本發(fā)明涉及人參皂苷rd的制備方法，尤其是酶催化轉(zhuǎn)化人參皂苷rb1制備人參皂苷rd的方法。
背景技術(shù)：
：人參皂苷rd是一種特異性受體操縱鈣離子通道抑制劑，具有局灶性腦缺血治療作用、再灌注損傷治療作用、對(duì)shrsp腦卒中的防治作用、對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞死亡與凋亡的保護(hù)和治療作用、對(duì)腦血管及腦血流量的作用、對(duì)急性腦缺血能量代謝的作用、對(duì)低壓耐缺氧的作用及對(duì)5-ht引起的椎基底動(dòng)脈的收縮反應(yīng)的降低作用，臨床用藥需求量大。目前人參皂苷rd主要從中藥三七等藥材提取分離制得，其產(chǎn)量受到藥材資源的極大制約。由于人參皂苷類成分難于采用化學(xué)方法全合成，利用來(lái)源易得的人參皂苷成分制備稀有人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化法受到人們的關(guān)注。文獻(xiàn)研究表明，生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、酶系廣泛等優(yōu)點(diǎn)，然而生物轉(zhuǎn)化法也存在需要事先分離所需的菌株或者相應(yīng)的酶、底物對(duì)酶有抑制作用、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化率不理想等不足。現(xiàn)有生物轉(zhuǎn)化法技術(shù)還難以實(shí)現(xiàn)人參皂苷rd的規(guī)?；苽洌⑶胰藚⒃碥誶b1和人參皂苷rd的溶解和萃取大多采用醇類有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑能夠?qū)е旅傅淖冃允Щ?，從而使得酶溶液無(wú)法多次反復(fù)使用，本發(fā)明通過(guò)將人參皂苷rb1固定于大孔樹(shù)脂上，再加入含酶的水溶液，使酶催化轉(zhuǎn)化發(fā)生在大孔樹(shù)脂表面，酶催化轉(zhuǎn)化過(guò)程不接觸有機(jī)溶劑，不僅提高了反應(yīng)效率，而且酶溶液可反復(fù)利用，為人參皂苷rd的規(guī)模化制備提供了新的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有人參皂苷rd天然來(lái)源以及難于規(guī)化模制備不足的問(wèn)題，使人參皂苷rb1的酶催化轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)生在大孔樹(shù)脂表面，產(chǎn)生了非常顯著的有益效果。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。一種人參皂苷rd的酶催化轉(zhuǎn)化制備方法，包括如下步驟：取富含人參皂苷rb1的溶液，加入大孔樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附，使人參皂苷rb1充分吸附于大孔樹(shù)脂上，再加入含酶的水溶液，在一定溫度和ph下水解一定時(shí)間，濾過(guò)，分別以一定量的清洗劑、洗脫劑清洗和洗脫大孔樹(shù)脂,制得人參皂苷rd溶液，經(jīng)hplc法檢測(cè)，人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化率84.04-97.38%。所述的富含人參皂苷rb1的溶液為西洋參、人參、三七的提取液，優(yōu)選人參皂苷rb1的溶液。所述的大孔樹(shù)脂為d101和da-201組成的大孔樹(shù)脂組合物，其質(zhì)量比為1:1。所述的酶液為纖維素酶和果膠酶的混合物，纖維素酶與果膠酶的質(zhì)量比為1:1～1:2。所述加入含酶的水溶液，使溶液中酶的濃度達(dá)到100u/ml以上。所述提取溶液的ph為3～12，提取溫度為80℃～85℃，水解時(shí)間90分鐘～100分鐘。所述的清洗劑、洗脫劑為含水乙醇，其中清洗劑為0～30%含水乙醇，洗脫劑為30～80%含水乙醇；優(yōu)選的清洗劑為30%含水乙醇，洗脫劑為70%含水乙醇。所述的hplc法檢測(cè)條件為:鍵合硅膠c18柱,流動(dòng)相為乙腈水溶液（30：70）,等度洗脫。本發(fā)明通過(guò)將人參皂苷rb1固定于大孔樹(shù)脂上，再加入含酶的水溶液，使酶催化轉(zhuǎn)化發(fā)生在大孔樹(shù)脂表面，酶催化轉(zhuǎn)化過(guò)程不接觸有機(jī)溶劑，不僅提高了反應(yīng)效率，而且酶溶液可反復(fù)利用，克服了現(xiàn)有人參皂苷rd天然來(lái)源以及難于規(guī)化模制備的不足，為人參皂苷rd的規(guī)模化制備提供了新的方法。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取人參皂苷rb120mg的溶液50ml，加入5ml預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附，使人參皂苷rb1充分吸附于大孔樹(shù)脂上，再加入含酶的水溶液，使酶活力大于100u/ml，用鹽酸調(diào)ph為2，溫度控制在40℃下進(jìn)行酶解，水解60分鐘后，濾過(guò)，分別以一定量的20%的乙醇清洗，用50%的乙醇洗脫，清洗劑洗脫劑清洗和洗脫大孔樹(shù)脂,洗脫液濃縮至干，用95%的乙醇超聲溶解并定容至10ml。0.45μm的濾頭過(guò)濾，進(jìn)樣10μl，hplc測(cè)定，分別計(jì)算人參皂苷rb1和人參皂苷rd含量、轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)收率。實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于：取西洋參藥材粉末500mg加入到25ml的具塞試管中，用鹽酸調(diào)ph為4，溫度控制在40℃下進(jìn)行酶解，水解120分鐘。實(shí)施例3與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用鹽酸調(diào)ph為6，溫度控制在40℃下進(jìn)行酶解，水解180分鐘。實(shí)施例4與實(shí)施例3的區(qū)別在于：用鹽酸調(diào)ph為4，溫度控制在50℃下進(jìn)行酶解，水解60分鐘。實(shí)施例5與實(shí)施例4的區(qū)別在于：用鹽酸調(diào)ph為6，溫度控制在50℃下進(jìn)行酶解，水解120分鐘實(shí)施例6。與實(shí)施例2的區(qū)別在于：用鹽酸調(diào)ph為2，溫度控制在50℃下進(jìn)行酶解，水解180分鐘。實(shí)施例7與實(shí)施例1的區(qū)別在于：用鹽酸調(diào)ph為2，溫度控制在60℃下進(jìn)行酶解，水解60分鐘。實(shí)施例8用鹽酸調(diào)ph為6，溫度控制在60℃下進(jìn)行酶解，水解60分鐘。實(shí)施例9用鹽酸調(diào)ph為4，溫度控制在60℃下進(jìn)行酶解，水解180分鐘。實(shí)施例10人參皂苷的hplc檢測(cè)色譜條件:c18柱（型號(hào)venusilxbpc18柱，長(zhǎng)25cm，內(nèi)徑4.6mm，填料粒徑5μm），流動(dòng)相為乙腈-水溶液（30：70）,檢測(cè)波長(zhǎng)203nm。取人參皂苷rb1、人參皂苷rd適量，精密稱定，分別置2ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含人參皂苷rb11.0mg、人參皂苷rd1.0mg的對(duì)照品溶液。另取制得的人參皂苷rd1.0mg，精密稱定，置2ml量瓶中，加甲醇溶解定容作為供試品溶液。微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。實(shí)施例1-9所制得的人參皂苷rd按照實(shí)施例10測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。表1實(shí)施例中人參皂苷含量測(cè)定結(jié)果樣品人參皂苷rb1投料量（mg）人參皂苷rb1測(cè)得量（mg）轉(zhuǎn)化率（%）人參皂苷rd測(cè)得量（mg）反應(yīng)收率（%）實(shí)施例1201.20637293.9714.4962888.83實(shí)施例2203.09188484.548.35261756.89實(shí)施例3202.01780389.918.45273754.13實(shí)施例4202.37903788.108.32871954.43實(shí)施例5200.5232697.388.76558851.83實(shí)施例6201.04048994.8013.9383184.66實(shí)施例7200.55734197.2119.355104.65實(shí)施例8203.1924884.0415.06559103.22實(shí)施例9200.84848495.7617.9069107.67當(dāng)前第1頁(yè)12