本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術領域，具體地說，涉及一種蝙蝠蛾被毛孢菌絲體及其發(fā)酵技術。
背景技術：
冬蟲夏草(cordyceps(berk)sacco.)為冬蟲夏草菌的子座以及它的寄主蟲草蝙蝠蛾(hepialusarmoricanusoberthur)等幼蟲尸體殼的復合體，冬蟲夏草的菌子座是麥角菌科(clavicipiraceae)蟲草屬(cordyceps)。冬蟲夏草主要產于我國的青海、西藏、云南、貴州、四川等海拔3500-5000m山中的草甸土中，為中國特產的名貴中藥材。蟲草由我國傳到西方己有270年歷史。1878年意大利學者saccardo將蟲草學名定為cordycepssinensis(berkeley)sacc，意為中國蟲草。其味甘性平，以全草入藥。主要功效可保肺腎、補精髓、化痰止勞咳。用于肺腎兩虛癥，治療肺結核、老人畏寒、咳嗽、衰弱、產婦及老人貧血、慢性腎炎等。常食冬蟲草夏還可促進消化，調節(jié)免疫功能，增強人體對多種疾病的抵抗力。
國內外有一些人認為冬蟲夏草就是由蟲草屬真菌寄生而且能夠產生子座的菌物的結合體的通稱。然而我國傳統的中醫(yī)藥學以及絕大多數的學者所指明的冬蟲夏草是分布在我國云貴高原、青藏高原以及邊緣地區(qū)的高寒草甸，由中國被毛孢真菌寄生在蟲草蝙蝠蛾昆蟲幼體以后所形成的復合體，而其他種類的蟲菌復合體只能叫“蟲草”。
現代醫(yī)學認為，冬蟲夏草因含有多種生理和藥理的活性物質，在臨床應用研究中具有多方面功效。幸運的是人工液體發(fā)酵培養(yǎng)得到的蟲草菌絲，經過藥理、毒理、植化研究，證明其藥理作用與化學組成和天然蟲草基本相同，多年的臨床應用證明冬蟲夏草的替代品可以為冬蟲夏草菌絲體，2000年版的中華人民共和國藥典對此有明確的規(guī)定。
技術實現要素：
解決的技術問題：
本發(fā)明的目的是提供一種蝙蝠蛾被毛孢菌絲體及其發(fā)酵技術，在西藏海拔3600米的情況下，跟野生蟲草的生長壞境最接近，從而使產品的各種功效更加接近野生蟲草，與野生蟲草相比發(fā)酵蟲草菌絲體在有效成分、重金屬含量等各方面都十分明顯的優(yōu)勢。
技術方案：
一種蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種；
(2)一級種子罐培養(yǎng)；
(4)二級種子罐培養(yǎng)；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)；
(5)離心；
(6)烘干，粉碎。
一種蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基，滅菌，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，然后放入溫度為12-20℃的恒溫搖床上以130-170轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為20-30wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在攪拌式發(fā)酵罐中裝入一級種子罐培養(yǎng)基，滅菌，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將三角瓶發(fā)酵液加入攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為12-20℃，攪拌速度為130-170轉/分，通氣量為30-50l/min，保持罐壓為0.03-0.1mpa，培養(yǎng)時間為10-15天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(5)二級種子罐培養(yǎng)：在攪拌式發(fā)酵罐中裝入二級種子罐培養(yǎng)基，滅菌，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將一級種子罐發(fā)酵液加入攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為12-20℃，攪拌速度為130-170轉/分，通氣量為30-50l/min，保持罐壓為0.03-0.1mpa，培養(yǎng)時間為10-15天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將液體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，滅菌，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將二級種子罐發(fā)酵液加入發(fā)酵罐中，在溫度為12-20℃，攪拌速度為130-170轉/分，通氣量為30-50l/min，保持罐壓為0.03-0.1mpa，培養(yǎng)時間為10-15天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液進行離心，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物烘干，粉碎即得。
一種蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在容量為1000ml三角瓶中裝入400-600ml種子培養(yǎng)基，在溫度為120-125℃下滅菌25-35min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有400-600ml種子培養(yǎng)基的容量為1000ml三角瓶中，然后放入溫度為12-20℃的恒溫搖床上以130-170轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為20-30wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入8-12l一級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為120-125℃下滅菌25-35min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將三角瓶發(fā)酵液加入容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為12-20℃，攪拌速度為130-170轉/分，通氣量為30-50l/min，保持罐壓為0.03-0.1mpa，培養(yǎng)時間為10-15天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(6)二級種子罐培養(yǎng)：在容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入80-120l二級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為120-125℃下滅菌25-35min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將一級種子罐發(fā)酵液加入容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為12-20℃，攪拌速度為130-170轉/分，通氣量為30-50l/min，保持罐壓為0.03-0.1mpa，培養(yǎng)時間為10-15天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1000-1500l液體培養(yǎng)基裝入2000l發(fā)酵罐中，在溫度為120-125℃下滅菌25-35min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到5.5-6.5，再將二級種子罐發(fā)酵液加入容量為2000l發(fā)酵罐中，在溫度為12-20℃，攪拌速度為130-170轉/分，通氣量為30-50l/min，保持罐壓為0.03-0.1mpa，培養(yǎng)時間為10-15天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液進行離心，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物烘干，粉碎即得。
所述烘干為在溫度為70-90℃、真空度為110-150pa下烘干24-72小時。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖、蛋白胨、玉米粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、酵母膏、消泡劑、豆油、水。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖1-4份、蛋白胨1-4份、玉米粉1-4份、磷酸二氫鉀0.1-1.0份、硫酸鎂0.01-0.1份、酵母膏0.5-2.5份、消泡劑0.1-0.5份、豆油0.5-2.5份、水950-1050份。
進一步地，所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖1-4份、桑葉提取物0.2-2份、蛋白胨1-4份、玉米粉1-4份、磷酸二氫鉀0.1-1.0份、硫酸鎂0.01-0.1份、酵母膏0.5-2.5份、消泡劑0.1-0.5份、豆油0.5-2.5份、0.2-0.6份多糖、水950-1050份。
所述桑葉提取物的制備方法為：將桑葉粉碎，過10-20目篩，得到桑葉粉末；將桑葉粉末與質量分數為40-60％的乙醇水溶液以固液質量比1：(18-22)混合均勻后加入到三頸燒瓶中，在55-65℃水浴中回流浸提1.5-2.5小時，回流浸提的同時以轉速為50-70轉/分進行攪拌，離心，取上層清夜在真空度0.05-0.1mpa、溫度為65-75℃下進行減壓濃縮，濃縮至密度為1.02-1.12g/ml(25℃)，得到桑葉提取物。
進一步地，所述桑葉提取物的制備方法為：將桑葉粉碎，過10-20目篩，得到桑葉粉末；將桑葉粉末與水以固液質量比1：(18-22)混合均勻；在超聲功率100-200w、超聲頻率35-45khz的條件下于55-65℃超聲提取1.5-2.5小時，離心，得到上層清夜a和下層沉淀；將下層沉淀與桑葉粉末重量18-22倍的質量分數為40-60％的乙醇水溶液混合均勻后加入到三頸燒瓶中，在55-65℃水浴中回流浸提1.5-2.5小時，回流浸提的同時以轉速為50-70轉/分進行攪拌，離心，得到上層清夜b；將上層清夜a和上層清夜b混合均勻在真空度0.05-0.1mpa、溫度為65-75℃下進行減壓濃縮，濃縮至密度為1.02-1.12g/ml(25℃)，得到桑葉提取物。
所述多糖為黑木耳多糖、香菇多糖中的一種或其混合物。在本發(fā)明一個實施例中，所述多糖由65-75wt％黑木耳多糖和25-35wt％香菇多糖組成。
本發(fā)明還提供了一種蝙蝠蛾被毛孢菌絲體，采用上述方法制作而成。
技術效果：
本發(fā)明蝙蝠蛾被毛孢菌絲體及其發(fā)酵技術，是目前西藏唯一的蟲草菌絲體發(fā)酵技術，在海拔3600米的情況下，跟野生蟲草的生長壞境最接近，從而使產品的各種功效更加接近野生蟲草。與野生蟲草相比發(fā)酵蟲草菌絲體在有效成分、重金屬含量等各方面都十分明顯的優(yōu)勢，產生了巨大的社會效益和經濟效益。
具體實施方式
蟲草素和腺苷含量測定：參照郭濤、張龍、王兵、申鴻《不同培養(yǎng)基培育蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量測定》進行測試。
蟲草多糖含量測定：參照許峰、吳玲芳、林善、王鴻艷等《發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體中蟲草多糖含量的檢測及結構鑒定》進行測試。
實施例中葡萄糖為山東淄博玉豐源制糖有限公司提供的葡萄糖粉。
實施例中蛋白胨為福建仙游三和生物科技有限公司提供醫(yī)藥級蛋白胨。
實施例中硫酸鎂為江蘇連云港口緣鎂業(yè)有限公司提供的七水硫酸鎂。
實施例中磷酸二氫鉀由成都藍劍化工有限公司提供。
實施例中消泡劑為宿州市華潤化工有限責任公司提供sxp-106有機硅消泡劑。
實施例中豆油為浙江益海嘉里食品工業(yè)有限公司提供的金龍魚大豆油。
實施例中酵母膏為浙江東成藥業(yè)有限公司提供的酵母粉(發(fā)酵培養(yǎng)基專用)。
實施例中玉米粉為濱州金匯玉米開發(fā)有限公司提供的玉米淀粉。
實施例中桑葉為亳州百川藥業(yè)有限公司提供的霜桑葉。
實施例中黑木耳多糖為杭州眾芝康菇生物技術有限公司提供的含量為30wt％的黑木耳多糖。
實施例中香菇多糖為陜西藤邁生物科技有限責任公司提供的含量為30wt％的香菇多糖。
蝙蝠蛾被毛孢，hirsutellahepialichenetshen。該菌種系國家食品藥品監(jiān)督管理局2005.5.20頒布的真菌類保健食品申報與審評規(guī)定(試行)中，可用于保健食品的真菌菌種名單之一。也是目前全國唯一得到中國菌物學術界專家院士們公認的真正的冬蟲夏草真菌菌種。本發(fā)明實施例中蝙蝠蛾被毛孢是從中國科學院微生物菌種保藏管理中心引種。
實施例1
蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在容量為1000ml三角瓶中裝入500ml種子培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有500ml種子培養(yǎng)基的容量為1000ml三角瓶中，然后放入溫度為18℃的恒溫搖床上以150轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為25wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入10l一級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將三角瓶發(fā)酵液加入容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為11天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(7)二級種子罐培養(yǎng)：在容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入100l二級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將一級種子罐發(fā)酵液加入容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.06mpa，培養(yǎng)時間為13天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1200l液體培養(yǎng)基裝入2000l發(fā)酵罐中，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將二級種子罐發(fā)酵液加入容量為2000l發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為12天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液以轉速為5000轉/分進行離心20min，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物在溫度為80℃、真空度為120pa下烘干48小時，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌絲體。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖3份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氫鉀0.6份、硫酸鎂0.04份、酵母膏1.5份、消泡劑0.2份、豆油1.5份、蒸餾水1000份。將各原料加入水中混合均勻即得。
實施例2
蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在容量為1000ml三角瓶中裝入500ml種子培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有500ml種子培養(yǎng)基的容量為1000ml三角瓶中，然后放入溫度為18℃的恒溫搖床上以150轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為25wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入10l一級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將三角瓶發(fā)酵液加入容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為11天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(8)二級種子罐培養(yǎng)：在容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入100l二級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將一級種子罐發(fā)酵液加入容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.06mpa，培養(yǎng)時間為13天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1200l液體培養(yǎng)基裝入2000l發(fā)酵罐中，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將二級種子罐發(fā)酵液加入容量為2000l發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為12天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液以轉速為5000轉/分進行離心20min，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物在溫度為80℃、真空度為120pa下烘干48小時，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌絲體。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖3份、桑葉提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氫鉀0.6份、硫酸鎂0.04份、酵母膏1.5份、消泡劑0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.4份、蒸餾水1000份。將各原料加入水中混合均勻即得。
所述桑葉提取物的制備方法為：將桑葉粉碎，過16目篩，得到桑葉粉末；將桑葉粉末與質量分數為50％的乙醇水溶液以固液質量比1：20混合均勻后加入到三頸燒瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小時，回流浸提的同時以轉速為60轉/分進行攪拌，以轉速為5000轉/分進行離心20min，取上層清夜在真空度0.06mpa、溫度為70℃下進行減壓濃縮，濃縮至密度為1.08g/ml(25℃)，得到桑葉提取物。
實施例3
蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在容量為1000ml三角瓶中裝入500ml種子培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有500ml種子培養(yǎng)基的容量為1000ml三角瓶中，然后放入溫度為18℃的恒溫搖床上以150轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為25wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入10l一級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將三角瓶發(fā)酵液加入容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為11天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(9)二級種子罐培養(yǎng)：在容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入100l二級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將一級種子罐發(fā)酵液加入容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.06mpa，培養(yǎng)時間為13天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1200l液體培養(yǎng)基裝入2000l發(fā)酵罐中，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將二級種子罐發(fā)酵液加入容量為2000l發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為12天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液以轉速為5000轉/分進行離心20min，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物在溫度為80℃、真空度為120pa下烘干48小時，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌絲體。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖3份、桑葉提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氫鉀0.6份、硫酸鎂0.04份、酵母膏1.5份、消泡劑0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.4份、蒸餾水1000份。將各原料加入水中混合均勻即得。
所述桑葉提取物的制備方法為：將桑葉粉碎，過16目篩，得到桑葉粉末；將桑葉粉末與水以固液質量比1：20混合均勻；在超聲功率150w、超聲頻率40khz的條件下于60℃超聲提取2小時，以轉速為5000轉/分進行離心20min，取上層清夜在真空度0.06mpa、溫度為70℃下進行減壓濃縮，濃縮至密度為1.08g/ml(25℃)，得到桑葉提取物。
實施例4
蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在容量為1000ml三角瓶中裝入500ml種子培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有500ml種子培養(yǎng)基的容量為1000ml三角瓶中，然后放入溫度為18℃的恒溫搖床上以150轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為25wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入10l一級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將三角瓶發(fā)酵液加入容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為11天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(10)二級種子罐培養(yǎng)：在容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入100l二級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將一級種子罐發(fā)酵液加入容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.06mpa，培養(yǎng)時間為13天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1200l液體培養(yǎng)基裝入2000l發(fā)酵罐中，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將二級種子罐發(fā)酵液加入容量為2000l發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為12天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液以轉速為5000轉/分進行離心20min，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物在溫度為80℃、真空度為120pa下烘干48小時，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌絲體。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖3份、桑葉提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氫鉀0.6份、硫酸鎂0.04份、酵母膏1.5份、消泡劑0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.4份、蒸餾水1000份。將各原料加入水中混合均勻即得。
所述桑葉提取物的制備方法為：將桑葉粉碎，過16目篩，得到桑葉粉末；將桑葉粉末與水以固液質量比1：20混合均勻；在超聲功率150w、超聲頻率40khz的條件下于60℃超聲提取2小時，以轉速為5000轉/分進行離心20min，得到上層清夜a和下層沉淀；將下層沉淀與桑葉粉末重量20倍的質量分數為50％的乙醇水溶液混合均勻后加入到三頸燒瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小時，回流浸提的同時以轉速為60轉/分進行攪拌，以轉速為5000轉/分進行離心20min，得到上層清夜b；將上層清夜a和上層清夜b混合均勻在真空度0.06mpa、溫度為70℃下進行減壓濃縮，濃縮至密度為1.08g/ml(25℃)，得到桑葉提取物。
實施例5
蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在容量為1000ml三角瓶中裝入500ml種子培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有500ml種子培養(yǎng)基的容量為1000ml三角瓶中，然后放入溫度為18℃的恒溫搖床上以150轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為25wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入10l一級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將三角瓶發(fā)酵液加入容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為11天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(11)二級種子罐培養(yǎng)：在容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入100l二級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將一級種子罐發(fā)酵液加入容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.06mpa，培養(yǎng)時間為13天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1200l液體培養(yǎng)基裝入2000l發(fā)酵罐中，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將二級種子罐發(fā)酵液加入容量為2000l發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為12天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液以轉速為5000轉/分進行離心20min，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物在溫度為80℃、真空度為120pa下烘干48小時，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌絲體。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖3份、桑葉提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氫鉀0.6份、硫酸鎂0.04份、酵母膏1.5份、消泡劑0.2份、豆油1.5份、香菇多糖0.4份、蒸餾水1000份。將各原料加入水中混合均勻即得。
所述桑葉提取物的制備方法為：將桑葉粉碎，過16目篩，得到桑葉粉末；將桑葉粉末與水以固液質量比1：20混合均勻；在超聲功率150w、超聲頻率40khz的條件下于60℃超聲提取2小時，以轉速為5000轉/分進行離心20min，得到上層清夜a和下層沉淀；將下層沉淀與桑葉粉末重量20倍的質量分數為50％的乙醇水溶液混合均勻后加入到三頸燒瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小時，回流浸提的同時以轉速為60轉/分進行攪拌，以轉速為5000轉/分進行離心20min，得到上層清夜b；將上層清夜a和上層清夜b混合均勻在真空度0.06mpa、溫度為70℃下進行減壓濃縮，濃縮至密度為1.08g/ml(25℃)，得到桑葉提取物。
實施例6
蝙蝠蛾被毛孢菌絲體的發(fā)酵技術，包括以下步驟：
(1)接種：在容量為1000ml三角瓶中裝入500ml種子培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將蝙蝠蛾被毛孢菌種接種在裝有500ml種子培養(yǎng)基的容量為1000ml三角瓶中，然后放入溫度為18℃的恒溫搖床上以150轉/分培養(yǎng)至菌絲濃度為25wt％，得到三角瓶發(fā)酵液；
(2)一級種子罐培養(yǎng)：在容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入10l一級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將三角瓶發(fā)酵液加入容量為20l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為11天，得到一級種子罐發(fā)酵液；
(12)二級種子罐培養(yǎng)：在容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中裝入100l二級種子罐培養(yǎng)基，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將一級種子罐發(fā)酵液加入容量為200l的攪拌式發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.06mpa，培養(yǎng)時間為13天，得到二級種子罐發(fā)酵液；
(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：將1200l液體培養(yǎng)基裝入2000l發(fā)酵罐中，在溫度為121℃下滅菌30min，冷卻至室溫，調節(jié)ph值到6.0，再將二級種子罐發(fā)酵液加入容量為2000l發(fā)酵罐中，在溫度為18℃，攪拌速度為150轉/分，無菌空氣的通氣量為40l/min，保持罐壓為0.08mpa，培養(yǎng)時間為12天，得到發(fā)酵罐發(fā)酵液；
(5)離心：將發(fā)酵罐發(fā)酵液以轉速為5000轉/分進行離心20min，棄上清液，得到沉淀物；
(6)將沉淀物在溫度為80℃、真空度為120pa下烘干48小時，粉碎至16目即得蝙蝠蛾被毛孢菌絲體。蝙蝠蛾被毛孢菌絲體測試結果：蟲草素含量為0.75％，蟲草多糖含量為27.9％，蟲草酸含量為16.3％，氨基酸含量為181mg/g，腺苷含量0.78％。
所述種子培養(yǎng)基、一級種子罐培養(yǎng)基、二級種子罐培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基均由下述重量份原料制備而成：葡萄糖3份、桑葉提取物1份、蛋白胨2.5份、玉米粉3份、磷酸二氫鉀0.6份、硫酸鎂0.04份、酵母膏1.5份、消泡劑0.2份、豆油1.5份、黑木耳多糖0.28份、香菇多糖0.12份、蒸餾水1000份。將各原料加入水中混合均勻即得。
所述桑葉提取物的制備方法為：將桑葉粉碎，過16目篩，得到桑葉粉末；將桑葉粉末與水以固液質量比1：20混合均勻；在超聲功率150w、超聲頻率40khz的條件下于60℃超聲提取2小時，以轉速為5000轉/分進行離心20min，得到上層清夜a和下層沉淀；將下層沉淀與桑葉粉末重量20倍的質量分數為50％的乙醇水溶液混合均勻后加入到三頸燒瓶中，在60℃水浴中回流浸提2小時，回流浸提的同時以轉速為60轉/分進行攪拌，以轉速為5000轉/分進行離心20min，得到上層清夜b；將上層清夜a和上層清夜b混合均勻在真空度0.06mpa、溫度為70℃下進行減壓濃縮，濃縮至密度為1.08g/ml(25℃)，得到桑葉提取物。
測試例1
對實施例1-5制備的蝙蝠蛾被毛孢菌絲體進行測試，具體測試結果見表1。
表1：測試結果表
本發(fā)明是目前西藏唯一的蟲草菌絲體發(fā)酵技術，在海拔3600米的情況下，跟野生蟲草的生長壞境最接近，從而使產品的各種功效更加接近野生蟲草。與野生蟲草相比發(fā)酵蟲草菌絲體在有效成分、重金屬含量等各方面都十分明顯的優(yōu)勢，產生了巨大的社會效益和經濟效益。通過大量試驗，考察篩選出蝙蝠蛾被毛孢的最適生長條件，在確定最佳生長條件后，創(chuàng)造性的選用植物源提取物，考察植物源提取物的種類、添加量和菌體收獲時間對蝙蝠蛾被毛孢生長的影響，并利用這三種因素中的最優(yōu)水平進行正交試驗，來實現蝙蝠蛾被毛孢的培養(yǎng)。