(duì)abp3-2的糖殘基的碳原子和氫原子的化學(xué)位移進(jìn)行歸屬，然后用hmbc確認(rèn)其連接順序。圖4-7為abp3-2的¹hnmr、¹³cnmr、hsqc和hmbc圖譜。

根據(jù)圖3-6的核磁圖譜可知各個(gè)碳和氫的歸屬，如下表1所示。

表1abw3-1核磁共振分析結(jié)果

^aunresolvedfromothersignals.

綜上所述：abp3-2是一種由葡萄糖和果糖組成的果聚糖，從甲基化分析說(shuō)明其含有→1)-β-d-fruf-(2→和→2)-β-d-fruf-(6→糖殘基，不同糖殘基之間的連接順序由二維核磁hmbc譜圖分析得出，由以上分析得出abp3-2的結(jié)構(gòu)為：

其中n為1～6或8～30。

2.牛膝糖聚合物abw1-1、abp1-2和abp4-3的結(jié)構(gòu)分析

同理，分別對(duì)糖聚合物abw1-1、abp1-2、abp4-3的結(jié)構(gòu)進(jìn)行上述同樣的分析，并分別獲得以下信息：

(1)由圖7-12可知，牛膝糖聚合物abw1-1是由葡萄糖和果糖組成的果聚糖，主鏈由→2)-α-d-fruf-(1→組成，支鏈由→2)-β-d-fruf-(6→組成，末端糖殘基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf組成，abw1-1結(jié)構(gòu)為：

其中x為2～30，y為2～30。

(2)由圖13-18可知，牛膝糖聚合物abp1-2是由葡萄糖和果糖組成的果聚糖，主鏈由→2)-α-d-fruf-(1→組成，支鏈由→2)-β-d-fruf-(6→組成，末端糖殘基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf組成，abp1-2結(jié)構(gòu)為：

其中n為1～6或8～30，m為1～11或13～30。

(3)由圖19-24可知，牛膝糖聚合物abp4-3是由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和半乳糖醛酸組成的雜多糖，主鏈由→4)-α-d-galpa-(1→和→2,4)-α-d-galpa-(1→組成，支鏈包括→5)-α-l-araf-(1→、→3)-α-l-araf-(1→、→2,3,5)-α-l-araf-(1→、→6)-β-d-galp-(1→、→3,6)-β-d-galp-(1→、α-l-araf-(1→、α-l-rhap-(1→和β-d-galp-(1→，abpb-3結(jié)構(gòu)為：

其中n為1～30，m為1～30，x為1～30，y為1～30。

試驗(yàn)例二、牛膝糖聚合物純品的抗骨質(zhì)疏松作用研究

(一)試驗(yàn)材料：牛膝糖聚合物abw1-1、abp4-3。

(二)試驗(yàn)對(duì)象：斑馬魚幼魚，購(gòu)于上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，60只。

(三)試驗(yàn)方法：

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組：

本發(fā)明采用斑馬魚動(dòng)物模型，以糖皮質(zhì)激素潑尼松龍為模型藥，建立一種快速，高效的骨質(zhì)疏松模型。將受精后3天的斑馬魚胚胎暴露于25μm的潑尼松龍溶液中，28.5℃下在6孔板中培養(yǎng)96h，至斑馬魚頭部骨骼形成，設(shè)模型組、空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、給藥組。用此模型觀察牛膝糖聚合物abw1-1及abp4-3對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的防治作用。各組動(dòng)物和給藥方法見表2，其中陽(yáng)性藥aln為阿侖膦酸鈉，陰性對(duì)照組為0.1％dmso。造模后暴露給藥，給藥后連續(xù)培養(yǎng)96h。

表2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

2.斑馬魚胚胎收集與培養(yǎng)

控制斑馬魚成魚日夜節(jié)奏，晝夜時(shí)間控制在14h:10h，收集斑馬魚受精卵，置于培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基(0.2％的速溶海鹽溶于去離子水中)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28.5℃。

3.牛膝糖聚物對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的影響

將受精后3天的斑馬魚幼魚放入6孔板中，加入培養(yǎng)基，每孔放10條幼魚，分為陰性對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，給藥組，每組做3份。受精后第4天開始根據(jù)表2方法給藥，將6孔板密封放入28.5℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)96h，培養(yǎng)過(guò)程中斑馬魚幼魚不喂食。

4.鈣黃綠素染色

給藥結(jié)束后，將受精后7天的斑馬魚幼魚用養(yǎng)魚水反復(fù)沖洗三次，浸沒(méi)于0.2％的鈣黃綠素溶液中5min，然后幼魚再用養(yǎng)魚水反復(fù)徹底沖洗三次(5min/次)，用0.016％ms-222麻醉致死，用3％的甲基纖維素固定幼魚，熒光顯微鏡下觀察。5.圖像采集以及頭部骨骼定量分析

nikonsmz1500熒光倒置顯微鏡觀察鈣黃綠素染色的斑馬魚頭骨腹面，其配套的成像軟件采集圖像，所有的圖像均采用相同的光強(qiáng)和曝光設(shè)置，圖像最后使用adobephotoshop7.0軟件調(diào)節(jié)處理。專業(yè)的形態(tài)分析軟件nis-elementsd3.1測(cè)定受精后7天斑馬魚幼魚頭部骨骼的相對(duì)熒光強(qiáng)度rfi(relativefluorescenceintensity)，以反映骨密度。

(四)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.潑尼松龍誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松斑馬魚鈣黃綠素染色圖像

牛膝糖聚合物對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松斑馬魚進(jìn)行鈣黃綠素染色，結(jié)果見圖25、27。如圖所示，25μm潑尼松龍?zhí)幚砗?，相?duì)于con組，受精7天后的斑馬魚幼魚頭部骨骼的鈣黃綠素的染色面積和染色強(qiáng)度明顯減少，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素潑尼松龍誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型成功。與pre組比較，牛膝糖聚合物abw1-1以及abp4-3給藥組明顯增強(qiáng)斑馬魚幼魚頭部骨骼的染色面積以及染色強(qiáng)度，說(shuō)明牛膝糖聚合物abw1-1和abp4-3對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松具有良好的治療效果。

2.潑尼松龍誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松斑馬魚相對(duì)熒光強(qiáng)度定量分析

牛膝糖聚合物對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松斑馬魚頭部骨骼的相對(duì)熒光強(qiáng)度定量分析見圖26、28。如圖所示，與con組比較，模型組斑馬魚頭部骨骼的相對(duì)熒光強(qiáng)度極顯著地減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0001)，說(shuō)明潑尼松龍誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型成功。與pre組比較，牛膝糖聚合物abw1-1和abp4-3均可極顯著性提高斑馬魚頭部骨骼的相對(duì)熒光強(qiáng)度，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0001)，說(shuō)明牛膝糖聚合物abw1-1和abp4-3對(duì)潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松具有良好的治療效果。

綜上所述，本發(fā)明制備的牛膝糖聚合物純品abw1-1和abp4-3均能顯著增加糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松斑馬魚頭部骨骼的相對(duì)熒光強(qiáng)度，明顯增強(qiáng)斑馬魚頭部骨骼鈣黃綠素染色面積以及染色強(qiáng)度，從而發(fā)揮其治療骨質(zhì)疏松癥的作用。