本發(fā)明屬于海洋化工工程技術，具體涉及一種殼聚糖衍生物及其制備方法和應用。

背景技術：

為應對人口增長所帶來的糧食壓力，在農業(yè)生產上長期大量的使用化學農藥，由此所帶來的環(huán)境污染、生態(tài)破壞問題越來越突出。同時，隨著人們環(huán)保意識及食品安全意識的提高，因農藥殘留導致的食品安全問題也日益尖銳，農藥殘留引起的食品安全和綠色壁壘問題也日益成為人們關注的焦點，有害殘留農藥已嚴重影響農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類健康。研制高效、低毒、低殘留的生物農藥已迫在眉睫。

我國是一個農業(yè)大國，同時也是一個海洋大國，利用豐富的海洋生物資源，開發(fā)新型海洋生物源農藥，是一個新的應用前景廣闊的研究領域。甲殼素來源于蝦、蟹、昆蟲等節(jié)肢動物(甲殼綱、昆蟲綱)的外殼或軟體動物的外殼以及真菌、低等藻類的細胞壁。其含量豐富，可再生，是含量僅次于纖維素的第二大天然生物多糖。殼聚糖作為甲殼素的脫乙酰產物，具有無毒、生物相容性好、可自然降解等特點。有研究表明，用殼聚糖處理種子，能促進種子萌芽，提高發(fā)芽率，提高糧食作物分蘗數和出穗數，改善蔬菜品質提高產量。此外，殼聚糖還能抑制植物病原真菌，改善土壤微生物菌群，誘導植物光譜抗病性。以殼聚糖、寡糖為原料研制的海洋生物源農藥已有多個產品面市。然而，由于殼聚糖為天然產物，其殺菌活性與化學農藥相比差距甚大，且用量大，所以推廣比較困難，限制了其應用。

硫元素是構成生命的重要元素，很多含硫化合物具有多種重要的生理活性。在植物保護中，許多高效的殺蟲劑、除草劑、殺菌劑都是含硫化合物。二硫代氨基甲酸酯(鹽)類化合物是一類應用廣泛的高效農用殺菌劑。如縮氨基硫脲化合物具有廣泛的生物活性,在農藥界備受關注。研究表明,該類化合物及其衍生物具有抗細菌、抗真菌活性，能與多種金屬離子形成穩(wěn)定的配合物,且形成配合物后活性顯著增強。然而，此類殺菌劑存在毒性大的缺點。因此，急需一種環(huán)境友好、能夠綜合殼聚糖及含硫的殺菌劑。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種結構新穎、抑菌活性好的殼聚糖二硫雜環(huán)類衍生物及其制備方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案為：

一種殼聚糖衍生物，殼聚糖衍生物為殼聚糖二硫雜環(huán)類衍生物如通式i或式ⅱ所示，

式i，n＝20-12000。式ⅱ中，或h2，n＝20-12000。

一種殼聚糖衍生物的制備方法：

當通式i所示衍生物的制備為：

(1)殼聚糖在醇與水的混溶液中，在堿的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應5-6h，再與溴甲烷反應12h，生成殼聚糖二硫丁烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準，殼聚糖、堿、二硫化碳與溴甲烷的摩爾比為1:1.5-2:1.5-2:1.5-2；

當通式i所示衍生物的制備為：

(2)殼聚糖在醇與水的混溶液中，在堿的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應5-6h，再與1,2-二溴乙烷反應12h，生成殼聚糖二硫戊烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準，殼聚糖、堿、二硫化碳與1,2-二溴乙烷的摩爾比為1:1.5-2:1.5-2:1.5-2；

當r＝h2，通式ⅱ所示衍生物的制備為

(3)殼聚糖先與溶劑中溶脹12h，再與過量氯乙酰氯與70-80℃下回流18h，反應后抽濾，濾餅用醇、去離子水洗滌，于50-60℃干燥后，得殼聚糖酰乙氯衍生物；其中，殼聚糖的質量與氯乙酰氯的體積比為1:8.5-9；

(4)將步驟(3)中的殼聚糖酰乙氯衍生物混懸于溶劑中，加入過量85％水肼，回流反應8-10h，反應后抽濾，濾餅用醇洗滌，于50-60℃干燥后，得殼聚糖酰乙肼衍生物；其中，殼聚糖酰乙氯衍生物與85％水肼的質量體積比為1:1-2；

當通式ⅱ所示衍生物的制備為：

(5)將步驟(4)中的殼聚糖酰乙肼在醇與水的混溶液中，在氫氧化鈉的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應5-6h，再與溴甲烷反應8-12h，生成殼聚糖酰乙肼二硫丁烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準，殼聚糖酰乙肼、氫氧化鈉、二硫化碳與溴甲烷的摩爾比為1:1.5:1.5-2:1.5-2；

當通式ⅱ所示衍生物的制備為：

(6)將步驟(4)中的殼聚糖酰乙肼在醇與水的混溶液中，在氫氧化鈉的催化下，常溫下，先與二硫化碳反應5-6h，再與1.2-二溴乙烷反應8-12h，生成殼聚糖酰乙肼二硫丁烷雜環(huán)衍生物；其中，以殼聚糖單糖為基準，殼聚糖酰乙肼、氫氧化鈉、二硫化碳與1,2-二溴乙烷的摩爾比為1:1.5:1.5-2:1.5-2。

所述制備通式i或通式ⅱ所示衍生物時，反應后抽濾，濾餅用醇洗，于50-60℃干燥，得純化后通式i或通式ⅱ所示衍生物。

所述殼聚糖的分子量為3200-2000000。

所述步驟(1)、(2)、(5)和(6)中，反應溶劑中的醇為甲醇或乙醇，醇與水的體積比為1-4:1，其中，混合溶劑體積與殼聚糖質量比為25:1-2。

所述步驟(3)中，反應溶劑為三氯甲烷或二氯甲烷與吡啶的混合液，體積比為1:1；其中，混合溶劑體積與殼聚糖質量比為10:1。

所述步驟(4)中，反應溶劑四氫呋喃或n,n-二甲基甲酰胺，其中，溶劑體積與殼聚糖質量比為20:1-2。

所述醇洗所用的醇為甲醇或乙醇。

所述通式i或通式ⅱ所示所示衍生物在制備抑菌劑中的應用。

原理：殼聚糖分子的氨基或引入的肼基，可與二硫化碳發(fā)生親核反應，生成氨基二硫代甲酸鹽，在小分子單溴化物或多溴化物的存在下，再進一步發(fā)生親電取代，最終生成2位取代的二硫環(huán)。

本發(fā)明的優(yōu)點：

氨基二硫代甲酸酯類農藥是農業(yè)上一大類殺蟲、殺菌類的農藥，其二硫活性基團，具有較高的活性，而二硫雜環(huán)就是二硫代甲酸酯類的衍生化方向之一；本發(fā)明采用活性亞結構拼接原理，以無毒、易降解的殼聚糖為先導化合物，將二硫雜環(huán)衍生物的生物活性基團引入到天然產物殼聚糖骨架中，使其產生協(xié)同效應，制備出抑菌活性得到顯著提高，切具有誘導抗病活性的新型殼聚糖衍生物，同時合成的衍生物能保持殼聚糖天然無毒、易降解、生物相容性好的特性。以此來減少化學農藥的用量、降低殘留、減少污染，為開發(fā)新型生物農藥的開辟了新途徑。

附圖說明

圖1為殼聚糖的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1650，1589，1374，1315，1024，893。

圖2為殼聚糖衍生物1的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1645，1539，1372，1311，1209，1024，894。

圖3為殼聚糖衍生物2的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1591，1524，1373，1311，1025。

圖4為殼聚糖衍生物3的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1646，1590，1373，1316，1058，1024，893：

圖5為殼聚糖衍生物4的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1635，1521，1372，1312，1025。

圖6為殼聚糖衍生物5的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1633，1584，1522，1373，1025，894。

具體實施方式

下面結合說明書附圖對本發(fā)明作進一步說明，并且本發(fā)明的保護范圍不僅局限于以下實施例。

進一步的說通式i或式ⅱ所示衍生物的制備：

通式i衍生物：將殼聚糖混懸于甲醇或乙醇與去離子水的混合溶劑中，加入適量氫氧化鈉溶液，常溫攪拌1h，再滴加適量二硫化碳，常溫反應5-6h，再加入溴甲烷或1,2-二溴乙烷的，常溫反應12h；然后反應物通過抽濾、洗滌、干燥，即為殼聚糖二硫丁烷雜環(huán)或殼聚糖二硫戊烷雜環(huán)衍生物。加入的殼聚糖、氫氧化鈉、二硫化碳與溴甲烷或1,2-二溴乙烷的摩爾比為1:1.5:1.5-2:1.5-2。

通式ⅱ衍生物：殼聚糖先制備成氯乙酰殼聚糖，再進一步制備成殼聚糖酰乙肼，以殼聚糖酰乙肼為原料按照通式i衍生物的合成過程，制得殼聚糖酰乙肼基二硫烷基環(huán)。氯乙酰的制備方法：按一定比例混合二氯甲烷或三氯甲烷與吡啶，加入殼聚糖，溶脹，再滴加氯乙酰氯，滴加完畢，升溫回流，反應產物經過濾、洗滌、干燥，即為氯乙酰殼聚糖；反應溶劑二氯乙烷或三氯乙烷與吡啶的體積比為1:1，混合溶劑的體積與殼聚糖質量比為10:1，殼聚糖質量與氯乙酰氯的體積比為1：8.5-9，反應溫度70-80℃，反應時間為18-20h，洗滌液為甲醇或乙醇、去離子水，干燥溫度為50-60℃。殼聚糖酰乙肼的制備方法為：將氯乙酰殼聚糖與四氫呋喃或n、n-二甲基甲酰胺混合，加入85％水肼，加熱，過濾，醇洗，水洗，干燥，即為殼聚糖酰乙肼；氯乙酰殼聚糖的質量與反應溶劑的體積比例為1:10-15，氯乙酰殼聚糖質量與85％水肼的體積比為1:2-5，反應溫度60-70℃，反應時間8-10h，洗滌液為甲醇或乙醇、去離子水，干燥溫度為50-60℃。

實施例1衍生物1的制備

將2g分子量為180萬的殼聚糖加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml45％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將1.035ml二硫化碳，緩慢滴加到上述反應體系中，常溫反應5h；將1.5ml溴甲烷，加到上述反應體系中，常溫反應6h；反應完畢，抽濾，濾餅用無水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.2g，黃白色粉末，即為衍生物1：殼聚糖-2-亞胺-1,3-二硫丁烷。結構見通式ⅰ

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖2)與殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1589cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經發(fā)生反應；且1539cm^-1處出現(xiàn)為c＝n特征吸收峰；1209cm^-1處出現(xiàn)n＝c-s特征吸收峰；綜上，證明衍生物1合成成功。

實施例2衍生物2的制備

將2g分子量為150萬的殼聚糖加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml48％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將2.5ml1,3-二溴乙烷，緩慢滴加到上述反應體系中，常溫反應6h；反應完畢，抽濾，濾餅用無水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.2g，米黃色粉末，即為殼聚糖-2-亞胺-1,3-二硫戊烷。即為衍生物2：殼聚糖-2-亞胺-1,3-二硫戊烷。結構見通式i

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖3)與殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1589cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明氨基已經發(fā)生反應；且1524cm^-1處出現(xiàn)為c＝n特征吸收峰；綜上，證明衍生物2合成成功。

實施例3衍生物3的制備

將20g分子量為180萬的殼聚糖加入到200ml二氯甲烷與吡啶(1:1)的混合溶液中，溶脹12h；緩慢滴加120ml氯乙酰氯，65℃回流10h，補加60ml氯乙酰氯，繼續(xù)回流8h，停止加熱，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，50％乙醇洗滌一次，抽濾，濾餅60℃烘干，得19.8g米黃色固體，即為氯乙酰殼聚糖。

取10g氯乙酰殼聚糖，加入到100ml四氫呋喃中，再加入8ml85％水合肼，攪拌，60℃回流8h，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，常溫真空干燥，得9.37g黃白色固體，即為殼聚糖酰乙肼。即為衍生物3：殼聚糖-酰乙肼。結構見通式ⅰ(r＝h2,n＝20-12000)

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖4)與殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1590cm^-1的nh的特征吸收峰增強，表明肼基連接上；且1646cm^-1處c＝o特征吸收峰增強；1058cm^-1、1024cm^-1處仍未三峰，表明環(huán)上羥基未取代，說明?；B在殼聚糖-nh2上；綜上，證明衍生物3合成成功。

實施例4衍生物4的制備

將10g分子量為180萬的殼聚糖加入到100ml二氯甲烷與吡啶(1:1)的混合溶液中，溶脹12h；緩慢滴加55ml氯乙酰氯，65℃回流10h，補加30ml氯乙酰氯，繼續(xù)回流8h，停止加熱，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，50％乙醇洗滌一次，抽濾，濾餅常溫下真空干燥12h，得9g米黃色固體，即為氯乙酰殼聚糖。

取8g氯乙酰殼聚糖，加入到100ml四氫呋喃中，再加入5ml85％水合肼，攪拌，70℃回流8h，將至室溫，抽濾，濾餅用95乙醇洗滌2次，常溫真空干燥，得6.9g黃白色固體，即為殼聚糖酰乙肼。

取2g殼聚糖酰乙肼加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml46％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將1.03ml二硫化碳，緩慢滴加到上述反應體系中常溫反應5h；將1.3ml溴甲烷，加到上述反應體系中，常溫反應10h；反應完畢，抽濾，濾餅用無水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.2g，黃白色粉末，即衍生物4：為殼聚糖-酰乙基-2-亞肼-1,3-二硫丁烷。結構見通式ⅱ

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖5)殼聚糖酰乙肼譜圖(圖4)相比，位于1590cm^-1的n-h的彎曲吸收峰減弱，肼基上有反應；且1521cm^-1處出現(xiàn)c＝n伸縮振動峰；1208cm^-1處出現(xiàn)n＝c-s特征吸收峰；綜上，證明衍生物4成成功。

實施例5衍生物5的制備

殼聚糖酰乙肼的制備同實施例4。

取2g殼聚糖酰乙肼加入到20ml乙醇中，加入5ml去離子水，攪拌，緩慢滴加2ml46％naoh溶液，滴加完畢，堿化1h；將1.03ml二硫化碳緩慢滴加到上述反應體系中，常溫反應5h；將1.65ml1,3-二溴乙烷，加到上述反應體系中，常溫反應12h；反應完畢，抽濾，濾餅用無水乙醇洗滌2次，用去離子水洗滌1次，60℃烘干，得2.0g，黃白色固體，即衍生物4：為殼聚糖-酰乙基-2-亞肼-1,3-二硫戊烷。結構見通式ⅱ

紅外光譜表明：殼聚糖衍生物1的紅外譜圖(圖6)與殼聚糖的紅外譜圖(圖4)相比，位于1590cm^-1的n-h的彎曲吸收峰減弱，肼基上有反應；且1522cm^-1處出現(xiàn)c＝n特征吸收峰，1202cm^-1處出現(xiàn)n＝c-s特征吸收峰；綜上，證明衍生物5成成功。

抑菌活性測定

采用生長速率法測定樣品對辣椒疫霉(phytophthoracapsici)的抑菌活性。測試在3個樣品濃度下即：100μg/ml、200μg/ml、400ug/ml，對辣椒疫霉的抑制效果。

實驗以相同濃度的好普寡糖藥劑(市售為2％的水劑)為陽性對照，以蒸餾水為陰性對照。將培養(yǎng)基均勻倒入2個直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后，在每個培養(yǎng)皿中接種3塊直徑為5mm的菌餅。在27℃下培養(yǎng)48小時后，測量菌落直徑，計算樣品的抑菌率。每次處理設置2個培養(yǎng)皿，每皿接種3個菌落，對每個菌落測定最大直徑(dmax)和最小直徑(dmin)，取平均值為樣品抑菌圈直徑d樣品，全部試驗重復一次。根據下式計算抑菌率。

抑菌率(％)＝(d空白－d樣品)/(d空白－5)×100％

實驗結果見表1

表1部分通式1殼聚糖衍生物對辣椒疫霉的抑制活性

根據以上數據和衍生物結構分析：

本發(fā)明的衍生物殺菌活性，與殼聚糖相比明顯得到提高，且活性比商業(yè)化的殺菌劑好譜寡糖高，尤其是衍生物3和4，最高活性比伊維菌素高出18個百分點。同時，根據測量，活性基團的取代度為20％左右，若以此計算，在400mg/ml濃度下，活性基團的當量濃度為80mg/ml，在此當量濃度下，衍生物1和2同對照好譜寡糖400mg/ml的活性持平，而衍生物3、4和5，超過好譜寡糖此濃度下的活性很多。因此衍生物具有較好的殺菌活性，尤其是衍生物3和4，具有最高活性。本發(fā)明衍生物，二硫基團活性基團為小分子，切僅連接在20％左右的單糖上，空間位阻很小，不改變殼聚糖主要結構，因此不影響殼聚糖鏈的植物調節(jié)作用。故，本發(fā)明衍生物，同時具體殺菌作用，及植物調節(jié)功能，由此可發(fā)揮雙重作用，提高效果。本發(fā)明的衍生物，以殼聚糖為基質。殼聚糖由天然多糖幾丁質經脫乙酰得到，制備工藝簡單，來源豐富易得，同時，天然無毒，與生物相容性好。在連接活性基團后，大量的氨基葡萄糖骨架，遮蓋了二硫活性基團的毒性，所得產物低毒。重要的是，寡糖鏈不能被皮膚直接吸收，故對皮膚無毒，這是一般二硫代氨基甲酸酯(鹽)類農藥所不具備的優(yōu)勢。另外，殼聚糖能夠被微生物利用作為碳源，易降解，能夠迅速發(fā)揮殺菌作用，不易積累及殘留毒性，因此對環(huán)境友好。相對于寡糖，殼聚糖的成本更低，更易衍生物處理，且本發(fā)明衍生物所含有的二硫代甲酸酯類活性基團，具有其他的殺蟲、殺線活性。以殼聚糖為基質開發(fā)新的殺菌劑，是另一個熱點方向。

綜上，本發(fā)明為調高殺菌效果，為減少化學農藥的用量、降低殘留、減少污染，為開發(fā)新型生物農藥的開辟了新途徑。